Faagiteraapia (1)

FAAGITERAAPIA
Sissejuhatus
Populaarseimad ravimid tänapäeval bakterhaiguste ravimiseks on antibiootikumid . Kuna neid kasutatakse nii laialdaselt, on üha suuremaks probleemiks kujunenud patogeensetel bakteritel tekkinud antibiootikumide resistentsus. Seetõttu on hakatud otsima asendusi antibiootikumiravile ning üheks asenduseks on pakutud välja ka faagiteraapia. See kujutab endast erinevate bakteriofaagide või nende produktide kasutamist bakterhaiguste ravimiseks. Kuigi katsed faagidega on olnud edukad ning on avastatud palju eeliseid antibiootikumide ees, ei taheta faagiteraapiat tänapäeva meditsiinis veel rakendada. Kardetakse , et faagidest ja nende ohutusest ei teata veel piisavalt ning rahvas ei pruugi veel aktsepteerida geneetiliselt modifitseeritud viiruseosakeste kasutamist meditsiinis (Nobrega et al., 2015).
Bakteriofaagide avastamise ajalugu ja kasutamine tänapäeval
1896. aastal avastas Briti bakterioloog Ernest Hankin Indias Gangese ja Jumna jõgedest tundmatu antibakteriaalse ühendi, mis kahandas bakterite Vibrio cholerae hulka jõevees ning mis võis olla vastutav sealse koolera epideemia vähenemise eest. Sarnast fenomeni märkas kaks aastat hiljem ka Venemaa bakterioloog Gamaleya, kui ta töötas Bacillus subtilis’ega. Mõlemad mehed pidasid seda lihtsalt looduslikuks nähtuseks. Alles 1915. aastal pakkus bakterioloog Frederick Twort välja erinevaid hüpoteese, mis sellist fenomeni võis põhjustada, sealhulgas pakkus ta välja üheks põhjustajaks ka viiruse. Kahjuks jäi finantsiliste probleemide tõttu tema edasine uurimine poolikuks. Kaks aastat hiljem avastas „ametlikult“ bakteriofaagid hoopis Prantsuse-Kanada mikrobioloog Felix d’Herelle. d’Herelle alustas faagide uurimist juba 1910 . aastal, kui tal tuli ravida Mehhikos haigeks jäänud sõdureid. Ta valmistas haigete väljaheidetest filtreeritud bakterivabad proovid, segas need patsientidest isoleeritud bakteri Shigella tüvedega ning pani segu agari plaadile kasvama. Mõne aja möödudes võis plaadil näha selgeid lüüsilaike. Edasisel uurimisel veendus d’Herell, et sellise nähtuse põhjuseks on viirused, mis nakatavad baktereid. Ta hakkas nimetama sellised viiruseid „bakteriofaagideks“, tuletades selle kreeka keelsetest sõnadest bakterion ja phagein (Sulakvelidze et al., 2001). Bakterion tähendab väikest pulgakest ja phagein sööma või alla neelama (Onions et al., 1966).
Bakteriofaagide avastamine aitas palju kaasa mitmete teadusvaldkondade arengule, eriti mikrobioloogia ja bakterite geneetika arengule. Kuigi oli tõestatud, et faagidel on antimikroobne toime, ei muutunud nende kasutamine meditsiinis bakterite põhjustatud haiguste ravimisel eriti populaarseks. Põhjuseks võib olla see, et sel ajal ei teatud väga palju faagide bioloogiast. Kui 1940. aastatel avastati antibiootikumid, mis olid üsnagi efektiivsed bakteriaalsete haiguste ravimisel, jäi bakteriofaagide edasine uurimine veelgi rohkem tagaplaanile. Tänapäeval on üha enam leviva antibiootikumide resistentsuse tõttu hakatud otsima teisi vahendeid bakteriaalsete haiguste ravimiseks. Seepärast on faagide uurimine ja kasutamine meditsiinis jälle päevakorda tõusnud. Ida-Euroopa riikides on faagiteraapia olnud edukas. Lääne riikides seevastu ei taheta faagiteraapiat meditsiinis rakendada, kuna puuduvad piisavad teadmised ja oskused faagide modifitseerimiseks, et faagiteraapia paindlik ja edukas oleks. Samuti ei ole tehtud piisavalt in vivo katseid, et olla kindlad faagi produktide ohutuses. Nendel põhjustel ei taha ka suured ravimifirmad investeerida oma raha faagiteraapia edendamiseks (Nobrega et al., 2015).
Bakteriofaagid vs antibiootikumid
Faagide peamine eelis on kõrge spetsiifilisus. Nad tunnevad ära kindlaid bakteritüvesid, samal ajal kui antibiootikumid mõjuvad paljudele bakteritele, nii halbadele kui ka headele korraga. Faagide kasutamine bakteriaalsete haiguste ravimisel vähendab normaalse mikrofloora kahjustusi. Seevastu on faagide kasutamisel vajalik sihtmärk patogeeni tuvastamine ja efektiivse faagi valimine. Seega võib faagiteraapia võtta mõnevõrra kauem aega kui antibiootikumidega ravimine (Nobrega et al., 2015).
Erinevalt antibiootikumidest, kutsuvad faagid väiksema tõenäosusega esile resistentsust. Seetõttu on faagiteraapia kasutusele võtt efektiivne lahendus biofilmi tekkele ja bakterite multiresitsentsusele. Siiski ei ole faagiresistentsuse tekkimine täielikult välistatud. Bakterid võivad muutuda faagiresistentseteks näiteks siis, kui neil tekivad mutatsioonid vastavates retseptorites, millega faag kinnitub bakteriraku pinnale. Võib ka juhtuda, et need retseptorid kaovad mutatsioonide toimel täielikult ära. Faagiresistentsus võib tekkida ka siis, kui bakter omandab restriktsiooni-modifikatsiooni süsteemi või kui bakteris tekib CRISPR järjestuste blokeerimisel adaptiivne immuunsus . Mõlemal juhul omandab bakter võime lagundada sisse tunginud faagi DNA-d (Nobrega et al., 2015). Siiski ei ole faagiresistentsus nii ulatuslik kui antibiootikumide resistentsus. Faagid üldiselt ei ületa liikide vahelisi piire ning kuna faagid mõjuvad spetsiifiliselt üksikutele bakteritüvedele, siis tekib faagiresistentsus vaid üksikul tüvel, mitte tervel liigil või sugukonnal (Carlton, 1999).
Antibiootikum on ravim , mis peale manustamist järk-järgult laguneb organismis. Seevastu bakteriofaagid liiguvad kõigepealt infektsioonisaiti ning hakkavad seal kiirelt replitseeruma. Kuna antibiootikume juurde patsiendis ei teki, peab neid regulaarselt manustama iga teatud aja tagant. Peale manustamist hakkab antibiootikumide kontsentratsioon patsiendis järk-järgult langema ning tõuseb alles peale uue annuse andmist. Selline vahepealne ravimi langus annab bakteritele võimaluse aktiveerida resistentsuse geenid , et paremini vastu pidada järgmisele antibiootikumide doosile. Kuid kuna faagide hulk ei lange peale manustamist patsiendis, siis ei anta bakteritele ka võimalust aktiveerida vastavaid resistentsuse geene. Lisaks kulub faage palju vähem bakterhaiguste ravimiseks kui antibiootikume, seda tänu nende iseseisvale ja kiirele replitseerumisele patsiendis (Carlton, 1999). Probleemiks on aga see, et faagide levik sõltub peremeesorganismist, nad replitseeruvad ainult infektsioonisaidis ning sihtmärk patogeeni puudumisel ei jää nad organismi püsima (Nobrega et al., 2015).
Antibiootikum on kindla koostisega ja muutumatu keemiline ühend ning seetõttu ei suuda ta kohaneda bakterites toimuvate mutatsioonidega. Kui bakter on muutunud resistentseks mõne antibiootikumi suhtes, siis jäävad tekkinud resistentsuse geenid püsima bakterirakku ning neid geene võidakse edasi anda ka teistele nii sama kui võõra liigi bakteritele. Faagid on aga „elusad“ organismid, mis on võimelised evolutsioneeruma. Kui mõnes bakteris tekib resistentsus mõne kindla faagi suhtes, siis võivad toimuda selles faagis mutatsioonid, mis võimaldavad ületada tekkinud resistentsuse barjääre. Näiteks kui tekivad mutatsioonid bakterite endonukleaasides, mille tõttu lagundatakse bakterisse sattunud faagi DNA, siis võivad faagis vastukaaluks tekkida mutatsioonid DNA-s, mille tõttu ei ole enam bakterite endonukleaasid võimelised degradeerima faagi DNA-d (Carlton, 1999).
Uute faagisüsteemide arendamine on palju odavam kui uute antibiootikumide välja töötamine ning erinevalt antibiootikumidest, ei mõjuta faagid ning nende produktid eukarüootseid rakke. Seega kõrvalmõjusid esineb faagiteraapias vähem kui antibiootikumidega ravimisel (Matsuzaki, 2005).
Bakteriofaagide genoomide modifitseerimine
Bakteriofaagide antimikroobsete omaduste võimendamiseks on välja töötatud erinevaid tehnikaid. Hiljuti loodi uus in vivo tehnika: bakteriofaagi elektroporeeritud DNA rekombineerimine ehk BRED (bacteriophage recombineering of electroporated DNA). BRED töötati välja Mycobacterium’i faagide jaoks, kuid seda saab rakendada ka teiste faagide peal. BRED-i puhul viiakse elektroporatsiooni abil faagi DNA bakteriraku sisse ning plasmiidis olevad rekombinatsiooni geenid üleekspresseeritakse, et tõsta homoloogilise rekombinatsiooni sagedust faagi DNA ja sihtmärk DNA vahel. BRED-i läbiviimiseks kasutatakse enamasti faag λ-t või Rac profaagi. Lisaks elektroporatsioonile kasutatakse ka keemilist transformatsiooni . Selle eeliseks on DNA ülekandel väiksemate pooride teke rakumembraani (Nobrega et al., 2015).
Kõige enam üritatakse geneetiliste modifikatsioonide abil suurendada faagide peremeesringi (Nobrega et al., 2015). Näiteks on T7 faagi genoomi disainitud nii, et ta hakkaks tootma endosialidaase. Endosialidaasid on ensüümid , mis on võimelised K1 kapsleid lagundama ning seeläbi on faagid võimelised efektiivsemalt sisenema bakterirakku. K1 kapsel on mõningatel E.coli tüvedel esinev polüsahhariidne kapsel, mis tõstab bakterite vastupanuvõimet fagotsütoosi ja inaktivatsiooni suhtes. Kui enne oli K1 kapsel barjääriks T7 faagile, siis nüüd on modifitseeritud faag võimeline sellistesse rakkudesse sisse tungima (Scholl et al., 2005).
Bakterite massilisel hävitamisel in vivo on oht, et bakteris olevad toksiinid pääsevad rakust välja, hakkavad kuhjuma organismi ning põhjustavad seal põletikke. Selle vältimiseks on üritatud geneetiliselt muuta faage nii, et nad ei hakkaks kiirelt replitseeruma infektsioonisaiti jõudes ning ei lüüsiks liiga kiirelt rakke. Selleks on faagi genoomidest välja lõigatud eksportvalke kodeerivaid geene või sisestatud restriktaase ja holineid ekspresseerivaid geene (Nobrega et al., 2015). Holinid on väikesed membraanivalgud, mis akumuleeruvad rakumembraanis. Nende geenidesse on programmeeritud täpne aeg, millal nad muudavad rakumembraani läbitavaks endolüsiinidele. Endolüsiinide toimel toimub mureiini lagundamine ning selle tagajärjel rakk lüüsub. Seega holinite abil on võimalik infektsiooni aega pikendada ning vältida bakterirakkude massilist lüüsumist ( Wang et al., 2000).
Faage jaotatakse kahte gruppi, sõltuvalt nende elutsüklitest peale bakterirakku sisenemist. Ühel juhul integreeritakse faagi genoom bakteri genoomi, kuhu ta jääb püsima ning iga rakujagunemisega paljundatakse ka faagi genoomi, ilma et peremeesrakk hävineks. Sellist tsüklit nimetatakse lüsogeenseks tsükliks. Teisel juhul hakkavad faagid bakteris kiirelt paljunema, kasutades ära peremeesraku ressursse, kuni lõpuks bakteri rakumembraan lüüsitakse ning faagipartiklid pääsevad ekstratsellulaarsesse ruumi (Matsuzaki et al., 2005). Et ka lüsogeensed faagid põhjustaksid bakteriraku lüüsumist, on neid geneetiliselt muudetud. Neisse faagidesse on viidud geenid, mis kodeerivad erinevaid antibakteriaalseid ühendeid ning need aktiveeritakse pärast peremeesrakku sisenemist. Toodetud produktide mõjul bakter lüüsub. Tänu sellisele modifitseerimisele saab kasutada edukalt ka lüsogeenseid faage bakterhaiguste ravimisel (Nobrega et al., 2015).
Lisaks on faage kujundatud ka nii, et nad tõhustaksid antibiootikumide antibakteriaalset toimet. Selleks on faagides üleekspresseeritud geenid, mis kodeerivad metsiktüüpi ja antibiootikumiresistentsete bakteritüvede kaitsebarjääre nõrgestavaid valke (Nobrega et al., 2015).
Katsetused inimeste peal
Poolas on faagiteraapiat katsetatud inimeste peal alates 1980. aastate keskpaigast, kuid katseid on tehtud väga väikeses ulatuses. Eestvedajateks on olnud professor S. Slopek ja tema kolleegid. Katsealusteks on olnud patsiendid , kellel enamasti on kroonilised bakteriaalsed infektsioonid ning muud ravimid ei ole suutnud nende olukordi leevendada. Siiani on olnud katsealuseid umbes 1300 ning tänu faagiteraapiale on suudetud terveks ravida ligi 86% katsealustest. Terveks peeti neid, kellel oli näha märgatavat mädaerituse taandumist infektsioonisaidis või haavade kinni kasvamist. Faage manustati patsientidele suukaudselt. Enne faagide organismi viimist anti katsealustele maohappesuse regulaatoreid, et tõsta pH-d maos. See oli vajalik selleks, et faage kaitsta liigse happesuse eest ning kindlustada nende jõudmine infektsioonisaiti (Carlton, 1999). Kuigi katsed olid edukad, heideti professor Slopek’ile ja tema kolleegidele ette platseebo kontrollide tegemata jätmist. Platseebo kontrollid kujutavad endast nö „valeravimi“ manustamist patsientidele, ilma et nad ise teadlikud sellest oleksid. „Valeravimil“ endal ei ole mingit mõju uuritava haiguse ravimisel, kuid kui see peaks töötama sama efektiivselt kui uuritav ravim, siis see näitab, et oletatav ravim ei anna oodatud efekti. Samuti kujunes probleemiks see, et kõiki katseid ei kirjeldatud piisavalt detailselt ning aeg-ajalt kasutati paralleelselt faagidele ka antibiootikume (Abedon et al., 2011).
Venemaal on tehtud faagiteraapia edendamiseks palju katseid inimeste peal. Näiteks Nõukogude Liidus oli 1970. aastatel peamine prioriteet düsenteeria ravimine. Üheks meetodiks selle ravimiseks oli faagiteraapia. Faage sai manustada vedelikuna, tablettidena, kreemidena, aerosoolidena, süstimisega ja isegi tampoonidega. Faage toodeti suurtes kogustes, kuid kuna seda tehti saladuskatte all, siis puuduvad kindlad tõendid faagiteraapia efektiivsuse kinnitamiseks (Abedon et al., 2011).
Kasutatud kirjandus
Abedon, S. T., Kuhl, S. J., Blasdel, B. G., Kutter , E. M. 2011. Phage treatment of human infections. J. Bacteriophage. 1(2): 66–85.
Carlton, M. R. 1999. Phage therapy : past history and future prospects. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 47: 267-274.
Matsuzaki, S., Rashel, M., Uchiyama, J., Sakurai, S., Uijhara, T., Kurado, M., Ikeuchi, M., Tani, T., Fujieda, M., Wakiguchi, H., Imai , S. 2005. Bacteriophage therapy: revitalized therapy against bacterial infectious diseases. J. Infect Chemother 11: 211- 219.
Nobrega, F. L., Costa, A. R., Kluskens, L. D., Azeredo, J. R. 2015. Revisiting phage therapy: new applications for old resources. Trends in Microbiology TIMI- 1165 (article in press).
Onions, C. T., Friedrichsen, G. W. S., Burchfield, R. W. 1966. The Oxford Dictionary of English Etymology.
Scholl, D., Adhya, S., Merril, C. 2005. Escherichia coli K1's Capsule Is a Barrier to Bacteriophage T7. Appl Environ Microbiol. 71(8): 4872–4874.
Sulakvelidze, A., Alavidze, Z., Morris , J. G. 2001. Bacteriophage Therapy. Antimicrob Agents Chemother 45(3): 649-659.
Wang, I. N., Smith, D. L., Young, R. 2000. Holins: the protein clocks of bacteriophage infections. Annu Rev Microbiol. 54:799-825.