Geenitehnoloogia meetodid Geenitehnoloogia: Seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Geenitehnoloogia saavutusi rakendatakse: Põllumajanduses Toiduainete tootmises Inimeste mitmete omaduste muutmises Loomade mitmete omaduste muutmises Haiguste diagnoosimises ja ravis Transgeensed organismid Tehnogeneetiliselt muundatud organismid Transgeensed mikroorganismid Transgeensed loomad Transgeensed taimed Tehnogeneetiliselt muundatud organismid Organismid, kelle genoomi on siirdatud mõne võõrliigi geene.
DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus.
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2013 a) Nimi: YAGB41 Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal.
4.See oli hiir, kellel oli kasvuhormoon rotilt. Sündis 1981.aastal. 6. Geenivektor on DNA või RNA konstrukt, milles see geeni, mida tahetakse siirata, on ühendatud teiste, normaalsete geenidega. Sellepärast suudab see tungida siirdamiseks kasutatava organismi rakku ning lõimuda seal oleva DNA-ga, nii et rakus tekib inimesele vajalik DNA konstrukt. Kuidas tehakse: a) Bakterist võetakse plasmiid välja (see on rõngasjas kromosoom). Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga.
Geenitehnoloogia valitud Geenitehnoloogia valitud DNA DNA lõikude eraldamine, lõikude eraldamine, töötlemine in töötlemine in vitro ja vitro ja siirdamine sama või muu siirdamine sama või muu liigi liigi isendi geneetilisse struktuuri- isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või kromosoomi, plasmiidi või viirusesse(geenide ülekanne). viirusesse(geenide ülekanne). Rekombinantne DNA DNA Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud molekul, milles on ühendatud eri eri liikidelt pärit DNA osad. liikidelt pärit DNA osad. Rakkudesse viiakse võõraid Rakkudesse viiakse võõraid geene viirusvektori abil,
Rakuline DNA kloonimine ehk in vivo kloonimine. Meetod põhineb spetsiifilise DNA fragmendi in vitro sisestamisel iseseisvalt replitseeruvasse DNA järjestusse. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro-geeni fragment sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi 2. Transformatsioon- selle tulemusena saadakse uus rekombinantneDNA molekul, mis on võimeline sisenema(näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA replikatsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või plasmiidi replikatsioonil tekib rohkem kui 10
Molekulaarbioloogia I praktikumi töö (2012 a) Nimi: Inimese genoomi CpG "saarekestel" paiknevate geenide kloneerimine (genoomse DNA restriktsioon Cfr42I (SacII) abil, fragmentide kloneerimine pBS SK+ plasmiidi, E.coli transformatsioon, rekombinantse klooni eraldamine, restriktsioon-analüüs, PCR, sekveneerimine, bioinformaatiline analüüs) Imetajate genoomides on mitmed geenid koondunud nn. CpG saarekestele (CpG islands). CpG saareke on vähemalt 200 bp pikkune DNA lõik, milles on dinukleotiidi GC sisaldus vähemalt 50 %. Tavaliselt leidub CpG saarekesi (eriti koduhoidja-)geenide transkriptisooni alguspunktides või nende lähedal.
eemaldatud. Seejärel siirdati embrüorakk emalambale. 6.Geenivektor on DNA või RNA konstrukt, milles see geen, mida tahetakse siirata, on ühendatud teiste, normaalsete geenidega. Sellepärast suudab see tungida siirdamiseks kasutatava organismi rakku ning lõimuda seal oleva DNA-ga, nii et rakus tekib inimesele vajalik DNA konstrukt. Kuidas tehakse: a) Bakterist võetakse plasmiid välja (see on rõngasjas kromosoom). Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga.
haigused (geeniteraapia) * täiustada tehnoloogiat, et luua inimesele kasulikke GMO-sid Meetodid: * geenide rekombinatsioon plasmiidsete vektoritega * geenide rekombinatsioon viirusvektoritega * DNA, RNA analüüsi meetodid: PCR, sekveneerimine, geel elektroforees Plasmiidid geenide vektorid Looduses kanduvad üle ühest bakterist teise geenide horisontaalne ülekanne Kui võõrad geenid plasmiidi DNA-sse sisestada lähevad üle teise bakterisse koos plasmiidiga Inimese kasvuhormooni geen GH1 (growth hormone) E. coli plasmiidi Kui GH1 muteerunud, ei tooda hüpofüüs kasvuhormooni kasv peatub lapseeas täiskasvanul kääbuskasv Kasvuhormoon: 191 AH valk AH järjestus teada, geeni GH1 nukleotiidne järjestus mitte Kasvuhormooni geeni kloneerimine Plasmiidid paljunevad rakus paljundavad ka inimese geeni
5 l, 1 l ja 0,5 l. Lisaks lisasin juhendist erinevalt ühte auku 20 l, ning pipeteerisin uue puhta broomfenoolsinise kuuendasse auku. Tulemuseks oli küllaltki sujuv värvirida. Blotipaberile oma nime ja mustrit pipeteerides jälgisin, et pipett ei läheks liiga sügavale lahusesse, et pipett oleks otse ning pipeteerimine toimuks sujuvalt, et kogused oleks võimalikult täpsed ning täpid tuleksid ühtlased. 1. Polümeraasi ahelreaktsiooni teostamine a) Paljundamiseks sain plasmiidi pEGFP-FoxO3a-wt, praimeritest kasutasin: · EGFP-3-s-170-F (5'-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3') · SV40p-R (5'-GAAATTTGTGATGCTATTGC-3') Praimerid on valitud selliselt, et nad ei moodustaks omavahel dimeere (ehk ei oleks omavahel komplementaarsed) ning oleksid komplementaarsed lõiguga paljundataval DNA-l, millega praimerid seonduvad ning kust algab replikatsioon. b) Kasutatud PCR-i programm: 1. 95 o C 15 minutit ensüümi (polümeraasi) aktiveerimiseks 2
Kasvajad tekivad juurtel, okstel ja tüvel. · Kasvajad takistavad vee- ja toitainete liikumist taimes. Taimed kääbustuvad ja on väheviljakad. · Algul on kasvaja pehme, soolatüükataoline, hiljem aga puitub. · Agrobacterium tumefaciensi poolt põhjustatud kasvaja õunapuu oksal · Agrobacteriumi kasutatakse taimede insenergeneetikas uute geenide sisseviimiseks taimegenoomi. Lisatavad geenid lülitatakse bakteris replitseeruvasse Ti plasmiidi. · Selle tehnoloogiaga on saadud näiteks herbitsiidide suhtes resistentseid taimi. · Herbitsiid "Roundup", mille toimeaine on glüfosaat, mis ihibeerib aromaatsete aminohapete sünteesi taimedes, nii kultuurtaimedes kui ka umbrohtudes. · Seda herbitsiidi kasutatakse nn musta maa tegemiseks enne külvi. · tumefaciensi ja mitmete teiste bakterite vastav ensüüm on aga glüfosaadile tundetu.
Valasime lahus geelialusele ning jätsime tarduma järgmise praktikumini. 2. päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse). DNA lahutamine toimub elektrivoolu toimel (100 V 15 min) 25. 26. 27. 28. 29. 30. Kuna minu produkt ei ole üldse geelipildil nähtav, võin järeldada, et midagi tegin valesti PCR reaktsiooni teostamisel (nt. viga pipeteerimisel või mingi muu viga). Sain geelitükki teiste plasmiidi ja praimeritega. 31. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 32. 33.PCR produkti puhastamine geelist Zymoclean kitiga. 34. Eesmärgiks on puhastada välja PCRi segust meid huvitav produkt, et vältida praimerite, nukleotiidide või erinevate soolade mõju järgmisele etapile. 35. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 36. Puhastamine: 1. Saadud geelitükk kaalus 0,04 g
DNA suurus 50bp kuni 23kb Sobivad proovid DNA TAE/TBE puhvriga agaroosgeelist DNA puhtus Kõrge kvaliteedi, puhtusega DNA, mis on sobilik sekveneerimiseks, ligatsioonireaktsiooniks jne... Kui palju DNA saadakse 50bp-10kb puhul 70-90% Praktiline töö nr. 5: Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Eesmärk: Meid huvitava aplifitseeritud DNA järjestuse sisestamine vahevektorisse ehk paljundusplasmiidi. Materjalid: 1,25 µl pSTBlue-1 vektor Lineaarne vahevektor, kus on origin, (16ng/µl) antibiootikumide resistentsusgeen, lacZ üksus ja AccepTor kloneerimissait. 3,75 µl PCR produkt Sisaldab inserti 1 µl 10X ligeerimispuhvrit Loob sobiva keskkonna
tehtud õigesti ja saab topsis jäänud DNA-ga töötada jätkata. 4. Praktikum – Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Selleks, et meid huvitava amplifitseeritud DNA paljuneda, on vaja teda sisestada vahuvektorisse(plasmiidi). Selleks on vaja kokku ligeerida meie järjestus (L-Desmo) ja pSTBlue-1 vektor. Selle praktikumi käigus kasutasimi vektorit, mis oli enne lõigatud niimodi, et kleepuvad osted sisaldasid T-otsad. Taq polümeraas ei oma eksonukleaarset aktiivsust, sellega suure tõenäosusega lisab iga PCR produkti sabale lisa A-nukleotiidi. Sellega meil on
RETSIPIENT ehk DNA VASTUVÕTJA. Üleantavat DNA-d nim endogenoodiks. o Doonor – bakter, kes väljastab geneetilist materjali DNA või RNA näol o Retsipient – bakter, kes võtab väljastatud geneetilise materjali vastu 20. Plasmiidse DNA piirkonnad Plasmiid kujutab endast kaheahelalist DNA rõngasmolekuli, mis replitseerub bakteri genoomist sõltumatult. Plasmiidid esinevad peaagu kõigis bakterites, seejuures võib ühes rakus olla mitu erinevat plasmiidi. Plasmiidi DNA koosneb funktsionaalselt 2-3 piirkonnast; - Plasmiidi replikatsiooni eest vastutavad geenid - Plasmiidi ülekannet teistesse bakteritesse determineerivad geenid (võivad ka puududa) - Struktuurgeenid määravad ära plasmiidi poolt determineeritavad bakteri omadused Determinatsioon – tingimine; põhjustamine 21. Ravimiresistentsuse geenide ülekanne plasmiidilt plasmiidile, plasmiidilt genoomile on võimalik tänu R faktorile, kuna kõik ravimiresistentsust
Transgeensed taimed Triinu Orgmets 9. A Transgeensed taimed · Organisme, kellele on viidud võõraid geene nimetatakse transgeenideks. · Esimene transgeenne organism tehti 1973. aastal. Organism loodi sisestades antibiootikumile resistentseid geene E. coli bakteri plasmiidi. Milleks vaja? · Suurem saagikus · Pikem säilivus · Tarbekvaliteedi parandamine · Suurem külma ja kuiva taluvus · Suurem vastupidavus parasiitide vastu Olemus · - geen-ehk rikutakse kindla geeni struktuur · + geen-ehk siirdatakse genoomi võõrliigi geene Põllumajanduses · Geneetiliselt muundatud põllukultuuride loomine on väga kallis ning see on jõukohane suurtele firmadele. · Väiksem mürkide kasutamine põldudel. Levik
(geeni osi) ühest organismist teise või muudetakse muul viisil geene saadakse GMO . 17.Geenivektor - DNA või RNA konstrukt, milles see geeni, mida tahetakse siirata, on ühendatud teiste, normaalsete geenidega. Sellepärast suudab see tungida siirdamiseks kasutatava organismi rakku ning lõimuda seal oleva DNA-ga, nii et rakus tekib inimesele vajalik DNA konstrukt. Kuidas tsaadakse: a) Bakterist võetakse plasmiid välja (see on rõngasjas kromosoom). Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse
rakumembraanid.. Protsess lõpeb raku keskele vaheseina tekkimisega, mille tulemusena moodustuvad kaks uut tütarrakku. Need võivad jääda üksteisega veel mõneks ajaks seotuks, moodustades erineva pikkusega ahelaid Koos tsütoplasma jagunemisega kaheks jaotuvad selles paiknevad rakuorganellid tütarrakkude vahel. Moodustunud tütarrakud on geneetiliselt samased lähterakuga. Pooldumisprotsessidega samaaegselt toimub kromosoomi ja plasmiidi replikatsioon nii, et tütarrakus on esialgse raku genoomi duplikaat. Enne jagunemist rakk toitub, rakuorganellide arvukus suureneb ning bakter varustab end ATP ja teiste makroergiliste ühenditega. Soodsatel tingimustel paljunevad bakterid ülikiiresti (iga 20-30 minuti järel). Nii võib lühikese aja, st ööpäeva jooksul ühest bakterist saada 16,5 miljonit uut bakterit. Seda vôime täheldada näiteks mahla vôi mône muu joogi käärimisel.
Tulemusena moodustub üheahelaline DNA. Nukleaas S1: Lõhustab üheahelalist DNA ja RNA, moodustades 5´fosforüülitud mono- ja oligonukleotiide. 5. Millised omadused peavad olema plasmiididl, et ta saaks toimida kui kloonimise vektor? Antibiootikume resistentsust kodeeriv geen (ampitsiliin või tetratsükliin Väike suurus Kloonimise site (MCS), koht kuhu viiakse järjestuse sisse (plasmiidi ala) Sisene inaktivatsioon (insertional inactivation) Alfa-komplimentaarsus 6. Too 1 selektiivse markeri näide, mida saaks kasutada plasmiidi sisaldava bakteri registreerimiseks/identsifitseerimiseks X-Gal värvib sinisteks rakud, mis ei sisalda huvipakkuva järjestuse, valged on need, mis sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Põhineb alfa-komplimentaarsusel 7. Selgita mõistet ja milleks seda kasutatakse?
Meetod põhineb spetsiifilise DNA fragmendi in vitro sisestamisel iseseisvalt replitseeruvasse DNA järjestusse. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro Meile huvipakkuva geeni fragment, e. insert (võõr-DNA), sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud rakud välja selektiivsele (agar)söötmele. Viiruse või
Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Transgeenne loom- loom, mille kõikide rakkude DNA järjestused sisaldavad võrra DNA- järjestuse. Et saada ühet transgeenset looma võib: 1) võtta viljastatud munarakku ja viia selle tummasse plasmiidi abil laboris valmispandud DNA-lõigu.Siis viia munarakk asendusema emakasse ja oodata laste sündimist. 2) võtta looma emakast blastotsüsdid, eralda neist tüvirakud ja lisada neile plasmiid DNA´d. Kui plasmiid DNA integreerub tüvirakkude kromosoomidesse, viia need tagasi blastotsüsti ja blastostüst viia aesendusema emakksse.Oodata laste sündi.Sellisel juhul sündivad nn kimäärsed loomad, milleosa rakkudest on
meetodil? a) Dideoksüterminaatorid b) Praimer c) DNA polümeraas d) Kõik siintoodud komponendid on vajalikud e) ATP, CTP, GTP ja TTP 19. Kuriteopaigalt avastatakse verine nuga, mille külge on kleepunud paar juuksekarva. Millist meetodit kasutatakse juuksekarvast pärineva DNA paljundamiseks, et saada seda uurimiseks piisavas koguses: a) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) b) DNA kloonimist plasmiidi ja paliundamist bakterite abil c) DNA keemiline süntees d) Western blot 20. Milline järgnevatest ensüümidest hoiab ära restriktaasiga avatud vektorplasmiidi retsirkulatsiooni kloonimise käigus: a) Veise soole fosfataas (calf intestine phosphatase-CIP) b) T4 DNA ligaas c) DNA polümeraas I Klenowi fragment d) Taq DNA polümeraas e) AMV pöördtranskriptaas Kontrolltöö 2. 1
Geenitehnoloo gia arstiteaduses Kerdu-Katty Pärss 12.C Geenitehnoloogia mõiste Geneetika haru, kus kasutatakse organismide genoomi muutmiseks biotehnoloogia vahendeid. Seisneb DNA-lõikude eraldamises ning katseklaasis töötlemises. Töödeldud lõikude siirdamine kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Ajalugu Geenitehnoloogia valdkond tekkis alles 20. sajandi teises pooles. Alfred Hershey ja Martha Chase tõestasid, et DNA-l on oma roll pärilikkuses ning 1953. aastal kirjeldasid James Watson ja Francis Crick DNA molekuli kaksikheeliksi-kujulist struktuuri. 1974 lõi Rudolf Jaenisch maailma esimesed transgeensed hiired, sisestades võõrast DNA-d hiire embrüosse. 1975. aastal toimus Asilomari konverents. 1978. aastal tuldi välja inimese insuliiniga.
Soojas on rakkudele kahjulik. 7. Mis on Bürkeri kamber? Rakkude loendamise kaadervärk 8. Kuidas teha vahet elus ja surnud rakkudel kinnituvate rakkude korral? Surnud rakud hulbivad söötmes. 9. Kuidas rakke paljundatakse? Sööde, pH 7,2-7,4, CO2 5%, inkubaator 37 Praktiline töö II Transfektsioon 1. Mida nimetatakse transfektsiooniks, milliseid alternatiivseid meetodeid saab kasutada? Transfektsioon = transformatsioon+infektsioon Transfektsioon on võõr-DNA viimine loomarakku plasmiidi kujul (bakterite puhul nimetatakse sarnast protsessi transformatsiooniks). Viiruste abil DNA üle kandmist nimetatakse transduktsiooniks. Keemilised meetodid tekitatakse DNA-reagent kompleks: · Kaltsiumfosfaat tekitatakse kaltsiumfosfaat-DNA sade, mis lisatakse rakkudele, avastati 1973, hea odav, probleemiks efektiivsus. · katioonsed polümeerid (PEI-polüetüleenimiin, DEAE dekstraan) - soodustavad DNA seostumist membraaniga ja endotsütoosi, puuduseks toksilisus.
Geenitehnoloogia ( 37-56 ) 1. Mis on geenitehnoloogia? Geenide siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel 2. Kuidas viiakse rakkudesse võõraid geene? Bakteri plasmiidi abil, viiruste abil 3. Selgita: transgeenne organism, CMO, kimäär, nokaut-organism. Transgeenne organism: organismid kelle genoomi on siirdatud mõne võõrliigi geene, mis neis organismides avalduvad ja ka järglastele päranduvad. Nt: Lammas, forell, tomat, sojauba, kartul, mais, kalkun, veised. CMO: geneetiliselt muundatud organism; elusolend, kelle DNA-d on kunstlikult muudetud. + kiiremad tulemused, geenid teistelt liikidelt, geenide avaldumist saab reguleerida,
rakkudesse, et ravida või leevendada pärilikke haiguseid ja vähki. Geenivaigistus geeni avaldumise takistamine geeni struktuuri rikumata. Mille poolest erineb geeniteraapia rakuteraapiast ja transgeneesist ? Geeniteraapia puhul siirdatakse somaatilistesse rakkudesse terveid inimgeene või vaigistatakse mutantse geeni avaldumine; rakuteraapia korral siiratakse haigesse või kahjustunud koesse vastavalt diferentseerunud rakumasse ning transgeneesi puhul siirdatakse ühe liigi plasmiidi või viljastatud munarakku teise liigi geene ning see muutus on pärandatav järglastele. Miks ei ole geenravi seni laialt levinud ? Geeniteraapia on väga kulukas protseduur, mille edu ei ole olnud kõige parem. Geeniteraapiale on mõnel korral järgnenud surm või pahaloomulise kasvaja areng. Mis otstarve on sünnieelsel meditsiinigeneetilisel informatsioonil ? Need võimaldavad vähendada raskete ravimatute puuetega laste sünnisagedust vastavate
moodustada aluspaare 6. Võttes aluseks DNA järjestuse 3’-ATGCAGTAG-5’, milline on komplementaartne mRNA järjestus ja tRNA antikoodonjärjestus? (TACGTCATC) mRNA järjestus: AUGCAGUAG tRNA antikoodonjärjestus: UACGUCAUC 7. Geneetiline rekombinatsioon – konjugatsioon, transformatsioon, transduktsioon Geneetiline rekombinatsioon Ilmneb, kui organism omandab ja ekspresserib geene, mis pärineb teistest organismist Konjugatsioon Plasmiidi või kromosomaalse fragmendi ülekanne doonorrakust retsipientrakku läbi otsese sideme Gram-negatiivsel doonorrakul on fertiilsusplasmiid e. F-plasmiid, mis võimaldab sünteesida konjugatsiooni e. Sekspili Retsipient on samasse liiki või perekonda kuuluv rakk, millel puudub F- plasmiid Doonor kannab F-plasmiidi üle retsipiendile läbi pili Konjugatsioonil osa kromosoomist ja osa F-plasmiidist kantakse üle retsipiendile Transformatsioon
ning raku sisemuses on tunduvalt vähem struktuure. (N: tsüanobakterid, mükoplasmad) Eukarüoodid jaotatakse protistideks, taime-, seene- ja loomariigiks. Viirused ei kuulu kumbagi rühma. (N: viburloomad, käsnad, rohevetikad) 5. Miks rakud on erinevad? V: Nad jagunevad ühe- ja hulkrakseteks, erineva kujuga( ümarad, pulkjad, kruvikujulised) 6. Rakumembraani, rakutuuma, tsütoplasmavõrgustiku, ribosoomi, Golgi kompleksi, lüsosoomi, mitokondri, plastiidi, vakuooli, plasmiidi ehitus ja ülesanded. V: Rakutuum: tavaliselt ümar ümbritsetud tuumaümbrisega, mis koosneb kahest membraanist, milles paiknevadpoorid tuum on täidetud plasmaga tuumas asuvad pärilikkuse kandjad (DNA, RNA ja valgud) tuumakesed on näha ainult rakujagunemise ajal; toimub kromosoomidekokkupakkimine Ülesanne: Rakutuum reguleerib kõiki rakus toimuvaid protsesse Rakumembraan: ümbritseb igat rakku Ülesanne: Aine- ja energiavahetus Ained läbivad rakumembraani: a)passiivse transpordi teel:
Geenitehnoloogia Õp lk 37-54 Nimeta erinevaid geenitehnoloogia valdkondi? Kasutatakse: põllumajanduses, toiduainete tootmises, inimeste/loomade mitmete omaduste muutmises, haiguste diagnoosimises ja ravis. Mis on geenitehnoloogia? Geenide siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. Kuidas on võimalik rakku viia võõrast pärilikku infot (geenikandjad)? Bakteri plasmiidi abil, viiruste abil Selgita lähemalt, mida tähendab geeninokaut. Mis on selle meetodi kasutamise eesmärk? GEENINOKAUT mutatsiooniga rikutakse geeni struktuuri ja mingi kindel tunnus enam ei avaldu. Muutus toimub DNA-s, seega pärandub see edasi, EESMÄRK: Geeninokaudi sihtrühm on hiir. Uuringute eesmärk on inimese pärilike haiguste olemuse ja avaldumise uurimine hiirmudelil. GM organismide loomise võimalused. 1)Organismi siirdatakse mõne võõra liigi geene, et avalduksid teisele
alguspunkti), selektiivset markerit (ampitsilliinile resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside loikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult uks kord). Vajalik DNA-loik uhendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes luhikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pohietapid on jargmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "loikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni voi DNA-loigu "valjaloikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille kaigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest.
Iga bakter kannab endaga kaasas ka pärilikkusainet ehk DNA-d. Ribosoomis toimub valgusüntees; see koosneb siis rRNA-st ja valgu molekulidest. 3. Bakterirakud paljunevad põhiliselt pooldumisega. Soolekepikese rakk kasvab pikkuses kaks korda ja jaguneb seejärel kaheks tütarrakuks. Raku jagunemisele eelneb DNA replikatsioon teiste rakuainete süntees. Mõlemad tütarrakud saavad koopia kromosoomist, ligikaudse arvu plasmiidi koopiaid ning piisava koguse teisi raku eluks vajalikke biomolekule. 4. Plussid Miinused Taimede juurtel elavad bakterid aitavad taimedel toituda 5. Plussid Miinused Piimhappebakter soodustav seedimist Levitavad haiguseid Ravimites olevad bakterid hävitavad Ravimites olevate bakterite liigne sisse kahjulikke baktereid võtmine võib hävitada organismi Jaan Sild
Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. (vt. ka fail) 42. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 43. DNA sekveneerimise põhimõte
See on vajalik toitumiseks, aga ka elutegevuseks kahjulike ainete lagundamiseks või nende toime vältimiseks Plasmiidid sisaldavad geene, mille põhjal sünteesitud valgud aitavad bakteritel antibiootikumi keskkonnas ellu jääda. Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 40. DNA kloneerimine DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi
GMO- geneetiliselt muundatud organism Transgeenne organism- ühte organismi viiakse teise liigi geene Geeninokaudiga organism- organism, kus üks või mitu geeni on välja lülitatud 17. Mis on geenivektor? Milleks kasutatakse? Vastus: Geenide ülekandemehhanism bakterite või viiruste abil Viiruse genoom viiakse geeni, mida tahetakse üle kanda, paljunemise geenid surutakse maha Ülekantavad geenid viiakse bakterite plasmiidi, plasmiid siseneb rakku. 18. Bakterite ja GM-bakterite kasutamine biotehnoloogias. Vastus: Tööstuses (lisatakse pesupulbritele Toiduainetööstuses: laktaas, kümosiin, suhkrusiirup tärklisest, toidupaksendajad, värvained (beeta-karoteen), maitsetugevdajad (Na-glutamaat) Biokütus: metaan (sigala läga, prügimägeda jäägid, biopuhastite jäägid - lagundatakse bakterite abil) Keskkonna puhastamisel: jäätmete lagundamisel, pinnase biotervendamine e
seejuures kiiremat diagnoosi, paremat ravi ja haigusi ennetavat praktikat. 7. Geenitehnoloogia - ehk tehnogeneetika ehk insenergeneetika ehk geenitehnika ehk geenimanipulatsioon on geneetika haru, kus kasutatakse organismide genoomi muutmiseks biotehnoloogia vahendeid.Geenitehnoloogia seisneb konkreetsete DNA-lõikude eraldamises ning in vitro (katseklaasis) töötlemises. Sellele järgneb töödeldud lõikude siirdamine, kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse.Geenitehnoloogia tekkimise oluliseks baasiks oli rekombinantse DNA metoodika loomine, mis omakorda sai alguse tänu restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamisele bakterites 1970. aastal. Restriktaasid lõhuvad DNA molekuli kaksikahelad komplementaarseteks üheahelalisteks fragmentideks, millel on nn kleepuvad otsad. Lahuses kokku viidud paarduvate otstega fragmendid ühinevad ja ensüümi ligaas abil luuakse ka kovalentsed sidemed. 8
seejuures kiiremat diagnoosi, paremat ravi ja haigusi ennetavat praktikat. Biotehnoloogia alustala on DNA ja valdav osa manipulatsioone viiakse läbi nukleiinhapete tasandil. Geenitehnoloogia Geenitehnoloogia ehk tehnogeneetika ehk insenergeneetika ehk geenitehnika ehk geenimanipulatsioon seisneb konkreetsete DNA-lõikude eraldamises ning in vitro töötlemises. Sellele järgneb töödeldud lõikude siirdamine kas sama või ka muu liigi esindaja kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Geenitehnoloogia tekkimise oluliseks baasiks oli rekombinantse DNA metoodika loomine, mis omakorda sai alguse tänu restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamisele bakterites 1970. aastal. Restriktaasid lõhuvad DNA molekuli kaksikahelad komplementaarseteks üheahelalisteks fragmentideks, millel on nn kleepuvad otsad. Lahuses kokku viidud paarduvate otstega fragmendid ühinevad ja ensüümi ligaas abil luuakse ka kovalentsed sidemed. Geeniteraapia
moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes lühikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. 5. Mis on plasmiid? Plasmiid on kaksikspiraalne DNA rõngasmolekul, mille molekulmass varieerub küllaltki 125 suurtes piirides. Plasmiidid asuvad vabalt tsütoplasmas või on liitunud kromosoomiga. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasigas.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 7
Viiruste tekke kohta puudub ühtne seisukoht, ning on tõenäoline, et erinevad viiruste rühmad pole ka ühesuguse päritoluga. Et paljud viiruste osad meenutavad elusorganismide rakkude osi, on levinud oletus, et viirused on tekkinud mingi DNA või RNA "iseseisvumisel" ja järgneval evolutsioonil peremeesrakust sõltumatult, kasutades ära peremeesraku "molekulaarset masinavärki". Bakterite puhul on vaadeldud analoogset nähtust, kus kromosoomi mingi osa eraldudes moodustab plasmiidi, mis võib ühelt rakult teisele üle kanduda. Viiruste põhimõtteline (ja mõnikord ka struktuuriline) sarnasus transposonitega viib mõttele, et mõned viirused on end genoomist "lahti rebinud" transposonid. Samas võib olla asi ka vastupidi, ning transposonid tekkinud hoopis viirustest. On avaldatud ka arvamust, nagu võiks mõned viirused endast parasiitse eluviisi tõttu äärmuslikult lihtsustunud baktereid, või oleks ürgookeanis tekkinud paralleelselt rakulise eluga
GEENITEHNOLOOGIA Geenitehnoloogia molekulaargeneetika rakendusharu, DNA-fragmentide siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende kasutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Restriktaas bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt. Ligaas ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad. Geenides on intronid ja eksonid : · Intron lõigatakse · Ekson liidetakse Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast :
On suht elastne,on vajalik kaitseks.Valgulised karvakesed e lipiidid on vajalikud kinnitumiseks.3)limakapsel- mõnedele b-l tekivad kestas limaained.see on vajalik:*kaitseks*hõlbustab liikumist.Haigustekitajatel e patogeensetel b-l sisaldab limakapsel bakteritoksiini mis mõjuvad org-le erinevalt.6.Plasmiidide tähtsus B-rakus-vajalikud kk-ga kohanemiseks ja toitumiseks.Koostises on geenid,liiguvad rõngaskormosoomi koostisesse ja sealt plasmiidi sisse.7Spooride moodust ja bioloogiline tähtsus-B väljutab rakus oleva vee, organellide arv väheneb,ainevahetus aeglustub ja rakk kattub tiheda kestaga.EI OLE paljunemisviis sest 1 B-rakust tekib 1 spoor.B saavad spooride kujul täiendava vee ja toitaineteta elada aastasadu.8.B looduslik tähtsus-1)toiduahelates lagundajad,lagundavad loomset materjali(laibad,väljaheited)2)keem elementide liidete läbiviijad3)haigustekitajad 9.B ja S
Geenmuundamise puhul on põllumajanduslikesse kultuuridesse sisestatud mingit kindlat tunnust kandev võõrgeen, mis sisaldab endas lisaks vajalikule omadusele ka antibiootikumile resistentset märgistusgeeni ja geeni talitlust reguleerivat DNA promootorit. Esimene geneetiliselt muundatud taim oli tubakas, mis teostati 1983.aastal. See sai võimalikuks tänu bakterile- agrobakterium. See bakter oli võimeline nakatama edukalt taimi, saates neisse väikesed DNA- aasad (Ti- plasmiidi), mis omakorda sokutavad end taimerakkude kromosoomidesse. Tuleb vaid plasmiididele lisada vajalikud geenid, see ollus taimelehele määrida ja uus taim kasvatada. Nii aretati ka maavitsaline petuunia ja ka puuvill. Turule jõudis tubakas 1994. aastal. Pealtnäha pole GM- taime võimalik tavalisest taimest millegi poolest eristada. Küsimusi tekitab hoopis see, kas eristamine on vajalik. Riigid, kes GMO-sid kasvatavad,
muutmiseks või nende käsutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. 37 21. geenivaigistus - geeni avaldumise takistamine epigeneetiliste mehhanismidega transkriptsiooni või translatsiooni tasemel geeni struktuuri rikkumata. 22. geenivektor (geenisiirdaja) - rekombinantse DNA või RNA konstrukt, milles siiratav geen on ühendatud (tavaliselt viiruse või plasmiidi) elementidega, mis tagavad selle sisenemise rakku, integratsiooni ja avaldumise rakus. 23. geneetiliselt muundatud organism - tavakeeles populaarne väljend transgeense ehk siirdgeense organismi tähistamiseks. 24. genoomipank - bakterikloonides säilitatav inimese genoomi DNA-fragmentide kogum; käsutatakse kindlate fragmentide (geenide) paljundamiseks, uurimi seks ja siirdamismaterjali saamiseks. 25
· Transgeenne organism organism või rakk, mille genoomis sisaldub, avaldub ja pärandub järglastele teiselt liigilt pärit geen; loodud geenitehnoloogilise protseduuriga. · GMO lühend väljendist ,,geneetiliselt muundatud organism". tavakeeles populaarne väljend transgeense ehk siirdgeense organismi tähistamiseks. · Geenivektor rekombinantse DNA või RNA konstrukt, milles siiratav geen on ühendatud (tavaliselt viiruse või plasmiidi) elementidega, mis tagavad selle sisenemise rakku, integratsiooni ja avaldumise rakus. · Geeninokaut geenitehnoloogiliselt rikutud geeniseisund. · Geeniteraapia geenitehnoloogiline meetod geneetiliste haiguste raviks või leevendamiseks; seisneb normaalse inimgeeni siirdamises defektiga indiviidi somaatilistesse rakkudesse. · DNA sõrmejäljed 2. Bioloogia seos teiste teadusaladega.
sellisesse DNA järjestusse, mis on võimeline iseseisvalt replitseeruma. Selline replikon viiakse sobivasse peremeesrakku ja paljundatakse seal. Varasemal ajal mõeldi kloonimise all just seda meetodit. Rakuline kloonimine koosneb neljast põhietapist: 1. Rekombinantsete DNA molekulide konstrueerimine in vitro. Meile huvipakkuva geeni fragment, e. võõr-DNA, sisestatakse ligeerimisel isereplitseeruva geneetilise elemendi (replikoni), enamasti plasmiidi või viiruse DNA genoomi e. vektorisse. 2. Transformatsioon ehk sisestamine. Selle tulemusel saadakse uus rekombinantne DNA molekul, mis on võimeline sisenema (näit. viirusena) või mida on võimalik sisestada e. transformeerida bakteri rakku. DNA repli-katsioon toimub seal sõltumatult peremeesraku kromosoomi(de)st. 3. Selektiivne paljundamine. Individuaalsete rakukolooniate (kloonide) saamiseks külvatakse transformeeritud (muundatud) rakud välja selektiivsele (agar)söötmele.
viljakeha--osale seeneliikidele iseloomulik hüüfidest moodustunud organ, milles valmivad eosed. Plasmiidid Plastiidid on taimele iseloomulikud organellid, mis jagunevad leuko-, kromo- ja kloroplastideks. Seened on eeltuumsed päristuumnsed heterotroofsed organismid. Bakterite patogeensus tuleneb nende poolt ümbritsevasse keskkonda eraldatavatest toksiinidest. o Kitiinist kest ümbritseb: a) loomarakku, b) seenerakku, c) taimerakku, d) bakterirakku. o Plasmiidi DNA molekulis on info: a) valkude sünteesiks, b) lipiidide sünteesiks, c) sahhariidide sünteesiks, d) ATP sünteesiks. o Antibiootikume sünteesivad põhiliselt: a) taimed, b) loomad, c) seened, d) bakterid. Seene hüüfid moodustavad mütseeli. Taimerakus esineb DNA lisaks kromosoomidele veel kloroplastide ja mitokondrite koostises. 1
Seostuvad Ca-ga, ladestuvad luudes, hammastes – vastunäidustatud enne jäävhammaste tulekut, rasedatel. klooramfenikool seostub labiilselt 50S • Plasmiidi poolt kodeeritud laia spektriga, aga kõrge toksilisusega. (bakteriostaatiline) alaüksusega, väldib peptiidahela inaktiveerivate ensüümidega pikenemist, sekkudes (atsetüültransferaas) – ravim
ravimiseni nagu Alzheimer ja Parkinson. LK: 42 1: Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises in vitro ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri. Lk 42 1. Selgitage, mida kujutab endast geenitehnoloogia ja missuguseid võimalusi see pakub. Geenitehnoloogia seisneb DNA valitud lõikude eraldamises, töötlemises ja siirdamises sama või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri - kromosoomi, plasmiidi või viirusesse. 2. Mis oli peamine avastus, mis viis rekombinantse DNA metoodika loomiseni? Restriktaaside avastamine bakterites. 3. Millised on tehnogeneetiliselt muundatud organismide (GMO) kaks tüüpi? Võrrelge neid ja tooge välja nende erinevused. Transgeensed organismid ja geeninokaudid. Transgeensed organismi geene on siirdatud teistele võõrliikidele. Geeninokaut- nende muundamine on trangeensele vastupidine. 4. Mis liiki oli esimene transgeenne imetaja
ühendatakse ta selisesse DNA-sse, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Geenivektorina saab kasutada bakterite plasmiide, viiruste DNAd või RNAd ja muid molekule. PLASMIID- rõngas DNA-d, milles sageli antibiootikumiresistentsust andev geen. VIIRUSVEKTOR- viirustel põhinev geenide ülekandesüsteem ehk viib soovitud geenid rakku (viiruse genoomi kantakse soovitav geen, mille viirus viib oma genoomiga peremeesrakku) PLASMIIDNE GEENIVEKTOR- siiratav geen ühendatud plasmiidi elementidega. 4. Geneetikas enimuuritud liigid (eri organismirühmadest), nende valiku kriteeriumid. (vt esitlus Geeniotehnol_enimuuritud). GM taimed: ● kahjuritele vastuvõtmatud kultuurtaimed nt ümarusse ‘’tõrjuvad’’ banaan, riis, kartul ● seemnete produktsiooni kasv, biomassi kiirem kasv ● pestitsiidikindlad kultuurtaimed GM loomad: sead, lambad, kodulinnud, pärdikud, kalad, putukad ● Lehmapiima toitainesisalduse tõstmine ● Kanamunades kasvajavastased valgud
ellu jääda. Ühes rakus sisalduvate plasmiidide koguarv ja neis sisalduvate geenide arv ei ole püsiva suurusega, geenid liiguvad rõngaskromosoomist plasmiididesse ja tagasi. Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine;
ellu jääda. Ühes rakus sisalduvate plasmiidide koguarv ja neis sisalduvate geenide arv ei ole püsiva suurusega, geenid liiguvad rõngaskromosoomist plasmiididesse ja tagasi. Rekombinantse DNA puhul peab plasmiidil olema replikatsiooni origin, resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine;
annaabi.ee 
