Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Tundmatu proovi ettevalmistamine Sidruni mahl 50ml katseklaasi valan 1ml filtreeritud sidruni mahla ja lahjendan x50 korda destilleeritud
Peroksüdaas 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Tööreaktiiv: Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Töö käik 1. Uuritava lahuse ettevalmistus
POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem. · POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. · Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (mesi). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Töö reaktiivi koostis : (25 ml kolvis sisaldub) · 2,5 mg GOD · 1,5 mg POD · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 · K3[Fe(CN)6] (K-heksatsüanoferraat(II)) 0,1% lahus, mis täidab kolvi märgini. Uuritava proovi (mee lahus) ettevalmistamine: 1. Kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,11 g mett. 2
3 Töö käik Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine tundmatus proovis. Selleks kasutatakse tööreaktiivi, mis sisaldab eelpoolnimetatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD), kromatogeenset, st reaktsiooni käigus värviliseks muutuvat substraati kaalium-heksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks ka fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötamine toimub ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil, selle x-teljel on glükoosi kontsentratsioon lahuses (C, mg/ml) ja y- teljel peale reaktsiooni läbiviimist mõõdetud lahuse optiline tihedus ehk absorptsioon ( tähis D või ABS). Tööreaktiivi koostis: Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab:
Glükoosisisalduse määramisel ei tohiks bioloogilises objektis lihtsustuse mõttes olla märkimisväärselt värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat (II). 3.3.2. Töö käik TÖÖREAKTIIVI ETTEVALMISTAMINE: Tööreaktiiv peab sisaldama glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaaso (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraat (II) ja vajalikku kk-a loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Tööreaktiivi valmistamine: 1. Võta 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks vastav mõõtekolb 2. Vii sellesse 2,5 mg Gox-i 3. Lisa 1,5 mg Pox-i 4. Lisa 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 5. Lisa K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust kolvi kuni vajaliku mahuni täitmiseni. 6. Säilita külmkapi temperatuuril Minu uuritavaks lahuseks oli sidrunimahl. 7. Pressin kaaluklaasi 2-3 ml sidrunimahla 8
o Nr 4,5 ja 6 pipeteeri igasse 1ml erineva konsentratsiooniga glükoosilahust. · Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml eelnevalt valmistatud tööreaktiivi* ja loksutati · Katseklaase hoiti 20 minutit toatemperatuuril · Spetrofotomeertia põhimõttel mõõdeti optilised tihedused katseklaasides *Õppejõu poolt valmistatud 25ml tööreaktiiv koosnes: · 2,5mg glükoosi oksüdaasi · 1,5mg peroksüdaasi · 16,6ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust, millega täideti kolb kuni lõppmahuni. Optilised tihedused Korrigeeritud optilised tihedused 1. 0,048 1. 0 2. 0,059 2. 0,011 3. 0,060 3. 0,012 4. 0,146 4. 0,098 5
mesi, puuviljad või muu taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi koosnes: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH=6 K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitumist lõppmahuni Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul apelsinimahl.
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Kasutatavad ained 3 viinamarja mahl, tööreaktiiv: Glükoosi oksüdaas(GOD), peroksüdaas(POD), K4[Fe(CN)6] 0,1 % vesilahus, 0,1 M Fosfaatpuhvrit ph 6. Kemism Glükoosi lahusele lisati tööreaktiivi, kus sisalduv GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GODis sisalduv flaviinadeniindinukleotiid abil oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja vesinikperoksiidiks. Edasi katalüüsib POD kromogeense substraadi kollase veresoola oksüdeerumist. PODi toimel oksüdeerub kollases vere soolas sisalduv Fe+2 Fe+3ks., millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv punane
Esimesse katseklaasi pipteerisin 2,5 ml glükoosilahust ja 7,5 ml vett. Seejärel võtsin samast katseklaasist 5ml proovi ja lisasin 5ml vett. Kolmandasse katseklaasi võtsin 5ml teisest katseklaasist proovi ja lisasin juurde 5ml vett. Tööreaktiivi koostis: Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab: · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH= 6,0 · K-heksatsüanoferraat(II) K4(Fe(CN)6) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini. Seejärel asetasin statiivile kuus puhast katseklaasi ja nummerdasin need. Esimesse panin 1 ml destilleeritd vett ja lisasin juurde 3ml tööreaktiivi. Teise ja kolmandasse panin 1ml viinamarja lahust ja 3ml tööreaktiivi. Neljandasse, viiendasse ja kuuendasse panin 1ml erineva sisaldusega glükoosi lahust, mis
selles Fe2+ oksudatsiooni Fe3+ -ks. Millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumtsuanoferraat(III) annab lahusele kollase varvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. POD 2Fe2+ +H2O2 +2H+ 2Fe3+ +2H2O Too kaik. Tooreaktiivi koostis. 25 ml. · 2,5 mg glukoosi oksudaasi · 1,5 mg peroksudaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 · K-heksatsuanoferraat(II) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu taitmiseks kuni kaelal oleva margini. Uuritav proov. Kaalusin analuutilisel kaaludel kaaluklaasi 0,1019 g mett, viin teda kvantitatiivselt 25 ml mootekolbi. Tegin seda kuuma dest. Veega, mida lisasin vaikeste portsionitega 3 korda kaaluklaasi, klaasi sisu segasin vaikese klaaspulgaga ja tekkinud lahus valasin lahtri abil mootekolbi. Taidsin ca 1/3 kolvi mahust kuuma dest
POx katalüüsib Fe 2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, tekib kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Töö käik: 1)Tööreaktiiv oli valmis tehtud. Tööreaktiiv: 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. 2)Uuritavaks lahuseks oli sidruni vesilahus, mille lahjendus oli 1/100. 3) Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel kasutasinstandardlahust, mis sisaldas glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistatasin kolm lahut, mille kontsentratsioon oli 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Selleks võtsin kolm katseklaasi
Oma töös ma kasutasin substraadina kaaliumheksotsüanoferraati(II) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib Fe2+ Fe3+-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik Tööreaktiiv 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Sidrunimahl Mul oli sidrunimahl lahjendatud 1:50 1 ml mahla + 49 ml dest.vett Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Kaliibrimisgraafiku koostamiseks tuleb võtta kolm teatud glükoosikontsenratsiooniga proovi ja
Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures. 1 2+ + peroksüdaas 3+ 2Fe + H2O 2 + 2H 2Fe + 2H2O Töö käik Töö toimus ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi sisaldab: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritavaks prooviks oli viinamarja mahl. Marjadest pressiti välja väike kogus mahla ning tehti 250x lahjendus. Selleks võeti 0,4 ml mahla, viidi see 100 ml mõõtkolbi ning täideti kolb kriipsuni destilleeritud veega. Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A)
Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Pox-i reaktsiooni on hõlbus jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise juures on olulisel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi osüdaasi ja peroksüdaasi, , kaaliumheksatsüanoferraati(II) ning fosfaatpuhvrit (pH=6,0). Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks käesolevas töös on mee lahus, mis valmistatakse kuuma destilleritud veega, et soodustada süsivesikute lahustumist. Analüütilistel kaaludel kaalutakse 0,1 kuni 0,2 g mett ja viiakse kadudeta 100 ml mõõtekolbi. Selleks loputatakse 2-3 korda kuuma destilleritud veega kaaluklaasi ja viiakse vedelik lehtri abil samasse mõõtekolbi. Kolb täidetakse destilleeritud veega kuni kaelal oleva
O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Võib kasutada ka kaaliumheksatsüanoferraati(II), mis oksüdeerudes annab lahusele kollase värvuse (Fe2+Fe3+) ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Eelnevalt valmistatakse tööreaktiiv (25 ml): · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritava lahuse ettevalmistamine · Prooviks kasutatakse pressitud apelsinimahla · Lahuseks võetakse 0,5 ml mahla, pipeteeritakse see 200ml mõõtekolbi ja täidetakse jooneni destilleeritud veega (400x lahjendus). · Mahlalahusest eemaldatakse filtrimise teel viljaliha. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. Koostatakse
Meie juhul aga kasutame kaaliumheksatsüaanoferraati(II), K4{Fe(CN)6}. (kollane veresool). 2 Fe2+ + H2O2 + 2H+ 2Fe3+ + 2H2O kollane veresool punane veresool Punane veresool annab lahusele kollase värvuse. Detekteeritav lainepikkus 410 nm. Sobiv keskkonna pH on 6. Töö käik. 1) Tööreaktiivi valmistamine (25 ml): (tööreaktiv on vajalik glükoosisisalduse määramiseks). - 2,5mg glükoosi oksüdaasi - 1,5 mg püroksüdaasi - 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0 - K4{Fe(CN)6} 0,1-list lahustkoguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks lõppmahuni. 2) Uuritava lahuse ettevalmistamine. Uuritavaks lahuseks kasutame mandariinimahle lahuse. Võtame 2-3ml mahla ja lahjendame (1:100) 3) Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. - Glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses kindlaks teha, tuleb aluseks koostada koliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga
vesinikperoksiidi redutseerumine veeks. Tekib kaaliumheksatsüanoferraat (III) (see on punane veresool), mis annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Minu konkreetne tööülesanne oli glükoosisisalduse määramine sidrunimahlas, POx substraadina kasutasime kaaliumheksatsüanoferraati (II). Töö käik Tööreaktiiv Tööreaktiiv sisaldas 2,5 mg GOx, 1,5 mg POx, 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 ning ülejäänud 0,1% kaaliumheksatsüanoferraati (II), et täita 25 ml mõõtekolb. Mina töötasin juba ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl. Pigistasin sidrunist välja väikese koguse mahla, juhendajalt sain juhised lahuse lahjendusmäära osas: tuli võtta 1ml sidrunimahla 25 ml lahuse jaoks. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
POD on samuti liitvalk (kromoproteiin), prosteetiliseks rühmaks on heem. POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). H2O2 toimib vesiniku aktseptorina, redutsseruks H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetril. Töö käik: Määran glükoosisisaldust tundmatus proovis (greibimahl). Kasutan tööreaktiivi, mis sisaldab ensüüme GOD ja POD, kromogeenset substraati K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks:
värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures. Peroksüdaas 2+ 2 Fe + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik: Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötan ettevalmistatud reaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Tundmatuks prooviks on naturaalne apelsiinimahl. Pressin apelsiinist umbes 5 ml mahla, mida pärast vajalikul määral lahjendan. (1/200 ml). Selleks valan 200 ml-lise katseklaasi 1 ml apelsiinimahla ja lisan kriipsuni vett. Glükoosilahuste valmistamine Kindlakontsetratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standart- lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml.
Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb PO x-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 2 Fe2+ +H2O2 + 2H+ 2 Fe 3+ +2 H2O Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on olulisene koht tööreaktiivil, mis sisaldab Gox, Pox, kaaliumheksatsüanoferraati (II) ja fosfaatpuhvrit pH 6. Tööreaktiiv oli valmistatud praktikumi juhendaja poolt. Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Minu uuritavaks lahuseks oli mesi, mida ma kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,1199 g ning viisin selle kvantitatiivselt 200 ml mahuga mõõtekolbi. Selleks kuumutasin destilleeritud vett ning lisasin väikeses koguses vett kaaluklaasi, segasin lahust klaaspuga ning valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtkolbi. Seda kordasin veel 3 korda. Järgnevalt täitsin
Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0; K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini. Uuritav proov on mee lahus. Mee lahus valmistatakse kuuma destilleeritud veega, et soodustada suhkrute ja mees sisalduvate kõrgmolekulaarsete süsivesikute lahustumist. Läbisegatud mee proovist kaaluti analüütilistel kaaludel 0,15 g mett. Kaalukausis olev meeproov viidi kadudeta 250 ml mahuga mõõtekolbi
mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Katse käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul sidrunimahl. Sidrunimahlast tuli valmistada 25-kordne lahjendus. Selleks pipeteerisin gradueeritud katseklaasi 1 mL sidrunimahla ja ülejäänud 24 mL täitsin destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
lihtsustamise eesmärgil ei sisalda palju värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüanoferraat(II). Tööreaktiiv Keskses rollis glükoosisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit, mille pH on 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil oli tööreaktiiv ette valmistatud. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks lahuseks, mille glükoosisisaldust määrasin, oli apelsinimahl. Mahla pressisin apelsini lõigust välja. Võtsin saadud kogusest 1,5 ml, mille lahjendasin 200 ml destilleeritud veega. Osa saadud lahusest filtrisin, et vabaneda puuviljatükkidest. Glükoosilahuste valmistamine kaliibirimisgraafiku koostamiseks
seda kõrgem on tema optiline tihedus ja seetõttu ka glükoosi sisaldus. Antud töös on substraadina kasutusel kaaliumheksatsüanoferraat(II) K 4[Fe(CN)6] ehk ajaloolise nimetusega kollane veresol. Tekkiv punane veresool K 3[Fe(CN)6] annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv Juba valmisolev tööreaktiiv sisaldab ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraati K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi GOx 1,5 mg peroksüdaasi POx 16,6 ml 0,2 M puhverlahust K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust, et täita kolb lõppmahuni. Tööreaktiivi tuleb säilitada külmkapi temperatuuril kuni tarvitamiseni. Meie reaktiiv oli juba laual valmis, kuna enne kasutamist pidi see taas soojenema toatemperatuurini. Meloni lahuse ettevalmistamine
2Fe2+ + H2O2 + 2H+ → 2Fe3+ + 2H2O Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, antud juhul sidrunis. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraati(ll). TÖÖ KÄIK Tööreaktiiv Antud töös on kasutusel 25 ml-ne tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi oksüdaasi (GOx) (2,5 mg) ja peroksüdaasi (POx) (1,5 mg), reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit (pH=6,0) (16,6 ml) ja kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) (lisatakse kuni lõppmahuni). Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Tööreaktiiv säilitatakse külmkapi temperatuuril. Uuritava lahuse ettevalmistamine Antud töös määrasin sidruni glükoosisisaldust. Selleks pressisin sidrunist natuke mahla välja
Cst Vst = Clahj Vlahj , kus Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud 28 lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. 6. Milline on töös kasutatava tööreaktiivi koostis? 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. 7. Milline roll on K4Fe(CN)6 tööreaktiivis? Kas ja millega võinuks teda asendada? Võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] (kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III),
kaaliumheksatsüanoferraat(ll). 87 Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Kuna ensüümid võivad tööreaktiivi pikemaajalisel säilitamisel aktiivsust kaotada, siis tuleb tööreaktiivi valmistada väikeste portsjonite (25 või 50 ml) kaupa vahetult enne praktikumi. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi;
füsioloogilises lahuses, hõõrudes tampooni vastu üla- või alalau sisepinda, et saada võimalikult rohkem nakatatud rakke. • Rooja umbes herneterasuurune tükike transpordiks mõeldud plastiktopsi. Kui transport ei ole võimalik samal päeval, säilitada uuritav materjal +4oC juures külmkapis ja saata järgmisel päeval laborisse. Transportlahused: • isotoonilised soolalahused (Hanks’i lahus, fosfaatpuhvrit sisaldav Dulbecco A soolalahus, trüptoosfosfaatpuljong); • valku sisaldavad materjalid (albumiini, želatiini 2–5% lahused); • lahuses on üks või mitu antibiootikumi (penitsilliin, streptomütsiin, nüstatiin, gentamütsiin), et hävitada bakterid uuritavas materjalis • sisaldavad indikaatorit (fenoolpunane – pH hindamiseks). 75 Materjal Võtmise meetod Transport
annaabi.ee 
