PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE 1. Töö teoreetilised alused 1.1 Töö eesmärk Töö eesmärk oli määrata proteolüütilise ensüümi aktiivsus, kasutades substraadina kaseiini ja proteaasi preparaadina alkanaasi. Kasutasin meetodit, kus toimus tänu proteaasile peptiidsideme hüdrolüüsi reaktsioon. Et sadestada põhja kõrgmolekulaarsed ühendid kasutasin trikloroäädikhapet ning mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrasin spektrofotomeetrilisel meetodil. 1.2 Teooria Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides, produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteolüütiliste ensüümide esindajatel on erinev toimespetsiifika. Mõned lõhustavad
aktiivsuse pH-optimumist. Proteaasi aktiivsuse määramisel kasutatakse erinevaid pH piirkondi: hapud proteaasid, neutraalsed ja leelisproteaasid. Selles töö toimus uuritava proteaasi aktiivsuse määramine pH=8,4 juures. Antud töös kasutatakse ensüümi substraadina kaseiini. Ensüümireaktsioonil hüdrolüüsumata valk ja peptiidid sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisaldus määratakse spektrofotomeetriga. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks on 1 kat. See on ensüümi hulk, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 sekundi vältel 30 °C juures. Töö käik
Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsenti ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Proteaasid jagunevad seriin-, tiool-, aspartaat-, ja metalloproteaasideks. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik · Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas
(pH ~7,2) ja leelisproteaase (pH ~9,0). Aktiivtsentri ehituse järgi jaotatakse proteaasid põhiliselt seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasideks. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-
saades vabu aminohappeid. Alkalaas kuulub endopeptisaaside rühma. Alkalaasi aktiivsuse määramine toimus pH=8,4 juures (boraatpuhvri pH=8,4), mis tähendas, et tegu oli leelisproteaasiga. Substraadiks kasutati kaseiini (2%). See on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin. Proteaasi aktiivsust määratakse meetodiga, mis põhineb kaseiini hüdrolüüsil alkalaasi toimel ja järgneval TKÄ-ga (trikloroäädikhappega) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. TKÄ (5%) lisamisel peatatakse edasine hüdrolüüs ja tervikvalgud ning peptiidid,mille Mr>10 000 sadestuvad. Sademe eraldamisel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatsete tuumade sisalduse järgi, mis on spektrofotomeetiliselt hõlpsasti detekteeritavad
Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsenti ehitus ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Proteaasid jagunevad seriin-, tiool-, aspartaat-, ja metalloproteaasideks. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik · Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas
füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1 mol = 181g = 0,181 mg)
Käesolevas töös kasutati substraadina kaseiini see on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin. Proteaasi aktiivsuse hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, kui valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ning on tekkinud vaid vähesel määral vabu aminohappeid ja madalmolekulaarseid peptiide. Proteaasi aktiivsuse määramine põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ning seejärel trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Trikloroäädikhappe toimel sadenevad lahusest välja tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid (Mr > 10000), samuti inaktiveerib TKÄ ensüümi ning peatab edasise hüdrolüüsi toimumise. Sademe eraldamise järel lahusesse jäävate vabade aminohapete ja madalmolekulaarsete peptiidide kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel
trikloroäädikhappega (TKÄ), milline uhtlasi inaktiveerib ensuumi ja peatab edasise hudroluusi. Siinkasutatav aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hudroluusile uuritava proteaasi toimel ja järgnevale TKÄ - ga mittesadenevate hudroluusiproduktide sisalduse spektrofotomeetrilisele määramisele. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Phe, Trp) on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Seetõttu avaldatakse valgu hudroluusi produktide sisaldus turosiini mikromoolidena (1 mikro mol = 0,181 mg)
füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi
üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need
põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 mooli aminohapete vabanemise1 s vältel 30°C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis ongi üldlevinud, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Töö käik: Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. 1. Uuritavaks proteaasiks on alkalaas, millest ma valmistasin 5ml lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/ml. 2. Võtsin 25 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiinilahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde umbes 510 minutiks 3
füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi
Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 Pro) Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 Pro) Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 Pro) Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH 2,5), neutraalseid (pH 7,2) ja leelisproteaase (pH 9,0). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini
vältel 30°C juures. Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina reeglina kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin. Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trokloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel.
Endopeptidaasid on trüpsiin, kümotrüpsiin, pepsiin, subtilisiin, savinaas, alkalaas. Eksopeptidaaside esindajateks on karbosküpeptidaasid ja aminopeptidaasid. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH=2,5), neutraalseid (pH=7,2) ja leelisproteaase (pH=9,0). Proteaasi aktiivsuse määramine põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel
Vees see ei lahustu, küll aga lahustub selle valgu Na-sool. Aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, kui valgus on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. See tähendab, et valk on suures osas hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadenevad TKÄ toimel ning ensüüm inaktiveerub ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja peptiidid. Nende kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel: fenüülalaniin (Phe), türosiin (Tyr) ja trüptofaan (Trp). Nad omavad
Eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase. Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide ehk aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini (piima põhivalk) hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trokloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja. Lahusesse jäävad pärast filtreerimist vabad aminohapped ja madalamolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Trp, Phe) on nähtavad spektrofotomeetriliselt lainepikkustel 270-280 nm.
Optimaalse pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase. Oluline klassifikatsiooni aspekt on ka aktiivtsentri ehitus ja sellest tulenev toimemehhanism, 4 peamist rühma on: seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ning trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel, milleks kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. TKÄ toimel sadestuvad lahusest tervikvalgud ning kõrgmolekulaarsed peptiidid, sademe eraldamisel jäävad lahusesse alles aga vabad aminohapped ning madalmolekulaarsed peptiidid nende kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse algusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped nagu Tyr, Trp ja
toiduvalkude seedimises ja vere hüübimise kaskaadis. Eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid, neutraalseid ja leelisproteaase. Proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide ehk aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini (piima põhivalk) hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trokloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja. Lahusesse jäävad pärast filtreerimist vabad aminohapped ja madalamolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Trp, Phe) on nähtavad
Piimast eraldatud kaseiin ei lahustu vees, kuid hästi lahustub tema Na-sool. Proteaasi aktiivsuse hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Selles etapis sisaldab reaktsioonisegu peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja, samas ensüüm inaktiveerub. Sademe eemaldamisel jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse kaudu. Aromaatse tuumaga aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad
Kaseiin esineb piimas mitsellidena, sest omab kõrget hüdrofoobsust. Piimast eraldatud kaseiin enamjaolt vees ei lahustu. Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed ehk märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata. Trikloroäädihkappe toimel sadenevad reaktsioonisegust kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka edasise hüdrolüüsi. Pärast sademe eraldamist jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume UV-
substraadina reeglina kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin.Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na- sool (Na-kaseinaat). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja fenüülalaniin (Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad.
objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Reaktsioonisegu sisaldab siis peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis
produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina reeglina kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin (piimas mitsellidena). Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na-sool. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad
Neutraalsed ja aluselised proteaasid: - substraadina kaseiin (piima põhivalk, fosfoproteiin). Jälgitakse hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud sidemed. Sisalduvad peamiselt pika ahelaga peptiide. Valdav osa valgust on hüdrolüüsumata ning tekkinud on vaid vähesel määral proteolüüsi produkte. Proteaase aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekurlaarsed peptiidid, mille molekulmass>10000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ning peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel (nt türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan)
Neutraalsed ja aluselised proteaasid: - substraadina kaseiin (piima põhivalk, fosfoproteiin). Jälgitakse hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud sidemed. Sisalduvad peamiselt pika ahelaga peptiide. Valdav osa valgust on hüdrolüüsumata ning tekkinud on vaid vähesel määral proteolüüsi produkte. Proteaase aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekurlaarsed peptiidid, mille molekulmass>10000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ning peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel (nt türosiin, fenüülalaniin, trüptofaan)
· Valgu polüpeptiidahelas katkevad üksikud peptiidsidemed · Reaktsioonisegu sisaldab pika ahelaga peptiide · Märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata · Tekkinud on vähesel määral vabu amh-d ja madalmolekulaarseid peptiide Proteaasi aktiivsuse määramise põhineb: 1. kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel 2. TKÄ-ga mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määrmine spektrofotomeetrilisel meetodil Miks? · Tervikvalkude ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel · TKÄ inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi · Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad amh-d ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni saab kaudselt iseloomustada aromaatset tuuma
sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. 6. Skitseerige graafilised sõltuvused a) ensüümi aktiivsus-temperatuur; 25 b) ensüümi aktiivsus-keskkonna pH. 7. Millisel temperatuuril toimus proteaasi aktiivsuse määramine? Kuidas mõjutanuks tulemust temperatuuri tõus termostaadis 25 Co võrra?
hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Selles etapis sisaldab reaktsioonisegu peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sades- tuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja
annaabi.ee 
