väärtusega puhvris. Kaalusin analüütilistel kaaludel ensüümi 0,006 g. Viisin selle kvantitatiivselt 10 ml mõõtekolbi. Lisasin väikse koguse puhvelahust ja loksutasin, kuni ensüüm lahustus. Seejärel lisasin puhverlahust juurde, nii, et seda oli kokku 5ml. 2. Võtsin 50ml mahuga suurema katseklaasi ja pipteerisin sinna 25ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin vesitermostaati 30 C ° juurde 10 minutiks seisma. 3. Võtsin neli katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipteerisin igaühte 3ml 5%-list TKÄ lahust. 4. Kui kaseiini lahus oli soojenenud, alustasin hüdrolüüsi. Pipteerisin kaseiinile juurde 1ml uuritava proteaasi lahust, loksutasin ja võtsin 3ml proovi. Esimese proovi võtmise hetkel vaatasin ka kella. Seejärel võtsin iga 5 minuti järel taas 3ml reaktsioonisegu kuni neid oli kokku neli. Reaktsioonisegu pipteerisin katseklaasi, kus oli TKÄ lahus ja loksutasin ja nii neli korda. 5
Tööreaktiivi koostis: Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab: · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH= 6,0 · K-heksatsüanoferraat(II) K4(Fe(CN)6) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini. Seejärel asetasin statiivile kuus puhast katseklaasi ja nummerdasin need. Esimesse panin 1 ml destilleeritd vett ja lisasin juurde 3ml tööreaktiivi. Teise ja kolmandasse panin 1ml viinamarja lahust ja 3ml tööreaktiivi. Neljandasse, viiendasse ja kuuendasse panin 1ml erineva sisaldusega glükoosi lahust, mis eelnevalt said valmis tehtu ja panin juurde kõikidesse 3ml tööreaktiivi. Kõki katseklaase loksutasin hoolikalt kohe pärast tööreaktiivi lisamist ja jätsin naa 20 minutiks seisma. Oli näha väga õrna kollakat värust. Seejärel määrasin
Töö käik · Kaalusin 0.0076 g tahke proteaasi (alealase) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel. · Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati 30 kraadi juurde soojenema. · Sel ajal, kui kaseiini lahus termostaadis soojenes, võtsin 4 katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igaühte 3 ml 5% trikloroäädikhapet. · Kui termostaadis olev lahus oli piisavalt soojenenud, lisasin sellele 1 ml proteaasilahust, loksutasin korralikult ja kiiresti ning võtsin reaktsioonisegu ml segu ning pipeteerisin selle esimesse nummerdatud katseklaasi TKÄ-ga. Fikseerisin reaktsiooni algusaja. (0-proov) · Täpselt 5 minuti möödumisel võtan taas reaktsioonisegu termostaadist ja pipeteerin 3 ml lahust teise
Töö käik Kaalusin 0.02 g tahke proteaasi (esperaas) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml. Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel. Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati 30 kraadi juurde soojenema. Sel ajal, kui kaseiini lahus termostaadis soojenes, võtsin 4 katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igaühte 3 ml 5% trikloroäädikhapet. Kui termostaadis olev lahus oli piisavalt soojenenud, lisasin sellele 1 ml proteaasilahust, loksutasin korralikult ja kiiresti ning võtsin reaktsioonisegu ml segu ning pipeteerisin selle esimesse nummerdatud katseklaasi TKÄ-ga. Fikseerisin reaktsiooni algusaja. (0-proov) Täpselt 5 minuti möödumisel võtan taas reaktsioonisegu termostaadist ja pipeteerin 3 ml lahust teise TKÄ-ga täidetud katseklaasi
sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. 1. Uuritavaks proteaasiks on alkalaas, millest ma valmistasin 5ml lahust kontsentratsiooniga 1,5 mg/ml. 2. Võtsin 25 ml mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiinilahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde umbes 510 minutiks 3. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust 4. Termostaadis olevevale kaseiinilahusele lisasin ensüümi ning märkisin reaktsiooni alguse aja üles. 5. Peale ensüümi lisamist võtsin puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viisin TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov) ja loksutasin. Reaktsioonisegu asetasin tagasi termostaati. 6. 5 minuti ja 45 sek pärast võtsin sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja
Töö käik Kaalusin 0.005 g tahke proteaasi (amülaasi) preparaati, valasin selle gradueeritud katseklaasi ning lisasin vajaliku koguse puhvrit, et lahuse üldmaht oleks 5 ml Segasin lahust proteaasi lahustumiseks 5 minuti vältel. Samal ajal pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2% kaseiini lahust ning panin selle 10 minutiks termostaati 30 kraadi juurde soojenema. Sel ajal, kui kaseiini lahus termostaadis soojenes, võtsin 4 katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igaühte 3 ml 5% trikloroäädikhapet. Kolbidesse lisasin ettenähtud aegadel reaktsioonisegust võetud proovi. Kui termostaadis olev lahus oli piisavalt soojenenud, lisasin sellele 1 ml proteaasilahust, loksutasin korralikult ja kiiresti ning võtsin reaktsioonisegu ml segu ning pipeteerisin selle esimesse nummerdatud katseklaasi TKÄ-ga. Fikseerisin reaktsiooni algusaja. (0-proov) Sarnaselt toimisin veel 10 ja 20 minuti möödumisel reaktsiooni fikseeritud algusest.
katseklaasile korgi ja loksutasin seda, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 mL lahuga katseklaasi, kuhu pipeteerisin pipetiga 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Asetasin katseklaasile korgi ja asetasin eelnevalt soojendama pandud vesitermostaati 30°C juurde 10ks minutiks soojenema. · Järgnevalt nummerdasin 4 kuiva katseklaasi ja pipeteerisin igaühte 3 ml 5%-list trikloroäädikhappe lahust. · Pärast kaseiini soojendamist võtsin ta termostaadist välja ja alustasin kaseiini hüdrolüüsi. Alguses pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu kiiresti ja viisin 3 ml reaktsioonisegu esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ja loksutasin seda. Ja asetasin reaktsioonisegu kiirelt termostaati tagasi. · 5
lahust. Kontrollisin lahuse pH ja sain 8,6, mis vastab nõutele. Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine: Töölahuse kontsentratsioon peaks olema 2 mg/ml ja töölahuse kogus 5 ml. Sellest ma sain teada, et tahket ainet on 10 mg. Siis segasin 10 mg savinaasi 5 ml veega. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine: Pipeteerisiin tuubi 12 ml 2% - list kaseiini lahust ja panin termostaati 30oC juurde. Nummerdasin 4 kuiva 15 ml tuubi ja pipeteerisin sinna 1 ml 5% - list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 0,5 ml valmistatud proteaasi töölahust, reaktsioonisegu loksutasin kiiresti läbi ja võtsin nullproovi. Peale ensüümi lisamist võtsin puhta pipetiga võimalikult kiiresti 2 ml reaktsioonisegu, viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse tuubi (0-proov) ja tuubi sisu loksutades hoolega. Peale proovi
· Täidise kõrguseks mõõtsin L = 32cm ja läbimõõduks d = 1,7cm -> r = 0,85cm · Arvutasin täidise kogumahu: Vt = L·r2= 32 · 0,852 = 72,63cm3 · Arvutasin geelmaatriksi mahu: Vg = k·Vt = 72,63 · 0,1 = 7,263cm3 ja maksimaalse eludeerimismahu Vxmax = Vt Vg = 72,63 7,273 =65,357 cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu teades, et ühe fraktsiooni maht on 2ml. n = Vxmax/2 = 65,357 / 2 33 · Nummerdasin katseklaasid Praktiline töö · Avasin kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkas aeglaselt tilkuma keeduklaasi. · Reguleerisin kolonni voolutuskiiruseks ligikaudu 1ml/min · Kui vedeliku tase langes geeli pinnani sulgesin kiiresti väljavooluava. · 1ml pipetiga sisestasin ühtlaselt geeli pinnale uuritava proovi, mis koosnes: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml 2. Müoglobiinist 6mg/ml 3
lisasin puhverlaust. Segasin lahust senikaua, kuni ensüüm oli täielikult lahustunud. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine Võtsin 50 mL mahuga suure katseklaasi, kuhu pipeteerisin 25 mL 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli eelnevalt reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Sulgesin katseklaasi korgiga ja panin vesitermostaati 30 C juurde u 10 minutiks soojenema. Võtsin 4 kuiva katseklaasi ja nummerdasin need. Seejärel pipeteerisin igasse katseklaasi 3 mL 5%-list TKÄ lahust. Pärast kaseiinilahuse soojenemist, alustasin ensüümireaktsiooni. Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 mL valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin ning võtsin puhta kuiva pipetiga kiiresti 3 mL reaktsioonisegu, mille viisin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi, loksutasin. See oli 0-proov. Reaktsioonisegu asetasin termostaati tagasi. Samal ajal fikseerisin ka reaktsiooni alguse aja stopperil.
destilleeritud vett ja loksutasin. Sain lahuse kontsentratsiooniga 0,125 mg/ml. Viimaks võtsin saadud teisest lahjendusest 5 ml lahust ning lisasin 5 ml destilleeritud vett, loksutasin. Kolmanda lahjenduse sain kontsentratsiooniga 0,062 mg/ml. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsiooni tööreaktiiviga viisin läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks asetasin katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ning nummerdasin need. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett, katseklaasidesse nr 2 ja 3 1 ml mee tõmmist ning katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga glükoosilahust (mida olin eelnevalt valmistanud). Seejärel lisasin igasse katseklaasi 3 ml tööreaktiivi, loksutasin ning hoidsin katseklaase 20 minutit toatemperatuuril. Kaliibrismisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine
vett, saadakse lahus nr 1 kontsentratsiooniga 0.25 mg/ml II. Võetakse 2 ml lahust 1 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 2 kontsentratsiooniga 0.125 mg/ml. III. Võetakse 2 ml lahust 2 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 3 kontsentratsiooniga 0.062 mg/ml. 3. Reaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi toatemperatuuril spektrofotomeetri küvettides. Selleks võtsin kuus kuiva küvetti ja nummerdasin neid. Küvett 1: nullproov, dest.vett 250 l Küvett 2: uuritavat proovi 250 l Küvett 3: uuritava proovi paralleel 250 l Küvett 4: glükoosilahust 1 (0.25 mg/ml) 250 l Küvett 5: glükoosilahust 2 (0.125 mg/ml) 250 l Küvett 6: glükoosilahust 3 (0.062 mg/ml) 250 l Igasse küvetti lisatakse 750 l tööreaktiivi ning segatakse läbi. Fikseerisin reaktsiooni alguse aeg ja reaktsioonsegusid hoitakse 20 minutit toatemperatuuril
Esialgu lisasin väikese koguse puhverlahust ning segasin seda ~5 minutit kuni lahustumiseni, seejärel täitsin katseklaasi etteantud mahuni ning loksutasin, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümreaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · pipeteerisin suurde 50 ml mahuga katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ning asetasin selle korgiga kaetuna vesitermostaati 5-10 minutiks seisma · võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi, nummerdasin need ning igaühte lisasin 3 ml 5%-list TKÄ lahust · kui kaseiini lahus oli piisavalt soojenenud, alustasin ensüümireaktsooni, selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, loksutasin läbi, käivitasin stopperi ja asetasin selle tagasi vesitermostaati · kohe peale ensüümi lisamist võtsin puhta ja kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu ning viisin selle esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi ning loksutasin,
k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 32,2 cm ja diameetri d 1,9 cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = 91,296. · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiks koguda iga fraktsioon ubmes 2-3 minutiga)
Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml Ettevatlikult avasin kolonni väljavooluava, voolukiirus oli juba reguleeritud 1 ml/min Proovi sisestamine Uuritava segu kolonni sisestamiseks kasutasin 1 ml pipetti
boraatpuhvrit, mille pH oli 8,4. Segasin lahust klaaspulgaga, et ensüüm lahustuks. Kuna preparaadid sisaldavad ka täiteainet, siis selget lahust ei tekkinud. Ensüümireaktsiooni ehk kaseiini hüdrolüüsi läbiviimine 50 ml mahuga katseklaasi pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH oli reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Katsin klaasi korgiga ja asetasin vesitermostaati 30 °C juurde soojenema. Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus katseklaasi ja nummerdasin nad. Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. Kui kaseiini lahus oli 30 °C-ni soojenenud, pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust. Loksutasin reaktsioonisegu kiiresti läbi ning võtsin puhta ja kuiva pipetiga 3 ml reaktsioonisegu, mille lisasin esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi. Peale proovi võtmist asetasin reaktsiooniseguga katseklaasi tagasi termostaati. 5 minuti pärast võtsin sama pipetiga uuesti 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi
Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL. Lahjendatud glükoosilahuste tegemiseks võtsin kolm puhast ja kuiva kaliibritud katseklaasi. Valmistasin standardlahusest 10 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Selleks pipeteerisin I katseklaasi 2,5 mL standardlahust ja täitsin destilleeritud veega kuni 10 mL-ni. Loksutasin. Lahjendasin saadud lahust kaks korda (II katseklaas) ning saadud teist lahust veel omakorda kaks korda (III katseklaas). Loksutasin. Värvusreaktsiooni läbiviimine Nummerdasin 6 puhast ja kuiva katseklaasi, asetasin need statiivi. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 mL destileeritud vett. See oli kontroll- ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni. Katseklaasidesse nr 2 ja nr 3 pipeteerisin kummasegi 1 mL uuritavat lahust ehk sidrunimahla (2 paralleelproovi) Katseklaasi nr 4 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Katseklaasi nr 5 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/mL ja
kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahust kolmandasse katseklaasi ning samuti 5 ml destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin segamini. Antud lahjenduste katseklaasid olid vastavalt märgistatud. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. · Asetasin katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja nummerdasin. · Kontrollkatse ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viisin läbi destilleeritud veega. · Filtreeritud sidrunimahlaga tegin 2 paralleelkatset, glükoosi standarslahusest valmistatud lahjendustega igaühega 1 katse. · Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 ml destilleeritud vett. · Katseklaasidesse nr 2 ja 3 pipeteerisin 1 ml filtreeritud sidrunimahla. · Katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 pipeteerisin igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga
Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust, mille kontsentratsioonid olid 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Esimese lahuse valmistamiseks võtsin 2,5 ml standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett. Teise lahuse valmistamiseks võtsin esimesest lahusest 5 ml ja lisasin sellele 5 ml vett. Kolmas lahus valmis analoogselt teisele. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsiooni viisin läbi toatemperatuuril. Võtsin 6 puhast ja kuiva katseklaasi ning nummerdasin need. Kontrollkatse ehk 0-proov näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, see viiakse läbi destilleeritud veega. Uuritava lahusega tegin 2 paralleelkatset, glükoosi standardlahusest valmistatud erinevate kontsentratsioonidega lahjendustega tegin igaühega ühe katse. Katseklaasi number 1 pipeteerisin 1ml destilleeritud vett, katseklaasidesse number 2 ja 3 olin juba varasemalt filtrima pannud 1ml uuritavat lahust, milleks oli lahjendatud apelsinimahl
kontsentratsiooni lahuses ühtlustada. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine · Võtsin 50 ml mahuga suur katsekaas, kuhu pipeteerisin 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. · Klaasi katsin korgiga ja asetasin vesitermostaati juurde umbes 5 10 minutiks soojenema. · Võtsin 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdasin. · Igaühte pipeteerisin 3 ml 5%-list TKÄ lahust. · Kui kaseiini lahus on -ni soojenenud, alustasin ensüümireaktsiooni kaseiini hüdrolüüsi. · Pipeteerisin kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, reaktsioonisegu loksutasin kiiresti läbi. · Fikseerisin alguse aja kella järgi. · Peale ensüümi lisamist võtsin kiiresti puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml
k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·r2 = 114,45 · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat. · Avasin kolonni väljavooluava ja reguleerisin voolutuslahuse tilkumiskiiruse klambri abil piiridesse 0,7 1,0 ml/min (eesmärgiga koguda iga fraktsioon umbes 2-3 minutiga)
lisasin 5ml vett, loksutasin korralikult. Sellest omakorda taas 5 ml lahust ja lisan 5ml vett, loksutasin. Lahjendamisel lähtusin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub võrdne ainehulk. C standard ×V standard =Clahjendus ×V lahjendus Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL. Millise lahuse Lahjendatud glükoosilahustel oli lahuse kogumahuks 10 mL Värvusreaktsiooni läbiviimine Nummerdasin 6 puhast ja kuiva katseklaasi ja asetasin need statiivi. Katseklaasi nr 1 pipeteerisin 1 mL destileeritud vett. See oli kontrollproov ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni. Katseklaasidesse nr 2 ja nr 3 pipeteerisn 1 mL uuritavat lahust ehk apelsinimahla (2 paralleelproovi) Katseklaasi nr 4 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/mL. Katseklaasi nr 5 pipeteerisin 1 mL glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,125 mg/mL ja
Töö käik. Ken Pihlas: Lõikasin suurest papitükist välja 30x42 cm-lise papitüki ja seejärel kleepisin sellele must-valge A3 formaadis maailmakaardi. Töö käigus üritasin jälgida, et papi ja paberi vahele ei jääks õhumulle. Valisin välja sobivad riigid, mida kasutada lauamängu tegemisel. Robin Soolind: Esiteks mõtlesin välja reeglid. Abi sain kodus olevatest lauamängu reeglitest. Varusin värvipliiatsid, millega värvisin Keni poolt väljavalitud riigid. Seejärel nummerdasin värvitud riigid valitud järjekorras. Varusin ka mänguks vajalikud nupud ja täringu. Koos mõtlesime igale riigile kohased tegevused. Lauamängus sisalduvad tegevused: 1. Austraalia- Proovi veeretada võimalikult suur number, (et alustada jõudsalt edasiliikumist). 2.India- Tiheda liikluse tõttu jääd kaks korda vahele. 3. Hiina- Käid vaatamas Suurt Hiina müüri ning jääd ootama oma järgmist käiku. 4. Jaapan- Lendad Tokyost otse Mongoolia pealinna Ulan Bator-i. 5
kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 64cm2 6,4 cm2 = 57,6 cm2. o Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29. o Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. o Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ning märkisin ülesse voolutuslahuse koositse tris HCl, 0,15 M NaCl, pH=7,5. Varusin sobiva mahuga pipeti (20 ml, 25 ml), millega voolutuslahust kolonni viia. o Varusin väikse keedukolvi (50 ml) enne uuritava segu sisestamist kolonnist välja lastava kolonni pinnal oleva eluendi jaoks. Lahutasin segu komponendid.
Ning arvutasin kogumaht: Vt = S · L = 2,54 · 31 78,74cm3 · Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,87 cm3 Vxmax = 78,74 7,87 = 70,87cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,44 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma
L = 17,8 cm d = 2,7 cm 4. Arvutan täidise kogumahu Vt = = 3,14 5. Arvutan geelimaatriksi mahu Sellest lähtuvalt saab leida kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu 6. Arvutan fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml, mistõttu 7. Asetasin statiivi umbes 35 katseklaasi (kuigi arvutused näitasid, et vaja oleks 45) 2 ml mahu järgi kalibreeritud katseklaase ja nummerdasin need. 8. Paigutasin kolonni lähedusse eluendi pudeli ja võtsin 25 ml mahuga pipeti ning 50 ml mahuga keeduklaasi. Eluendi koostis: 50 mM tris-HCl + 150 mM NaCl (pH = 7,5) SEGU KOMPONENTIDE LAHUTAMINE JA PROOVI SISESTAMINE 1. Avan ettevaatlikult kolonni väljavooluava, et täidise kohal olev voolutuslahus (eluent) hakkaks aeglaselt kolonni alla asetatud keeduklaasi tilkuma. 2. Reguleerin kolonni voolukiiruse reguleerimisklambri abil piiridesse 0,7-1,0 ml/min. 3
juba seisnud. Sülje hüdrolüütilised ensüümid Sülje amülaasi aktiivsuse määramine Töö käik Kogusin kuiva katseklaasi paar ml sülge. Võtsin pipetiga 1 ml sülge ja viisin katseklaasi, kuhu olin eelnevalt pipeteerinud 9 ml destilleeritud vett. Pipeti sisu täielikuks eemaldamiseks imesin sülje koos veega pipeti sisse ning puhusin mitu korda välja. Järgnevalt võtsin 10 kuiva katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igasse 1 ml destilleeritud vett. Esimesse katseklaasi viisin 1 ml lahjendatud sülge, imesin ja puhusin mitu korda välja ning seejärel loksutasin katseklaasi sisu hoolikalt. Esimesest katseklaasist võtsin 1 ml ning pipeteerisin teise katseklaasi, korrates eelmist protseduuri. Nii tegin kõik edaspidised sülje lahjendused kuni kümnenda katseklaasini. Seejärel lisasin igasse katseklaasi 2 ml 0,1%-list tärkliselahust,
· Arvutasin geelimaatriksi maht Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg: Vg = 0,1 · 78.88 = 7,89 cm3 Vxmax = 78,88 7,89 = 70,99cm3 Selline täpsus pole õigustatud! · Arvutasin fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2 = 70,99 / 2 = 35,45 · Katseklaasistatiivi asetasin fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. · Märkisin voolutuslahuse koostis. Varusin sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia. · Varusin väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogusin kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuli kolonnist välja lasta. Segu komponentide lahutamine. Kui eelnevad ettevalmistused olid valmis, avasin ettevaatlikult kolonni väljavooluala ning kolonnis olev voolutuslahus hakkas tilkuma
võimeline hüdrolüüsima ka kliisterdamata tärklist. Sülje amülaasi aktiivsuse määramine Töö käik 1. Kogusin kuiva katseklaasi paar ml sülge. 2. Võtsin pipetiga 1 ml sülge ja viisin katseklaasi, kuhu olin eelnevalt pipeteerinud 9 ml destilleeritud vett. 3. Pipeti sisu täielikuks eemaldamiseks imesin sülje koos veega pipeti sisse ning puhusin mitu korda välja. 4. Järgnevalt võtsin 10 kuiva katseklaasi, nummerdasin ning pipeteerisin igasse 1 ml destilleeritud vett. Esimesse katseklaasi viisin 1 ml lahjendatud sülge, imesin ja puhusin mitu korda välja ning seejärel loksutasin katseklaasi sisu hoolikalt. 5. Esimesest katseklaasist võtsin 1 ml ning pipeteerisin teise katseklaasi, korrates eelmist protseduuri. Nii tegin kõik edaspidised sülje lahjendused kuni kümnenda katseklaasini. 6
annaabi.ee 
