YKL3312 Biokeemia - praktikum Laboratoorse töö nr ja pealkiri 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Õpperühm: Töö teostaja: Matriklinumber: Teoreerilied alused. Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib , D fruktofuranoosiide hüdrolüüsi: , D fruktofuranoosiide + H2O alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, aga ka paljud taimed. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisele uuuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisele reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel. Glükoosi ja fruktoosi koguse kinladktegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit.
Laboratoorne töö 3. Biokatalüüs 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Tallinn 2010 3.BIOKATALÜÜS 3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE TEOREETILISED ALUSED Invertaas ehk sahharaas on ensüüm , mis katalüüsib , D fruktofuranoosiide hüdrolüüsi: , D fruktofuranoosiide + H2O alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, aga ka paljud taimed. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisele uuuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisele reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel: Glükoosi ja fruktoosi koguse
Õpperühm: YAGB22 Õppejõud: MALLE KREEN Töö teostatud: 12/04/2010 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.1.) TEOORIA Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib ,D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavlt skeemile: ,D-fruktofuranosiid + H2O alkohol + fruktoos. Ensüüm võib katalüüsida ka fruktoosijäägi ülekannet. Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Invertaas, süstemaatilise nimetusega -D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas ehk lihtsamalt - fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib -D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule: Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D- fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Kaia Kukk Töö teostatud: 20.02.2013 Tallinn 2013 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.1.) Teooria Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib ,D-fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavlt skeemile: ,D-fruktofuranosiid + H2O alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb ,D-glükoosist ja ,D- fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed. Inimese seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisel reaktsioonisegus.
Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsi produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Sellepärast kasutataksegi invertaasi aktiivsuse määramisel tavaliselt substraadina sahharoosi. Tekkinud produktide kindlakstegemiseks kasutame kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Mis tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimid ta invertaasile mille pH = 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni ning tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Keetmisel taandub kompleksist Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mis keetmise toimel moodustab kompleksi naatriumiga ja tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega jällegi laguneb ning võimaldab Cu(II) ioonidega triloon B kompleksi taastekke. Töö käik
Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid. Antud töös kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi (valmistatakse kõrge konsentratsiooniga lahuses, võttes üks ühele hulga ja triloon-B). Antud reaktiiv täidab kahte rolli: · Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile mille pH 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni. · Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Taandavaid suhkruid sisaldav reaktsioonisegust võetud proov viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub , mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B
Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsi produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos. Sellepärast kasutataksegi invertaasi aktiivsuse määramisel tavaliselt substraadina sahharoosi. Tekkinud produktide kindlakstegemiseks kasutame kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Mis tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimid ta invertaasile mille pH = 4,8 inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni ning tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Keetmisel taandub kompleksist Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mis keetmise toimel moodustab kompleksi naatriumiga ja tiitrimisel 0,02M vasksulfaadi lahusega jällegi laguneb ning võimaldab Cu(II) ioonidega triloon B kompleksi taastekke.
läbiviimisega, mille põhjustab uuritav ensüümipreparaat. Reaktsioonisegus detekteeritakse vabandenud taandavad monosahhariidid glükoos ja fruktoos. Sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon invertaasi toimel: Reaktsiooduproduktid detekteeritakse komplektsomeetrilise meetodiga (põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi). Invertaasi toimeks on vajalik happeline keskkond, seega komplekslahus toimub invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetakse proovid (sisaldavad taandavaid suhkruid), neid keedetakse ja vask(II) taandub vask(I)-ks, moodustub Cu2O, see eraldub segust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid. 1 kat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30C juures 1 mol taandavat suhkrut
hüdrolüüsi läbiviimisega, mille põhjustab uuritav ensüümipreparaat. Reaktsioonisegus detekteeritakse vabandenud taandavad monosahhariidid glükoos ja fruktoos. Sahharoosi hüdrolüüsi reaktsioon invertaasi toimel: Reaktsiooduproduktid detekteeritakse komplektsomeetrilise meetodiga (põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, sisaldab vask(II)- triloon B kompleksi). Invertaasi toimeks on vajalik happeline keskkond, seega komplekslahus toimub invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab reaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetakse proovid (sisaldavad taandavaid suhkruid), neid keedetakse ja vask(II) taandub vask(I)-ks, moodustub Cu2O, see eraldub segust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Vabanenud triloon B kogus määratakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega tiitrides, indikaatoriks mureksiid. 1 kat on ensüümi hulk, mis produtserib 1 s jooksul 30C juures 1 mol
Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. 1 Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega,
hüdrolüüsil vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust
hüdrolüüsil vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO 4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust
Tekkinud reaktsiooniproduktide (glükoosi ja fruktoosi) kindlakstegemiseks kasutatakse nn kompleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)triloon B kompleksi. Kompleks moodustub CuSO4 ja triloon B ekvimoraalsete hulkade ühendamisel. Kuna invertaasi toimeks on optimaalne happeline keskkond, siis toimub reaktsiooniproduktide määramiseks vajalik leeliseline komplekslahus invertaasile inhibeerivalt ja lõpetab ensüümiraktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks, moodustades Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena ja lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus määratakse tiitrimisel 0,02 M vasksulfaadi lahusega, kasutades indikaatorina mureksiidi vesilahust. Tiitrimisel toimub reaktsioon, kus vabanenud
Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi (mittetaandav) hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi (taandavad) summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Lühidalt, oma sõnadega kirjutada, millel baseerub antud katses kompleksomeetriline meetod. Põhireaktiiviks on aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi, mis toimib invertaasile inaktiveerivalt (see lõpetab ensüümireaktsiooni) ning tagab ka taandavate suhkrute määramiseks vajaliku aluselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Hiljem (keetmisel) taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks (suhkrute toimel), Cu 2O eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille koguse saab määrata tiitrimise teel vasksulfaadi lahusega, kui vabanenud triloon B komplekseerub uuesti vasega (on märgatav mureksiidi värvuse muutuse tõttu). Töö käik
ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust.
kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoos on teatavasti mittetaandav disahhariid, glükoos ja fruktoos aga taandavad monosahhariidid. Antud töös kasutasin glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kompleksomeetrlist meetodit, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldas vask (II)-triloon-B kompleksi. Komplekslahus täidab aktiivsuse määramisel kaht rolli: 1. Tänu aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pH opt = 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümreaktsiooni 2. Tagab vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon-B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov viiakse kompleklahusesse. Kompleksis sisalduv Cu(II) taandub keemistemperatuuril Cu(I)-ks ja moodustub vask(II)oksiid. Cu2O eraldub punase sademena. Alles jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Vabanenud triloom-B kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kasutatakse
toimel ja vabanenud glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Kompleksomeetrilise meetodi põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi ning valmistatakse kõrge Na2Co3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja EDTA dinaatriumi soola (triloon B). See reaktiiv toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab leeliselise keskkonna taandavate suhkrute määramiseks. Komplekslahusesse viiakse kindlal ajahetkel võetud ning taandavaid suhkruid sisaldav proov. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja tekib punane Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust.
Selles töös kasutan komleksomeetrilist meetodit, kus põhireaktsiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. See valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola. See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kaht rolli: tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni; tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B
glükoos. Invertaasi preparaatide määramisel ka kasutatakse substraadina sahharoosi. Hüdrolüüsi käigus tekkinud glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemise meetodiks on kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kompleksi valmistatakse Na2CO3 lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades CuSO4 ja triloon B(ETDA-Na). Reaktiivi roll: · Toimib invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümreaktsiooni · Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-trioloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonist võetud proovi(sisaldab taandavaid suhkruid) viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandaub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(i)-ks. Moodustub Cu2O ja eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B. Keetmisel 2
, D-glükoos , D- fruktoos Glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks kasutasin kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiivis on selles meetodis tugevalt aluseline lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Sellel reaktiivil on käesoleva meetodi läbiviimisel kaks ülesannet: 1) ta lõpetab ensüümireaktsiooni, kuna toimub tugevalt aluseline reaktsioon, mis mõjub invertaasile inaktiveerivalt 2) ta tagab leeliselise keskkonna ja vask(II) triloon B kompleksi, mis on vajalik taandavate suhkrute määramiseks. Reaktsioonisegu, mis sisaldab taandavaid suhkruid peab kuumutama, sest siis taandub Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)- eks ning moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B-d, tänu millele saabki suhkrute kontsentratsiooni määrata. Keemisel toimuv reaktsioon:
kindlakstegemiseks kasutatavad meetodid: 1. KOMPLEKSOMEETRILINE MEETOD: - Põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus sisaldab vask(II)- triloon B kompleksi: a) Tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mile pHopt4,8, inaktiveerivalt. Lõpetab ensüümreaktsiooni b) Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise kk-a ja vask(II)-triloon B kompleksi Kompleksi valmistamine: .võetakse ekvimolaarsete hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleendiamiintetraäädikhappe dinaatriumsoola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B) .kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahus
aluse4l uuritava materjali karotenoidse koostise iseloomustamine; - karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis; klorofülli olemasolu kondlakstegemine. Karatenoidid- terpeenide ainete grupp Invertaasi aktiivsuse määramine Invertaas e sahharaas on ensuum, mis katalüüsib , D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni vastavalt skeemile: , D- fruktofuranosiid + vesi alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos, mis koosneb , D- glükoosist ja , D-fruktoosist. Invertaasi produtseerivad pärmid , hallitusseened aga ka paljud taimed. Inimeste seedetraktis toimub sahharoosi hüdrolüüs peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisel uuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimiselreaktioonisegus
-D-fruktofuranosiid + H2O -() , D-fruktoos + mono- või oligosahhariid 20 3. Skitseerige sahharoosi molekul ja näidake, milline side invertaasi toimel hüdrolüüsub. Sahharoos on looduses kõige levinum -D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on -D-fruktoos ja -D-glükoos 4. Mille toimel lisaks invertaasile võib aset leida sahharoosi hüdrolüüs? (Meenutage töös 1.2 läbiviidud reaktsioone!) Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega 5. Mis on invertsuhkur? Sahharoosi hüdrolüüsi protsessi nimetatakse inversiooniks ja tekkivat glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset (moolide suhe 1:1) segu tuntakse invertsuhkru nime all 21 6
10. Millisesse vitamiinde klassi A-vitamiin kuulub? Rasvlahustuvad vitamiinid. 1. Millist informatsiooni invertaasi kohta annab tema süstemaatiline nimetus -D fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas? Näitab, et ensüüm katalüüsib fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktioone, mille tulemuseks on fruktoos. 2. Kirjutage invertaasi poolt katalüüsitava reaktsiooni skeem. 3. Skitseerige sahharoosi molekul ja näidake, milline side invertaasi toimel hüdrolüüsub. 4. Mille toimel lisaks invertaasile võib aset leida sahharoosi hüdrolüüs? (Meenutage töös 1.2 läbiviidud reaktsioone!) Hapete toimel. 5. Mis on invertsuhkur? Sahharoosist hüdrolüüsi käigus tekkivad glükoosi ja fruktoosi segu. 6. Joonistage Michaelis-Menten'i kineetikaga kirjeldatavale ensüümireaktsioonile graafiline sõltuvus v versus [S]. Näidake, millises graafiku piirkonnas toimus invertaasi aktiivsuse (reaktsiooni kiiruse) mõõtmine meie töös, kui on teada, et [S] >> Km . Millist kiirust me mõõtsime?
kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleen- diamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B). See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli: · tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni, · tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)- triloon B kompleksi. Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena.
annaabi.ee 
