- küllaldaselt mineraal- ja toitaineid - sobiv pH vahemik (pH 6-8) 20C juures · tingimused inkubatsioonil - valguse ja õhu juurdepääsuta - temperatuuril 20C - protsessi kestus 7 ööpäeva 2. Ettevalmistustööd analüüsi läbiviimiseks. a) a) Proovi pH 7,58, temperatuur 20,0C b) Lahjendusvee ettevalmistus Lahjendusproov valmistatakse 5 liitrisesse nõusse. Töös kasutatakse lahjenduste tegemiseks spetsiaalset toitesooli sisaldavat lahjenduslahust. Lahuse saamiseks lisatakse dest. veele : · 5ml fosfaatset puhverlahust · 5ml MgSO4 . 7H2O lahust · 5ml CaCl2 lahust · 5ml FeCl3 . 6H2O lahust c) Lahjendusvee ja analüüsitava proovi küllastamine õhuhapnikuga - Lahjendusvee ja proovivee temperatuur reguleeritakse 20C-ni ning küllastatakse hapnikuga. Õhurõhk 100,5Pa ning hapniku lahustuvus vees 9,01mg 1l vees.
valmistatakse kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust, reeglina kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Cst Vst = Clahj Vlahj Vst= Clahj Vlahj / Cst Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. Seega võimaldab toodud võrrand arvutada lahjenduse tegemiseks vajaliku standardlahuse mahu, kui on teada lahjendatud lahuse vajalik maht (10ml). 1) 2) 3) Lahjenduste valmistamine Lahjenduste valmistamiseks võtan 3 puhast,kuiva katseklaasi,kuhu pipeti abil mõõdan eelnevalt väljaarvutatud kogus glükoosi standardlahust. Destilleeritud vett lisan pipetiga niipalju,kui on vajalik lahuse lõppmahu(10ml) saavutamiseks. Katseklaasid sulen korkidega ja loksutan kontsentatsiooni ühtlustamiseks. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsiooni läbiviimiseks asetan katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja numereerin.
X = C × L × 10-3 × d = 0,146 × 100 × 10-3 × 1 = 1,46 % C – glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kaliibrimissirge järgi (mg/ml) L – lahjendustegur 10-3 – tegur üleminekuks grammidele d – mahla tihedus (g/cm3) Järeldus Kaliibrimisgraafik peaks olema antud töös lineaarne, mis minu katseandmete järgi selline ei tulnud. Uurisin paarilt kursusekaaslastelt nende katsetulemusi ja võrdlesin neid enda omaga ning leidsin, et glükoosilahuste lahjenduste optilised tihedused erinesid oluliselt minu omadest. Teen väikese tabeli, võrdlemaks enda optilisi tihedusi kursusekaaslaste omadega. Lahjendus Minu tulemus Ligikaudne tulemus kursusekaaslastel Glükoosilahus 0,25 ~0,06 ~0,06-0,07 mg/ml Glükoosilahus 0,125 ~0,01 ~0,04-0,05 mg/ml
Saadud lahus segatakse Vortex mikseriga saadakse lahus lahjendusega 101. Teise lahjenduse saamiseks viidakse 1 ml lahust esimesest katseklaasist teise katseklaasi, millele järgneb lahuse segamine. Tulemuseks saadakse lahjendusega 102 lahus. Järgnevate lahjendustega toimitakse samamoodi. Klostriidide lahjendusi tuleb hoida vesivannis 85°C juures 15 minutit. Nüüd viiakse 1 ml vastavaid lahjendusi neljale Petri tassile. Peale lahjenduste viimist Petri tassidele, valatakse kahte neist (105, 106) mikroobide üldarvu ning ülejäänud kahte (104, 105) klostriidide söödet. Järgnevalt paigutatakse Petri tassid termostaati vastavalt 37°C (klostriidid) ja 22°C (mikroobide üldarv) juurde. Arvutused , PMÜ/g Mikroobide üldarv mullas: , PMÜ/g Klostriidide arv mullas: , PMÜ/g Tulemus Mikroobide üldarv mullas on 23 090 909 PMÜ/g ja klostriidide arv 427 273 PMÜ/g.
vaheluvvoolusilda P-38. Juhtivusnõu loputada paar korda uuritava lahusega ning seejärel pipeteerida vastavalt nõu mahule selline hulk, et elektroodod oleksid 3-5 mm ulatuses lahusega kaetud. Kõikide mõõtmiste puhul peab vedeliku hulk olema ühesugune. Juhtivusnõu asetada vesitermostaati, mille temperatuuri hoida püsivana 25°C. Juhtivusnõud hoida 10-15 min termostaadis, seejärel ühedada elektroodid vahelduvvoolusillaga ja mõõta lahusekihi takistus. Samal viisil määrata ka lahjenduste takistused. Katsete lõpetamisel tuleb elektroodid jätta destilleeritud vette seisma. Valemid Nõu konstant: Elektrijuhtivus: Ekvivalentjuhtivus: Piiriline ekvivalentjuhtivus: Näiline dissotsiatsioonikonstant: Katsetulemused A. Elektroodide konstandi määramine: mõõdetud takistus 0,02 n KCl lahusega 1) 162,5 . 2) 164 ; 0,02 n KCl erijuhtivus (temperatuuril 25 °C) 0,2767 Cm/m; nõu konstant B. Nõrga elektrolüüdi lahus:
eelnevalt juba füsioloogiline lahus. Saadud lahus segatakse Vortex mikseriga – saadakse lahus lahjendusega 10 -1. Puhta pipetiga viidakse katseklaasist 1 ml 10-1 lahust Petri tassile. Teise lahjenduse saamiseks viidakse 1 ml lahust esimesest katseklaasist teise katseklaasi, millele järgneb lahuse segamine. Tulemuseks saadakse lahjendusega 10 -2 lahus, kust võetakse 1 ml seda lahust Petri tassile. Järgnevate lahjendustega toimitakse samamoodi. Peale lahjenduste viimist Petri tassidele, valatakse kahte neist (10-2, 10-3) mikroobide üldarvu ning ülejäänud kahte (10-1, 10-2) kolilaadsete bakterite söödet. Tegevus toimub laminaarboksis. Kraaniveele lahjendusi ei tehta ning võetakse 1 ml kraanivett, mis viiakse Petri tassidele. Kraanivees määratakse nii kolilaadseid baktereid kui ka mikroobide üldarvu. Järgnevalt paigutatakse Petri tassid termostaati vastavalt 37°C (kolilaadsed bakterid) ja 22°C (mikroobide üldarv) juurde. Arvutused
2. Glükoosilahuse valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks: Glükoosilahused valmistan glükoosi standardlahuse lahjendamise teel proovide järjestikkusel lahjendamisel saades lahused kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjendused tehakse samm-sammulisel lahjendamisel. Selleks valmistatakse esmalt standardlahusest kindla kontsentratsiooniga (0,25mg/ml), saadud lahjendatakse kaks korda ning teist lahust veel omakorda kaks korda. Pärast lahjenduste tegemist loksutatakse lahused korralikult läbi. 3. Värvusreaktsiooni labiviimine: Statiivi asetatakse 6 puhast ja kuiva katseklaasi ning nummerdatakse need. Proovid valmistatakse järgnevalt: Katseklaa Katseklaasi sisu millega on tegu? optiline tihedus s 1 1 ml dest vesi + 3ml tööreaktiiv kontrollproov 0,0690 D 2 1ml uuritav lahus + 3ml tööreaktiiv paraleelkatse 0,1222 D
KCl lahusega. Nõu täidetakse pipetiga ja mõõdetakse takistus. Katset korratakse uue KCl lahusega. Edasi mõõdetakse analoogiliselt kõigi uuritavate lahuste takistus. Lahuste kontsentratsiooni määrab praktikumi juhendaja. Lahused valmistatakse 100-ml mõõtekolbidesse laboratooriumis olevast tiitritud lahusest selle kvantitatiivsel ja järkjärgulisel lahjendamisel juhtivusveega. Lahuseid tuleb valmistada hoolikalt, vastasel korral läheb katseviga suureks. Samal viisil määrata ka lahjenduste takistused. Katsete lõpetamisel tuleb elektroodid jätta destilleeritud vette seisma. Katsetulemused A. Elektroodide konstandi määramine: mõõdetud takistus 0,02 n KCl lahusega 1)115 Ω. 2) 117 Ω ; keskmine: 116 Ω 0,02 n KCl erijuhtivus (temperatuuril 25 °C) 0,2765 Cm/m; I −1 K= =R ∙ κ=116 ∙ 0,2765=32,074 m nõu konstant s B. Nõrga elektrolüüdi lahus: elektrolüüt HCOOH
kaaluklaasi, klaasi sisu segasin vaikese klaaspulgaga ja tekkinud lahus valasin lahtri abil mootekolbi. Taidsin ca 1/3 kolvi mahust kuuma dest. veega ja kolbi hoidsin veevannis veel20 min, aeg-ajalt loksutasin. Parast jahutasin toatemperatuurini. Glukoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. Glukoosi standartlahust valmistasin 1,0 mg/ml glukoosi konts. Lahusest. Valmistasin kolm lahjendust, mille glukoosi konts. On vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks votsin kolm puhast katseklaasi, kuhu pipeti abil mootsin eelnevalt valjaarvutatud kogus glukoosi standartlahust ja lisasin dest. vett margini. Katseklaasi sulasin korgiga ja hoolikalt loksutasin. Reaktsiooni labiviimine. Katseklaas nr.1: Pipeteerisin 1 ml distileeritud vett.(kontrollproov) Katseklaasid nr.2,3: Pipeteerisin 1 ml uuritavat lahust (paralleelproovid) Katseklaas nr.4: Pipeteerisin 1 ml glukoosisisaldus 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga. Katseklaas nr
märgini, suletakse korgiga ja loksutatakse hoolega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi konsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis ühendab endas glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. X-teljel on glükoosi konsetratsioon, y-teljel absorptsiooni väärtus. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoosi 1,0 mg/ml. Lahjenduste konsentratsioonid: 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Kasutasin sammsammult lahjendamist. Selleks valmistatakse esmalt standardlahusest kindel maht (meie näites 10 ml) glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, mida seejärel lahjendaks 2 korda ning saadud teist lahjendust omakorda 2 korda. Iga lahust tuleb peale vee lisamist hoolega loksutada. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon viiakse läbi toatemperatuuril. Selleks nummerdatakse 6 kuiva ja puhast katseklaasi
puuviljadest ja pressitakse neist välja väike kogus (2-3 ml) mahla, mida siis vajalikul märral lahjendatakse. Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtusin glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml. 1. Standardlahusest valmistasin kolm lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml 2. Lahjenduste valmistamiseks võtsin 3 puhast, kuiva katseklaasi. Esimesse mõõdsin 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett 3. Teise võtsin 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett 4. Kolmandasse võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml dest. vett. Katse tulemused optiline korrigeeritud glükoos tihedus D mg/mL
mahla, millest kasutasin 1 ml. Saadud mahla lahjendasin destilleeritud veega 50ml mahuni, seega teostasin 50 kordse lahjenduse. Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtusin glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml. 1. Standardlahusest valmistasin kolm lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml 2. Lahjenduste valmistamiseks võtsin 3 puhast, kuiva katseklaasi. Esimesse mõõtsin 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vett. 3. Teise võtsin 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisasin 5 ml destilleeritud vett 4. Kolmandasse võtsin 5 ml teisest katseklaasist ja lisasin 5 ml vett. 5. Saadud lahjendusi loksutasin hoolikalt läbi. Reaktsiooni tööreaktiiviga viisin läbi katseklaasides toatemperatuuril. 1
Pressin apelsiinist umbes 5 ml mahla, mida pärast vajalikul määral lahjendan. (1/200 ml). Selleks valan 200 ml-lise katseklaasi 1 ml apelsiinimahla ja lisan kriipsuni vett. Glükoosilahuste valmistamine Kindlakontsetratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standart- lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standaartlahusest valmistam 3 lahjemat glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste tegemiseks kasutan samm-sammult lahjendamine. Et valmistada glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, võtan 2,5 ml glükoosi standart-lahust ja lisan 7,5 ml dest. vett. Et valmistada glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,125 mg/ml, võtan eelmisest lahusest 5 ml lahust ja lisan 5 ml vett. Et valmistada glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,062 mg/ml, võtan eelmisest lahusest 5 ml lahust ja lisan veel 5 ml dest. vett. Kõik katseklaasid loksutan hoolikalt.
Lahuse pH väärtust ei pidanud mõõtma. Glükoosilahuste valmistamine kalibreerimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb esmalt koostada kalibreerimisgraafik lainepikkusel = 410 nm. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoos 1,0 mg/ml. Selleks valmistasin standardlahusest kolm lahjemat glükoosilahust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks võtsin 3 puhast katseklaasi. Esimesse katseklaasi pipeteerisin 2,5 ml glükoosi standardlahust ning 7,5 ml destilleeritud vett ning loksutasin hoolikalt ühtlase kontsentratsiooni saamiseks. Selle tulemusel sain 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga lahuse. Teise katseklaasi pipeteerisin 5 ml 0,25 mg/ml kontsentratsiooniga lahust ning 5 ml destilleeritud vett, mille tulemusel sain 0,125 mg/ml kontsentratsiooniga lahuse. Loksutasin lahust hoolikalt
Steriilimiseks. Väljakülvi ei satuks teisi mikroobe. 9. Millist külvitehnikat ja söödet kasutaksid suure koguse mikroobimassi kasvatamiseks? Rikastussöödet ja pindkülvi. 10. Miks on vaja bakterite arvukuste määramiseks kasutada proovide lahjendusi? Bakterikultuur võib nii tihe olla, et pole võimalik nende arvukust määra – raske loendada! 11. Mis on lahjendusfaktor? Lahjendusfaktor, kui palju on algproovi lahjendatud. Lahjenduse pöördarv. 12. Mida mõistetakse detsimaalsete lahjenduste all? Lahjendussamm on kümnekordne. 100 (algproov, lahjendusfaktor 1) ja 10-1 (lahjendus) - lahjendusfaktor on 101. 13. Kuidas valmistada lahjendusrida, et saada lõpplahjenduseks 10 -10? Tuleb võtta epse ja teha 100 10-1 10-2...10-10.... kokku koos algproovi jaoks 11 epsi. Enne ja pärast lahjenduste tegemist, tuleb epse vortexil segada. nt kui kogulahus on 1ml, siis lisame 0,1 ml uuritavat materjali ja 0,9ml füsioloogilist lahust (0,9% NaCl). 14
Kuna ettevaatamatusest ületas vedeliku üldmaht 250 ml piiri, siis arvestan mahuks 251 ml. Glükoosilahuste valmistamine kaliirimisgraafiku koostamiseks. Kindla glükoosi kontsentratsiooniga lahuste valmistamiseks lähtuti glükoosi standardlahusest, milles glükoosi kontsentratsioon on täpselt 1,0 mg/ml. Sellest valmistati rida glükoosilahuseid ehk lahjendusi. Valmistati 3 lahjendust, milles glükoosi kontsentratsioon on vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks võeti 3 puhast, kuiva katseklaasi. Esimesse mõõdeti 2,5 ml glükoosi standardlahust ja 7,5 ml destilleeritud vette. Teise võeti 5 ml lahust esimesest katseklaasist ja lisati 5 ml destilleeritud vett. Kolmandasse võeti 5 ml teisest ja lisati 5 ml vett. Reaktsioon tööreaktiividega viidi läbi katseklaasides toatemperatuuril. Selleks asetati statiivile 6 puhast ja kuiva katseklaasi, mis markeeriti numbritega. Katseklaasi '0' pipeteeriti 1 ml destilleeritud
m = 1,19 ∙ 10–4 ∙ 24,305 ∙ 1 ∙ 1000 = 2,8963 mg C = m/V = 2,8963 mg / 1L C = 2,8963 mg/L 4 Kokkuvõte ja järeldused Kalibratsioonigraafikut kasutades sain tundmatu lahuse kontsentratsiooniks 2,7805 mg/L ja molaarset neeldumiskoefitsiendi kasutades 2,8963 mg/L. Usaldusväärsem meetod tundub olevat kalibratsioonigraafik, kuna selles on väiksem tõenäosus arvutusviga teha. Samas on neeldumiskoefitsienti arvutamine kiirem, kuna pole vaja graafikut koostada. Vead võivad tekkida lahjenduste tegemisel ja ühikute teisendamisel. Instrumenti peab ka kindlasti destilleeritud veega nullima. Tulemusesi võib mõjutada ka see, kui erinevate mõõtmiste vahel ei süstita masinasse dest. vett vaid pannakse sisse kohe uut lahust. 5 Tagasiside antud töö kohta (kohustuslik pole) Selle töö juures oli peaaegu kõik arusaadav ja lihtne. Meeldis, et protokolli mallis on kõik tabelid jne olemas, ning sai rohkem aega kulutada teemast arusaamisele.
Tehtud lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahjendatud glükoosilahust teise kuiva katseklaasi ning pipeteerisin sinna sama palju destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katselaasi korgiga ja loksutasin kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Tehtud teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml lahust kolmandasse katseklaasi ning samuti 5 ml destilleeritud vett. Jällegi sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin segamini. Antud lahjenduste katseklaasid olid vastavalt märgistatud. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. · Asetasin katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja nummerdasin. · Kontrollkatse ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viisin läbi destilleeritud veega. · Filtreeritud sidrunimahlaga tegin 2 paralleelkatset, glükoosi standarslahusest
ethanoolis, lisa 100 ml 85% (w/v) fosforhapet. Kui reagent on täielikult lahustunud, lahjenda 1 liitrini ja filtreeri lahus läbi Whatman #1 paberfiltri. Reagent peab olema värvuselt pruun. Korduv filtreerimine aitab eemaldada sinist komponenti. Külmas säilitatuna on reagent väga stabiilne (1 aasta). 2. 1 M NaOH lahus, kasutatakse juhul, kui valk pole lahustuv värvaine lahuses. 3. Tee standardvalgu (BSA) lahjenduste rida: 1 mg/ml 0,5 mg/ml 0,2 mg/ml 0,1 mg/ml 0,05 mg/ml 4. Terve grupi peale on antud 5x Bradfordi reagendi stock. Lahjenda see 25 ml-s, et oleks 1x stock. 25 ml kohta lisa 100 µl 5M NaOH. Lahustina kasuta mQ vett. 5. Pipeteeri igasse eppendorfi 1,5 ml 1x Bradfordi reagenti ning lisa 50 µl BSA valgulahust erineva kontsentratsiooniga. Viimasesse eppendorfi pipeteeri samuti 1,5
Standardlahusest valmistatakse kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. NB! Lahjendamise põhimõte: lahjendamiseks võetud lahuse (standardlahuse) mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub üks ja sama ainehulk ehk kehtib võrrand Cst • Vst = Clahj • Vlahj Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. Glükoosilahuste (lahjenduste) tegemisel lähtusin kõrvalolevast skeemist. Selleks valmistasin glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml (2,5 ml töölahus + 7,5 ml dest. vesi), loksutasin. Seejärel lahjendasin seda glükoosilahust 2 korda (5 ml esimene lahus + 5 ml dest. vesi), loksutasin. Saadud teist lahjendust lahjendasin veel 2 korda (5 ml teine lahus + 5 ml dest. vesi), loksutasin. Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures
Mõõta ära spektrid kõige kangematel KMnO4 ja K2Cr2O7 standardlahustel (joonised 7 ja 8). 3. Mõõta kontroll-lahust. 4. Jätkata mõõtmist punktis 2. saadud maksimumidega. Antud juhul 525nm ja 350 nm. 5. Valida režiim „Photometric“ ning mõõta läbi kõik standardlahused valitud lainepikkustel. Joonis 7. KMnO4 standardlahuse spekter Joonis 8. K2Cr2O7 standardlahuse spekter (λmax = 525 nm) (λmax = 350 nm) Lahjenduste valmistamine: Töölahus: 1mM K2Cr2O7 Vaja: 0.05 L; 0.12mM CM = n/V 0.12mM = n / 0.05 L n = 0.12 ∙ 0.05 = 0.006 mmol 1 mmol 1000 mL 0.006 mmol x mL x = (1000 ∙ 0.006) / 1 = 6 mL 3.2 Tulemused 3.2.1 Kalibreerimislahuste neeldumised väljavalitud lainepikkustel K2Cr2O7 KMnO4 Neelduvu Neelduvu Neelduvus Neelduvus lahuse konts. lahuse konts. s s
bakterite, mükoplasmade, viiruste, seente, pärmide, teiste eukarüootsete rakkude poolt Kontaminatsioonile iseloomulik on: -pH muutus -hägusus -ebameeldiv lõhn 8. Rakkude arvu määramine koekultuuri tassil (hematsütomeeter, rakkkude lugemine, rakkude arvu arvutamine). Hematsütomeeter loed rakud ühes teatud ühikus (1mm3) ja arvutad tassi koht. Loed igas ruudus, arvutad keskmise. Siis arvutad lahjenduste järgi tassi kohta. 9. Rakkude kasvukõver ja selle koostamine. Mida kasvukõver rakukultuuri kohta ütleb (nt fibroblastid vs epiteelirakud)? Rakkude arv eri päevadel 10. Rakkude elulemus, elulemuse %-i arvutamine. Elumus: elus/ surnud. Elumuse % = elumus *100% 11. Töö rakkudega: kultuuride harvendamine (suspensioonis kasvav vs kinnituvad rakud) Suspensioonis kasvavad rakud: suspensioon tsentrifuugitakse, sööde pealt, lisada uus sööde ja jagada
nõrgast alusest ja temaga konjugeeritud happest. Puhverlahus moodustub kui nõrk hape on osaliselt neutraliseeritud tugeva aluse poolt või nõrk alus tugeva happe poolt. Puhverlahuse tekke tõttu on nõrkade hapete ja aluste tiitrimiskõverad erinevad tugevate hapete või aluste omadest Puhverlahuste pH avutamine-Nõrga happe ja sellega konjugeeritud aluse puhver HA +H2O = H3O+ + A A- + H2O = OH + HA Henderson-Hasselbalchi võrrand-pH = pK + logCNaA/CHA Puhverlahuste omadused- lahjenduste mõju:Lahuse pH praktiliselt ei muutu lahjendamisel tugevate hapete ja aluste lisamise mõju: happe aluse lisamisel pH muutub vähe puhvermahtuvus:tugeva happe või aluse moolide arv, mis muudab ühe liitri lahuse pHd 1 ühiku võrra. Sõltub puhverlahuse komponentide konsentratsioonist. Konsentratsioonide suhetest. Nõrkade hapete tiitrimiskõverad tugeva alusega- Karbonaatide tiitrimiskõverad- NaCO3+HCl
10X lahjendus 0,00513 2,36 0,00437 0,851 100X lahjendus 0,000513 3,28 0,00052 1,02 5 100X lahjendus 0,000513 3,39 0,00040 0,794 +KCl (katse 4.4) 7 Arvutada aktiivsused kasutades alglahuse, 10 ja 100 X lahjenduste pH ning võrrelda seda mõõdetud pH tulemusega. Aktiivsustegurid vt. vajadusel tabelist Lisa 1. HCl = H+ + Cl- I 1 2 C1 z12 C 2 z 22 .... C n z n2 1 I 0,0513 1 0,0513 1 0,0513 0,05 2 1) H 0,840 a H 0,840 0,0513 0,043092 pH log 0,043092 1,37 1
4. Pärast fuugida 3 minutit, et lahusesse jäid valgud ja sadenesid membraanid ja nukleiinhapped. Teha oma proovidest uude epsi 2x lahjendus lüüsipuhvriga (selleks pipeteerisin 15 μl lüsaati ja 15 μl puhvrit kokku). 5. Mõõdame saadud lüsaatide kontsentratsioonid BSA kitiga. 108. 109. BSA lahjendusterea ettevalmistamine 110. BSA standardlahuse kontsentratsioon on 2 mg/ml. Sellest tuleb teha 2x lahjenduste rida: 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0 mg/ml ehk puhas MQ. 1. Panna ritta kuus epsi, kirjutada peale vajalikud kontsetratsioonid (esimene on 2 mg/ml). 2. Pipeteerida igasse epsi 50 μl MQ. 3. Esimesse epsi lisada 100 μl alglahust (konts-ga 2 mg/ml). 4. Teisse epsi lisada esimesest epsist 50 μl. Suspendeerida korralikult 5 korda. Saadud lahuse kontsentratsioon – 1 mg/ml. 5. Järgmisesse epsi lisada teisest epsist (sama otsikuga) 50 μl lahust. Jälle suspendeerida 5
Pärast tsentrifuugida 3 mint, et lahusesse jäid valgud ja sade koosneks membraani komponendidest ja nukleiinhappetest Teha proovidest uude epsi 2x lahjendus lüüsipuhvriga (selleks pipeteerida 15 μl lüsaati ja 15 μl puhvrit kokku) Mõõta saadud lüsaatide kontsentratsioonid BSA kitiga BSA lahjendusterea ettevalmistamine BSA standardlahuse kontsentratsioon on 2 mg/ml. Sellest tuleb teha 2x lahjenduste rida: 1 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0 mg/ml ehk puhas MQ. Panna ritta kuus epsi, kirjutada peale vajalikud kontsetratsioonid (esimene on 2 mg/ml). Pipeteerida igasse epsi 50 μl MQ. Esimesse epsi lisada 100 μl alglahust (konts-ga 2 mg/ml). Teisse epsi lisada esimesest epsist 50 μl. Suspendeerida korralikult 5 korda. Saadud lahuse kontsentratsioon – 1 mg/ml. Järgmisesse epsi lisada teisest epsist (sama otsikuga) 50 μl lahust
4. Pesta 2 korda 5 minutit 1 ml PBSiga. 5. Pesta 1 kord 1 ml milliQ (destilleeritud) veega. VI Alusklaasidele panemine ehk sulundamine 1. Kirjuta alusklaasile oma nimi ja kuupäev, samuti kasutatud antikeha. 2. Pigistada tuubist alusklaasidele väike tilk DAPIga sulundamislahust. 3. Võta katteklaas pintsettide vahele ja kuivata serv vastu pehmet paberit. 4. Aseta katteklaas (rakud allpool !!!) sulundamislahuse tilga sisse (väldi mulle). 5. Lasta kuivada ja säilitada pimedas. b. Lahjenduste tegemise arvutused: 1) Primaarse antikeha lahjendus: Vaja on 400 µl lahust, kuna meil on 2 klaasi, kummagi kohta 200 µl. 2% BSA tuleb lahjendada 0,2%, seega tuleb lahjendada 10x, 10% lahusest peab olema BSA, seega tuleb võtta 400/10=40 µl. Antikeha peab olema 1:500, seega tuleb lahjendada 500 korda, seega 400/500=0,8 µl. 2) Sekundaarse antikeha lahjendus: BSA lahjendus sama, mis primaarse antikeha puhul. Antikeha peab olema 1:2000, seega tuleb lahjendada 2000 korda, 400/2000=0,2 µl. c
toiduainete aeroobset riknemist, ning 55 °C juures anaeroobselt kasvavate, konser- veeritud lihatoodete termofiilset riknemist põhjustavate bakterite loendamist. 3.4. MIKROORGANISMIDE LOENDAMINE Otsekülvamise meetodid. Nende meetodite põhimõtteks on üle lugeda pesa moodustavate ühikute (CFU colony forming units) arv, mis võib koosneda kas ühest või mitmest organismide kogumist. Meetod eeldab suspensioonilahuse olemasolu ja seeria kümnekordsete lahjenduste tegemist ning lahjenduste kandmist agarplaatidele. Pärast inkubatsiooni otsitavate mikroorganismide jaoks ettenähtud 37 temperatuuridel loendatakse iseloomulike tunnustega kolooniad. Tõelise (proovis tegelikult esindatud) CFU numbri saab tuletada loendatud kolooniate arvust, arvestades inokulaadi mahtu ning lahjendusastet. Seda meetodit kasutatakse
sama ainehulk, st kehtib võrrand 89 Cst Vst = Clahj Vlahj , kus Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. Seega võimaldab toodud võrrand arvutada lahjenduse tegemiseks vajaliku standardlahuse mahu, kui on teada lahjendatud lahuse vajalik maht (antud töös reeglina 10, 15 või 20 ml). Lahjenduste (= lahjendatud glükoosilahuste) valmistamiseks võetakse kolm puhast, kuiva standardset või kalibreeritud (jaotustega) katseklaasi, kuhu pipeti abil mõõdetakse eelnevalt väljaarvutatud kogus glükoosi standardlahust. Destilleeritud vett lisatakse sobiva mahuga pipetiga niipalju, kui on vajalik lahuse lõppmahu (10 ml, 15 ml vm) saavutamiseks. Kalibreeritud katseklaaside puhul pole destilleeritud vee lisamiseks vaja kasutada pipetti, vaid vett lisatakse pesupudelist kuni vastava mahuni
remodeling. Hetkel on kasutusel ainult üks MMP inhibiitor – doxycyclin (Periostat), mida kasutatakse periodontiidi ravis. Lisaks on kasutusel ka ravimid, mis aktiveerivad ECMi lõhkuvaid proteaase. nt urokinaas ja streptokinaas aktiveerivad seriinseid proteaase (plasmiini) ja on kasutuses ägeda müokardi infarkti, kopsude trombemboolia jt haiguste puhul, kus trombide lõhkumine aitab taastada verevarustust. 126. Kontsentratsioonide arvutused, lahjenduste tegemine. Lahjendus – aine kontsentratsiooni vähendamine lahuses. Põhiline on c1 x v1 = c2 x v2. 127. Bradfordi meetod Coomassie Brilliant Blue (CBB) – värvaine, millest valmistatud lahus on tavaoludes eresinine ning neelab valgust 595 nm peal. Tugevalt happelises keskkonnas seevastu moodustub kolloidlahus, kus selle tavaline värvus kaob, molekuli neeldumismaksimum nihkub 595 nm pealt 465 nm peale ning lahus omandab punakas-pruuni värvuse.
µg/ml): - võtke 4 viaali, nummerdage need ja pipeteerige igasse neist 1 ml destilleeritud vett; - lisage 1. viaali 1 ml standardlahust ja segage hoolikalt mikseril; - võtke 1. viaalist 1 ml lahust ja viige 2. viaali. Segage hoolikalt viaali sisu; - võtke 2. viaalist 1 ml lahust, viige see 3. viaali ja segage viaali sisu hoolikalt; - võtke 3. viaalist 1 ml lahust, viige see 4. viaali ja segage hoolikalt. Nii saitegi valgulahuse lahjenduste rea 1:2, 1:4, 1:8 ja 1:16. Standardgraafiku konstrueerimine ja valgu kontsentratsiooni määramine 1) Võtke 6 viaali, nummerdage need ja pipeteerige lahused, järgides alltoodud skeemi: Lahused, reaktiivid Viaalid (pipeteeritava lahuse ruumala, ml) 1. 2. 3. 4. 5. 6.
annaabi.ee 
