Invertaasi aktiivsuse määramise protokoll 2020 (0)

Invertaasi aktiivsuse määramine 193719LAAB



INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE (3.1) Protokoll


Sissejuhatus Invertaas on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka,
mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi. Invertaas katalüüsib β-D- fruktofuranosiidide hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule. Looduses
kõige levinum β-D-fruktofuranosiidid on sahharoos, mille hüdrolüüsireaktsiooni produktideks
on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad hallitusseened, paljud taimed ning
ka mesilased. Invertaas on inimese jaoks oluline seedeensüüm. Invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Preparaadi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava
disahhariidi hüdrolüüsil uuritava preparaadi toimel vabanenud taandavate suhkrute glükoosi
ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Antud töös kasutatakse kompleksonomeetrilist meetodid, kus põhireaktiiviks on tugevalt
aluseline reaktsioonisegu, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. See reaktiiv toimib
invertaasile inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni ning tagab taandavate suhkrute
määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja
moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb
ekvivalentses koguses vaba triloon B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse
määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus
komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on
tuvastatav indikaatori värvuse muutumise järgi. Töö käik 1. Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin invertaasi preparaadist töölahuse kontsentratsiooniga 2mg/ml. Kaalusin
analüütilistel kaaludel 15ml tuubi 14mg ensüümipreparaati ja lisasin 7ml atsetaatpuhvrit pH
väärtusega 4,8. Segasin segu ~5 minutit vortexil. Kuna ensüümipreparaat sisaldab lisaks
ensüümivalgule ka täiteaineid, ei tekkinud selget lahust. 2. Ensüümireaktsiooni läbiviimine Pipeteerisin 15ml tuubi 10ml substraati ehk 7%-list sahharoosi lahust atsetaatpuhvris pH
väärtusega 4,8. Panin selle ~10 minutiks termostaati 30ºC juurde soojenema. Seejärel
pipeteerisin kolme koonilisse kolbi 10ml komplekslahust. Kui substraat oli termostaadis saavutanud temperatuuri 30ºC, lisasin sellele 0,4ml invertaasi
töölahust ja loksutasin. Võtsin pipetiga 1ml reaktsioonisegu ja viisin selle esimesse
komplekslahusega kolbi. See on 0-proov, kus määratav taandavate suhkrute sisaldus
iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. Panin käima stopperi ja asetasin reaktsioonisegu tagasi termostaati. 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võtsin


pipetiga 1ml reaktsioonisegu, viisin selle teise komplekslahusega kolbi ja panin
reaktsioonisegu tagasi termostaati. 20 minuti möödudes viisin 1ml reaktsioonisegu
kolmandasse komplekslahust sisaldavasse kolbi. 3. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Panin kolvid, mis sisaldasid komplekslahust ja reaktsioonisegu, 10 minutiks elektripliidile
püstjahutite alla keema. Keemise käigus tekkis kolbidesse punane Cu2O sade ja vabanes
ekvivalentses koguses triloon B. 10 minuti möödudes lõpetasin keemise 150ml destilleeritud
vee valamisega kolbi läbi püstjahuti. Tänu suurenenud vedeliku mahule kolvis on indikaatori
värvuse muutust tiitrimisel parem märgata. Lisasin kolbidesse ~6 tilka indikaatorit, milleks oli
mureksiidi vesilahus. Tiitrisin kolbides olevaid lahuseid 0,02M CuSO4 lahusega, kuni lahuse värvus muutus
roheliseks ehk vabanenud triloon B komplekseerus Cu(II)-ioonidega. Fikseerisin igal
tiitrimisel kulunud CuSO4 mahu ja leidsin selle järgi kaliibrimisgraafikult taandavate suhkrute
sisalduse reaktsioonisegust võetud proovis. Taandavate suhkrute sisaldus mg/ml reaktsioonisegust võetud proovis: Proov Tiitrimisel kulunud CuSO4, ml Vastav suhkrute sisaldus, mg/ml 0-proov 1,9 1,8 10min 6,3 5,5 20min 12,5 11,1 Invertaasi preparaadi aktiivsus (A) μkat/g arvutatakse valemi järgi: A = (C2 – C1) • V1 • V2 • 10^3 / (T • 180 • V3 • V4 • g) C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml
C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml
V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml
V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml
10^3 – tegur üleminekuks mikrogrammidele
T – hüdrolüüsi kestus, s
180 – glükoosi molekulmass
V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml
V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml
G – ensüümipreparaadi kaalutis, g


Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena.
Selleks arvutatakse katseandmete alusel ensüümi aktiivsus A10 ja A20. A10=(5,5mg/ml-1,8mg/ml)*10ml*7ml*10^3/(600s*180g/mol*1ml*0,4ml*0,014g)=428,24μkat/g A20=(11,1mg/ml-1,8mg/ml)*10ml*7ml*10^3/(1200s*180g/mol*1ml*0,4ml*0,014g)=538,19μkat/
g Arvutustulemuste aritmeetiline keskmine on 483,2μkat/g. Seega invertaas hüdrolüüsis 30°C
juures 1s jooksul sahharoosis 483,2μmol O-glükosiidsidemeid 1g ensüümpreparaadi kohta. Kokkuvõte Laboratoorse töö käigus määratud invertaasi aktiivsuseks sain 483,2μkat/g. See tulemus ei
ole usaldusväärne, kuna A10 ja A20 erinevus on 21,6% ehk ületab lubatud 20% piiri ning katse
käigus on kuskil tekkinud viga. Arvan, et viga tekkis kõige tõenäolisemalt tiitrimisel.