DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva
4.See oli hiir, kellel oli kasvuhormoon rotilt. Sündis 1981.aastal. 6. Geenivektor on DNA või RNA konstrukt, milles see geeni, mida tahetakse siirata, on ühendatud teiste, normaalsete geenidega. Sellepärast suudab see tungida siirdamiseks kasutatava organismi rakku ning lõimuda seal oleva DNA-ga, nii et rakus tekib inimesele vajalik DNA konstrukt. Kuidas tehakse: a) Bakterist võetakse plasmiid välja (see on rõngasjas kromosoom). Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga. d) Lõimumiskohta töödeldakse ligaasiga
lõigud omavahel kovalentsete sidemetega kokku tekib vesiniksidemed. 4. Ensüüm rekombinantne DNA molekul. ligaasi abil ühendatakse eri Plasmiidne päritolu DNA lõigud omavahel geenivektor(TAIM):1. kovalentsete sidemetega kokku Restriktaas lõikab DNA lahti tekib rekombinantne DNA kindla järjestuse kohalt. 2. sama restriktaasiga lõigatakse molekul. välja siiratavat geeni sisaldav Plasmiidne DNA osa. 3. plasmiid ja DNA geenivektor(TAIM):1. osa segatakse kokku; Restriktaas lõikab DNA lahti ,,kleepuvad" otsad ühinevad. 4.DNA ühendatakse ligaasiga kindla järjestuse kohalt. 2. sama töötlemisel.(bakter võtab restriktaasiga lõigatakse välja
eemaldatud. Seejärel siirdati embrüorakk emalambale. 6.Geenivektor on DNA või RNA konstrukt, milles see geen, mida tahetakse siirata, on ühendatud teiste, normaalsete geenidega. Sellepärast suudab see tungida siirdamiseks kasutatava organismi rakku ning lõimuda seal oleva DNA-ga, nii et rakus tekib inimesele vajalik DNA konstrukt. Kuidas tehakse: a) Bakterist võetakse plasmiid välja (see on rõngasjas kromosoom). Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga. d) Lõimumiskohta töödeldakse ligaasiga
Lõigatakse DNA ahel lahti, siiratakse vajalik geen . 3. Kas punktis 3 asuv bakter on transgeenne? Jah 4. Millistes punktides (a, b, c, d, e) asuvad taimed on transgeensed? C, d, e 5. Millega on tegemist punktis b? Meristeemkoe rakud kasvusöötmel I 2. 1. 3. a b c d e Joonis II 1. Mida tehakse punktides 1 ja 3? 1. Restriktaasiga lõigatakse DNA lahti; 3.siiratakse DNA lõik 2. Mida tehakse punktides 2 ja 4? 2. Sobiv geen lõigatakse välja; 4. Ühendatakse DNA ligaasiga 3. Milleks kasutatakse loodud geenivektorit? Et erinevaid geene erinevatele organismidele ülekanda 4. Kas loodud geenivektor on rekombinantne? Jah 5. Mis põhimõttel ühinevad ,,kleepuvad otsad"? Komplementaarsuse prentsiibil II 1. 2. 3. 4. Joonis III 1
siirdega rakud kloonitakse ja paljundatakse ning siirdatakse tagasi haigesse indiviidi. Esimene edukas geenravi op. tehti 1990.a USA-s kaasasündinud immuunpuudulikkusega lapsele. RESTRIKAAS- omapärane ensüüm, mis lõikab DNA kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Bakterid sünteesivad neid, et end kaitsta end erinevate viiruste sissetungi eest, need lõikavad viiruse dna tükkideks enne kui see jõuab rakku kahjustada.(Restrikaas lõikab DNA lahti kindla järjestuse kohalt. Sama restriktaasiga lõigatakse välja siiratavat geeni sisaldav DNA-fragment. Plasmiidid ja DNA-fragment segatakse kokku; "kleepuvad otsad" ühinevad. DNA ühendatatkse ligaasiga töötlemisel. ) LIGAAS- ensüüm, mille toimel ühinevad ahelate otsad ka kohalentsete sidemetega ja lõpetab rekombinantse molekuli moodustumise. GEENITEHNOLOOGIA RAKENDUSe eesmärgiks on välja lülitada mutantseid geene. "Sundida geene organismis tootma liiga vähe olevaid aineid."Panna neid kiiremini tööle. GEENI NOKAUT-nim
17.Geenivektor - DNA või RNA konstrukt, milles see geeni, mida tahetakse siirata, on ühendatud teiste, normaalsete geenidega. Sellepärast suudab see tungida siirdamiseks kasutatava organismi rakku ning lõimuda seal oleva DNA-ga, nii et rakus tekib inimesele vajalik DNA konstrukt. Kuidas tsaadakse: a) Bakterist võetakse plasmiid välja (see on rõngasjas kromosoom). Plasmiidi töödeldakse restriktaasiga (see on see aine, mis lõikab DNA-d), mis lõikab plasmiidi kindla koha pealt katki. Plasmiidi lõigatud otsad on üheahelalised ja kleepuvad. b) Võetakse DNA. Seda töödeldakse sama restriktaasiga, mille tagajärjel lõigatakse DNAst üks lõik. Ka selle DNA lõigu otsad on üheahelalised ja kleepuvad. c) DNA lõik ja plasmiidi pannakse kokku. Kuna mõlemad on lõigatud sama järjestuse kohalt, siis DNA lõik lõimub plasmiidiga.
geneetilisse struktuuri - lähtekohaks rekombinantse DNA metoodika loomine - rekombinante DNA-DNA molekul,milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid - restriktaas-ensüümid,mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järejestuste kohalt - enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse(4-8 nukleotiidipaari) eri otstest - kui sama restriktaasiga töödekda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised(nn kleepuvad) otsad - kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad - lõigatakse katki kahte moodi: 1. tekivad kleepuvad otsad-DNA ahelale jäävad ühe ahelalised otsad Kahe erineva DNA kokkupanemine toimub kleepuvate otste abil, ahelate seostumiseks läheb vaja ligaasi 2. tekivad tömbid otsad
). Väga kergesti kleepuvad omavahel: aitavad bakteriofaagile moodustada rõbjast struktuuri. 2. Mis rolli mängib DNA metüleerimine restriktsiooni analüüsis? Metüleerimise abil kaitstakse DNA restriktsiooni eest. Nii nt.kaitseb E.coli oma genoomset DNA enda poolt toodetud restriktaaside eest. Sellega võib manipuleerida: välja lülitada kloonimisel, et oleks võimalik DNA lõikamist restriktaasiga selleks, et sinna ehitada huvipakkuva DNA järjestust. 3. Võrdle omavahel järgnevate E.Coli ensüümide omadusi. DNA polümeraas I Klenow fragment Sequenase Taq polümeraas 5' 3' DNA-sõltuv polümeraasne aktiivsus DNA polümeraasi ,,mutantne" vorm. 5' (on vaja praimeri) 3' polümeraasne aktiivsus. 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus (DNA parandamine) DNA sünteesil
3. Geenivektor, selle loomise protsess, ligaas, restriktaas (ja tekkivad „kleepuvad otsad"), rekombinantne DNA. Õp lk 37 – 39. Plasmiid. Viirusvektor, plasmiidne geenivektor. - õp lk 38. Rekombinantne DNA- DNA molekul, milles ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid. RESTRIKTAAS- ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (kleepuvad otsad). Kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis paardumisel nad ühinevad. LIGAAS- selle ensüümi toimel ühinevad ahelate otsad ka kovalentsete sidemetega ja rekombinantsed molekulid ongi moodustunud. GEENIVEKTOR- ehk siirdaja, DNA konstrukt. Kui soovitud geen on välja lõigatud, ühendatakse ta selisesse DNA-sse, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi.
Ta sündis 1981. Mille poolest oli eriline lammas Polly ? Lammas Polly (ja Molly) oli esimene tuumkloonitud ning samal ajal ka transgeenne imetaja. Lammas Dolly oli esimene edukas tuumkloonitud imetaja. Mida nimetatakse geenivektoriks ja kuidas seda tehakse ? Geenivektor on siiratav geen ühendatud sellisesse DNA- või RNA-kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Plasmiidi ja DNAd töödeldakse sama restriktaasiga, et lõigata need katki samasuguse nukleotiidjärjestuse kohalt. Saadud DNA lõik liidetakse plasmiidiga ligaasi abil ning rekombinantne plasmiidne geenivektor on loodud. Mille poolest erineb embrüonaalkloonimine tuumkloonimisest ja mis tekitas tugeva eetilise vastuseisu tuumkloonimisele ? Embrüonaalkloonimine seisneb embrüote lõhestamises. See on loomuliku protsessi tehnoloogiline teisend ning kõik lõigustusrakud on võimelised arenema normaalseks tervikorganismiks
restriktaaside loikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult uks kord). Vajalik DNA-loik uhendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes luhikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pohietapid on jargmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "loikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni voi DNA-loigu "valjaloikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille kaigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. Teiseks DNA kloonimise voimaluseks on polumeraas-ahelreaktsiooni (PCR-polymerase chain reaction) kasutamine. PCR viiakse labi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei
näpunäiteid. 2 Lisaülesanded (teoreetilised): 1.1) Vaata Fermentase kataloogist, milline on Cfr42I jaoks kõige sobivam puhver (viie puhvri süsteemis). Millistes puhvrites see ensüüm veel töötab? Lisaks tutvu kataloogis olevate tingmärkidega (millisel temperatuuril ensüümid töötavad, kuidas neid inaktiveeritakse, milline on antud restriktaasiga lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus jne). Kõige sobivamad on puhver B, G ja Tango. Ensüümid töötavad 37 kraadi juures, inaktiveeruvad 65 kraadi juures, efektiivsus 95%, tundlik CpG metülatsioonile. 1.2) Kui restrikteerimiseks kasutada üheaegselt kahte erinevat ensüümi (näiteks Cfr42I ja PstI), siis milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)?
5. Mis on plasmiid? Plasmiid on kaksikspiraalne DNA rõngasmolekul, mille molekulmass varieerub küllaltki 125 suurtes piirides. Plasmiidid asuvad vabalt tsütoplasmas või on liitunud kromosoomiga. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasigas.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid?
See muudab ka aminohapet E asemel sünteesitakse A. 8.a) Kloneerimiseks tuleb vektorit ja inserti lõigata, tekitades komplementaarsed kleepuvad otsad, seejärel tuleb otsad kokku ligeerida. i. Restriktaasidest võiks kasutada EcoRI ja BamHI-d, et saada vektorile ja inserdile sobivad ,,kleepuvad otsad". Ainult EcoRI-st ei piisa, kuna inserdil on vaid üks EcoRI lõikamissait ühte otsa tuleb töödelda mingi teise restriktaasiga, BamHI sobib kõige paremini, kuna lõikab pärast kodeerivat järjestust. Kuna inserdi algus ja lõpp on erineva restriktaasiga lõigatud, siis see kindlustaks ka selle, et insert siseneb vektorisse õiget pidi. Puhvritest oleks restriktsioonil kõige optimaalsem kasutada sama firma poolt müügilolevat spetsiaalset EcoRI ja BamHI puhvrit, ligeerimisel ligeerimispuhvrit. ii. Jälgida tuleb, et lugemisraam ühtiks sisestatava valku kodeeriva järjestuse
e) ATP, CTP, GTP ja TTP 19. Kuriteopaigalt avastatakse verine nuga, mille külge on kleepunud paar juuksekarva. Millist meetodit kasutatakse juuksekarvast pärineva DNA paljundamiseks, et saada seda uurimiseks piisavas koguses: a) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) b) DNA kloonimist plasmiidi ja paliundamist bakterite abil c) DNA keemiline süntees d) Western blot 20. Milline järgnevatest ensüümidest hoiab ära restriktaasiga avatud vektorplasmiidi retsirkulatsiooni kloonimise käigus: a) Veise soole fosfataas (calf intestine phosphatase-CIP) b) T4 DNA ligaas c) DNA polümeraas I Klenowi fragment d) Taq DNA polümeraas e) AMV pöördtranskriptaas Kontrolltöö 2. 1. Milliseid eelteadmisi on vaja meid huvitava ensüümi omaduste muutmiseks ratsionaalse (re)disani meetodil? a) Ensüümi aktiivtsentri ja toimemehhanismi tundmine
üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. (vt. ka fail) 42. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 43. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 40. DNA kloneerimine DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 41. DNA sekventeerimine DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
Mis on plasmiid? Plasmiid – autonoomselt replitseeruv DNA rõngasmolekul. Sisaldab replikatsiooni alguspunkti, selektiivset markerit (ampitsilliiniresistentsuse geen) ja unikaalseid restriktaaside lõikesaite. Suurus varieerub 1-400 kbp. Identseid plasmiide võib olla 0-tuhandeid. Insenerigeneetikas nim plasmiide vektoriteks. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. 1. plasmiid isoleeritakse bakterirakust (E. coli) 2. plasmiidi lõigatakse kindla restriktaasiga 3. sama restriktaasiga lõigatakse huvipakkuv DNA lôik kromosoomist välja 4. isoleeritud DNA lõik "istutatakse" plasmiidi 5. plasmiid viiakse bakterirakku, bakter kasvab ja plasmiid paljuneb 6. paljundatud geen isoleeritakse plasmiidist. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid? Kasutatakse uuritava DNA lõigu paljundamiseks in vitro.Geenide polümorfismi detekteerimine.
Geenitehnoloogia lähtekohad *Rekombinantse DNA metoodika loomine -See on DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidest pärit DNA-lõigud -See on võimalik tänu ensüümidele (restriktraasid) mis lõikavad DNA-molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. -Teised ensüümid (ligaasid) ühendavad ahelate otsad Enamik restriktaase lõikab DNA eri ahelaid vastava järjestuse (4-8 nukleotiidipaari) eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda eri päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (nn. ,,kleepuvad") otsad. GMO - geneetiliselt muundatud organismid 1.Organismid, kelle genoomi on siirdatud mõne võõrliigi geene, mis neis organismides avalduvad ja päranduvad ka järglastele. Neil organismidel ilmneb üks või mõni uus, mingile liigile omane tunnus. 2.Rikutakse mingi kindla geeni struktuuri suunatud mutatsiooni abil. Kaotatakse tema funktsioon
Eri päristolu lõigud viiakse lahuses kokku ja nad ühinevad komplementaarsuse alusel, kleepuvate otste vahele tekivad vesiniksidemed. Ensüüm ligaasi abil ühendat eri päritolu lõigud kovalentsete sidemetega, tekib rekombinantne DNA molekul. Bakterid kaitsevad end sedasi viiruste eest. 46. DNA kloneerimise etapid. 1)DNA lõigatakse restriktaasi abil fragmentideks ja segatakse bakterite plasmiididega, mis on lahti lõigatud sama restriktaasiga 2)Iga plasmiid ühineb võõra fragmendiga. Ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad 3)Bakterid võtavad rekombinantsed plasmiidid endasse, saadakse kloonbakterite kogumid 4)Kolooniad eraldatakse. Siiratud fragment(DNA) paljuneb koos bakteritega, saadakse DNA-pank. 47. Mis on cDNA? Kodeeriv DNA e eksonid. Paiknevad eukarüootide geenis vaheldumisis intronite e mittekodeerivate aladega. Neis oleva
1. Võetakse munarakk ja tuumadoonori keharakk 2. Munarakul tuum eemaldatakse 3. Munarakk ja tuumadoonori keharakk liidetakse elektriimpulsiga 4. ,,Vegetatiivse" sügoodi areng kultuuris 5. Embrüosiirdamine surrogaatemale 6. Kloonitud organism on geneetiliselt identne tuumadoonoriga Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA- fragmendid. Restriktaasiga lõigatakse lahti ja ligaasiga ühinevad ahelate otsad kovalentse sidemega. GMO geneetiliselt muundatud organism Transgeenne organism isendi genoomi on siirdatud võõrliigi geene Geenivektor siirdajad. Rekombinantne geenivektor sisaldab siiratavat geeni Transgeensed imetajad toodavad piimas või veres inimese ravivalke või toidulisandeid Transeegnsed taimed: Parandada saaduste tarbekvaliteeti Suurendada vastupidavust haigustele ja kahjurputukatele
nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. 37. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
vältimiseks. Nii näiteks sisaldavad plasmiidid geene, mille põhjal sünteesitud valgud võimaldavad bakteritel elada antibiootikumide keskkonnas. DNA kloneerimise etapid. DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. DNA sekveneerimine. DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
põhiomaduseks on tungida peremeesrakkudesse ning pärmseeni, mis toituvad orgaanilisest ainest. Peale paljunevad nad väga kiiresti. GMO loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada mikro organismi DNA või RNAga. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geeni vektoriteks ehk siirdajateks. Vaatleme plasmiidse geenivektori saamist. Plasmiid on baketeris. See on DNA väike rõngas. 1) Restriktaas lõikab selles DNA lahti. 2) Sama restriktaasiga lõigatakse lõik inimese genoomist. Need ühinevad komplentaalselt. 3) Plasmiid ja DNA konstrukt segatakse kokku, kleepuvad otsad ühinevad. Nii saadakse lõppkokkuvõttes plasmiidne geenivektor, mis omakorda sisestatakse bakterorganismi. Tänu sellele tehnikale on võimalik luua DNA panku. Need osutuvad vajalikuks teaduslikel eesmärkidel. Nendest bakteritsest saab alati eraldada DNA lõike. Tänapäeval on teada, et terve DNA sisaldab kodeeritavaid lõike ehk eksoneid ja mitte
(Joonis 1). Rekombinantseks DNA-ks nimetatakse DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärist DNA-fragmendid. Selle metoodika eelduseks oli omakorda restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites 1970. aastal. Need on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse (4-8 nukleotiidipaari) eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (nn. kleepuvad) otsad. Kui need fragmendid kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad. Ensüüm ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad ka kovalentsete sidemetega ja rekombinantsed molekulid ongi moodustunud. Geenitehnoloogiad võimaldavad otseselt muuta indiviidide pärilikke omadusi. Tähtsaimad rakendused selles valdkonnas on transgeensete organismide (nn. GMO)
Minu rada: 5 Milleks teostatakse kontroll-restriktsioon? Et kontrollida, kas eraldatud plasmiid on õige Millise tulemuse sain kontroll-restriktsioonist? Minu tulemus on väga ilus, eraldatud plasmiid tuli õige. Mille järgi valisime sobiva restriktaasi? Veel sobivaid restriktaase. Valisime EcoRI restriktaasi, kuna meie insert sisenes pSTBlue-1 vektorisse EcoRV saiti. Mõlemalt pool enne seda saiti on EcoRI sait. Seega oli väga hea valita just see restriktaas, saime mõlemalt poolt ühe restriktaasiga lõigatud ja vee täpselt väga lähedalt. Võiksime valida ka muud restriktaasid, nt PstI ja HindIII aga see oleks tülikas, kuna me ei eraldaks ainult meile huvipakkuvat fragmenti ja peaksime puhvritega jändama, kuna iga restriktaasi jaoks on erinevat soolakontsentratsiooni vaja. Mida silmas pidada kui kasutada mitut erinevat restriktaasi korraga? Millised lõikamiseks sobivad tingimused võivad erineda? Peame vaatama, mis puhvrit kasutame. Erinevatel restriktaasidel on erinevaid
nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad". Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. 37. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise – selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega. Paljude restriktaasidega lõikamise tulemusel tekivad DNA fragmendid, mille otstes on lühikesed, 2 4 nukleotiidi pikkused üheahelalised alad. Neid nimetatakse kohesiivseteks e kleepuvateks otsteks, kuna nad võivad paarduda teiste sama restriktaasiga lõigatud DNA üleulatuvate otstega. Mõned restriktaasid tekitavad 5' (EcoRI), teised 3' (PstI) üleulatuva otsaga fragmente. On ka restriktaase, mis tekitavad tömpotsalisi fragmente (SmaI). 44. DNA kloneerimise etapid. bläblä 45. DNA sekveneerimise põhimõte. Erinevad DNA molekulid liiguvad erineva kiirusega ja siis mingi lahe süsteem oli. http://www.biotech.ebc.ee/praktikum/juhend3.html 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. Äö, praimerid ja värk! Pannakse vajalik(
15 oC). Inkubeerimisaegadel lahendada allpool toodud lisaülesanne, vt lisamaterjale ja kuula juhendaja näpunäiteid. 2 Lisaülesanded (teoreetilised): 1.1) Vaata Fermentase kataloogist, milline on Cfr42I jaoks kõige sobivam puhver (viie puhvri süsteemis). Millistes puhvrites see ensüüm veel töötab? Lisaks tutvu kataloogis olevate tingmärkidega (millisel temperatuuril ensüümid töötavad, kuidas neid inaktiveeritakse, milline on antud restriktaasiga lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus jne). Kõige sobivam puhver viie puhvri süsteemis Cfr 421 jaoks on : B(blue) 100 ja Tango (yellow) 50-100. Ensüüm veel töötab G(green) puhvris. Ensüümid töötavad 37 kraadi juures,lõigatud fragmentide ligeerimise efektiivsus on 95%. 1.2) Kui restrikteerimiseks kasutada üheaegselt kahte erinevat ensüümi (näiteks Cfr42I ja PstI), siis milliseid puhvreid oleks kõige mõistlikum kasutada (vt Fermentase kataloogist restriktaaside tabelist)
8. Pipeteerisin sademele 200 μl 70% EtOH, fuugisin 5 min jooksul, et vabaneda sooladest, ning eemaldasin jälle sademe pealt etanooli. 9. Asetasin sadet kuivatada, et vabaneda etanooli jääkidest. Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s. 58. Nüüd DNA on puhas kontrolliks. 59. 60. 61.Kontroll-restriktsioon 62. Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1. Kontroll-restriktsiooni teostamiseks esmalt pipeteerisin kokku 5,5 μl vett, 3 μl puhastatud
min RT ja eemaldasin supernatant (ettevaatlikult!) Kuivatasin DNA sade läbipaistvaks, et vabaneda ka etanooli jääkidest Suspendeerisin 20 µl MQs 6.2 Praktikum – Kontroll – restiktsioon Kontroll teostatakse selleks, et kontrollida DNA juppide suuruste järgi, et aru saada, kas välja puhastatud plasmiid on õige. Selleks lõikame restriktaasiga inserdi vektorist. Pipeteerisin kokku 5,5 µl vett, 3 µl puhastatud plasmiidset DNA-d, 1 µl restriktaasi x10 puhvrit ja 0,5 µl EcoRl restrikaasi Segasin, fuugisin ja inkubeerisin 30 min 37 C juures, ning pärast fuugisin veel kord, et koguda kogu kondansaat Lisasin 2 µl 6x DNA värvi ja pipeteerisin segu agaroosgeelile ja sain järgmist pilti:
vahelist sidet ehk fosfodiestersidet ahelasiseselt, mitte otstest. Restriktaase toodavad bakterid. Restriktaasid on järjestusspetsiifilised. 44. DNA kloneerimise etapid. 1. Lõigatakse nii vektorit B-saidis(vektoriteks kasutatakse tihti plasmiide) kui ka uuritavat DNA- d retriktaasiga, mis genereerib "kleepuvad" otsad. (kui nii kloneerimisvektori DNA-d kui ka kloneeritavat DNA-d on lõigatud ühe ja sama restriktaasiga, saame klonerimisvektoi otste vahele "kleepida" uuritava DNA lõigu. Fosfodiestersidemete moodustamiseks kloneerimisvektori DNA ja uuritava DNA lõigu otse vahele kasutatakse ensüümi DNA ligaas) 2. DNA fragment kleebitakse vekroti B-saiti 3. Uus konstrukt viiakse bakterirakkudesse. 45.DNA sekveneerimise põhimõte. DNA nukleotiidse järjestuse määramine.Põhineb DNA fragmentide populatsiooni analüüsil, kus kõik
omane tunnus. Transgeensed mikroorganismid. Transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA või RNA kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geenivektoriteks ehk –siirdajateks. (Plasmiidse geenivektori tegemine. Restriktaas lõikab plasmiidis DNA lahti kindla järjestuse kohalt. Sama restriktaasiga lõigatakse välja siiratavat geeni sisaldav DNA-fragment. Plasmiid ja DNA-fragment segatakse kokku, ”kleepuvad otsad” ühinevad. DNA ühendatakse ligaasiga töötlemisel.). Kuna niisama lihtsalt ei ole võimalik inimese geene bakteri plasmiidi sisestada, kasutatakse selleks ensüüm transkriptaasi. Eraldatakse huvipakkuvast geenis mRNA ja pöördtranskripeeritakse selle järgi vastav komplementaarne DNA. See
baketerite plasmiide vôi viiruseid- bakteriofaage. Vajalik DNA-lôik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes lühikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. 50 Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. Joonis. Kloonimine plasmiidi abil Teiseks DNA kloonimise vôimaluseks on polümeraas-ahelreaktsiooni (PCR- poly- merase chain reaction) kasutamine.
kaitsemehhanismiks. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid DNA järjestusi ja järjestusega seondumise järel lõikavad DNA ahela katki. Näiteks tunneb tuntumaid sedalaadi ensüüme EcorI DNA ahelas spetsiifiliselt ära järjestuse GAATTC, seondub ning lõikab DNA G ja A nukleotiidide vahelt katki. Kuna DNA koosneb kõigis organismides samadest nukleotiididest, on restriktaase võimalik kasutada ka imetajate genoomi analüüsimiseks. Restriktaasiga töödeldud DNA ahelast tekkinud erineva pikkusega fragmendid lahutatakse teineteisest geelelektroforeesi (vt allpool) abil. Sel moel on võimalik teha indiviiditi kindlaks, kas vaadeldud piirkonnas esineb indiviidide vahel erinevusi. Mõnel juhul on neil väikestel erinevustel väga suur mõju konkreetse indiviidi fenotüübile. Näiteks on võimalik tuvastada inimese vastuvõtlikkust HIV-ile (ühele tüvele), kuidas inimene tunneb viiendat põhimaitset – umamit, sugulusastet jne. 138
7. kromosoomi. Kasutades mõlemal pool geeni paiknevaid RFLP-e kloneeriti geen, mille produkt oli siis veel tundmata Kui mutatsioon DNA-s on tekkinud restriktaasi lõikesaiti, siis seda järjestust restriktaas enam ei lõika. Mutatsioonid võivad muuta DNA järjestust ka nii, et tekivad uued restriktaaside lõikesaidid. Seega põhjustavad mutatsioonid DNA restriktsioonifragmentide mustris erinevusi, kuna võrreldes algse DNA-ga tekib mutatsioone sisaldava DNA lõikamisel mingi kindla restriktaasiga teistsuguse pikkusega fragmente. Nii võib erinevatest isolaatidest pärinev DNA olla DNA restriktsioonanalüüsi põhjal restriktsioonisaitide suhtes polümorfne erinevate isolaatide puhul tekivad erineva pikkusega restriktsioonifragmendid. Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismi RFLP-d on võimalik detekteerida näiteks "Southern blot" analüüsil. DNA restrikteeritakse, fragmendid lahutatakse geelelektroforeesil, kantakse filtrile ja
annaabi.ee 
