Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule (0)

Tallinnatehnika Ülikool
Biotehnoloogia õppetool
Laboratoorse töö nimetus:
Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule
Üliõpilased:
Õppejõud:
Tiina Randla
Õpperühm:
Kuupäaev:
08.11.2010
Tallinn 2010
I töö: Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule
Sissejuhatus
Keskkonnatingimustest sõltub mikroorganismide kasvukiiris ja samuti ka fermentatiivsed omadused, näiteks tenperatuurist, happesusest, erinevate ühendite sisaldusest keskkonnas, aeratsioonitingimustes.
Tegelikult, enamus tüvesid soovib neutraalset keskkonda kasvamiseks ja temperatuurivahemiku liigikaudu 20-45C, selleseid mikroorganisme nimetatakse mesofiilideks. Olemas ka teised mikroorganismid , leidub neid kuumaveeallikates ja jäälistikel. Madalatel temperatuuridelkasvavad nn psühofiilsed ja kõrgetel temperatuuridel kasvavad termofiilsed mikroorganismid. Äärmusliku happelisi tingimusi armastanad atsidofiilid, leelislemblilisi alkalofiilid.
On oluliseks teguriks ka õhuhapniku vajadus või mitte. Mikroorganismid siis jagatakse elutegevuseks ja paljunemiseks õhuhapniku vajavateks aeroobideks ja vaba hapniku (madala redokspotentsiaaliga) mittevajavateks anaeroobideks.
Obligaatsed aeroobid ei saa molekulaarse hapnikuta elada. Fakultatiivsed aeroobid võivad ajuti elada ka hapnikuta keskkonnas. Anaeroobide hulgas eristatakse samuti obligaatseid ja fakultatiivseid anaeroobe. Obligaatsete anaeroobide hulgas leidub mikroaerofiile (võivad kasvada ka vähesel määral hapnikku sisaldavas keskkonnas) ning aerotolerante (taluvad lühikest aega hapniku juurdepääsu, kuid ei kasva sel juhul).
Mitmesugused keemilised ühendid, nagu näiteks antibiootikumid , keskkonnamürgid, konserveerivad ning desinfitseerivad ained mõjuvad enamusele mikroorganismidest toksiliselt, samas aga leidub tüvesid, mis kohastumusena keskkonnatingimuste suhtes on kas lihtsalt muutunud vastava ühendi suhtes tundetuks või neil on välja kujunenud metaboolsed rajad , mis võimaldavad selliseid ühendeid lagundada.
Ühendi toime mikroorganismile sõltub olulisel määral tema kontsentratsioonist. Näiteks võivad keedusool ning suhkrud vajalike toitainete (mineraalained, energeetiline tooraine ) allikatena väikestes kogustes mikroorganismide kasvu soodustada või olla selleks lausa hädavajalikud, suuremate kontsentratsioonide puhul aga hakkab toimima osmoos ja mikroorganismid hukkuvad ning seega nimetatud ühendid käituvad konservantidena.
Töö eesmärk: erinevate söötmetega tutvumine , värvimine Grami järgi ja mikroskopeeromine, mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvuse uurimine
temperatuurist, keskkonna pH-st ning keedusoola , suhkru, ksenobiootikumide sisaldusest keskkonnas
Kasutatavad materjalid: 3 tardsöötmel ettekasvatatud mikroobikultuuri (Baccillus, Rhodococcus, veinipärm); glükoosi (0%, 20%, 40%), vesinikioonide (pH 5, 7, 9) ja soola NaCl (0%, 10%, 20%) erinevate kontsentratsioonidega katseklaasid; PCA ja MALT söötmed Petri tassidel ilma ja koos ksenobiootikumidega
Töövahendid: katseklaasid, vahendid värvimiseks ja mikroskopeerimiseks
Töö käik:
Etapp1. Mikroskopeerimine:
(uurimine vastavalt Biotehnoloogia laboratoorsete tööde juhendile ehk lisa 2 või Mikrobioloogia juhendile lk 36, lühiskeem toodud antud juhendi lisas )

• uuritavatest mikroorganismidest valmistatakse preparaadid , kusjuures kuumfikseeritud - bakterite jaoks ja märgpreparaat pärmi jaoks
  
• värvitakse Grami järgi, kasutades võrdluskultuuridena Sarcina (G+) ja E. coli (G-).
  

Vaatlustulemused tabelis 1.
Uuritav kultuur
Märkus
Pilt
Saccharomyces cerevisiae
Üksikud, väikesed, tunktikesed
Pseudomonas sp „pruun“
Gram –negatiivsed kepikesed , roosa värvusega
Staphylococcus sp
Gram-positiivsed kepikujulised, violetne värvus
Echerihia coli
Gram–negatiivsed kepikesed, roosa värvusega
Sarcina sp.
Gram – positiivsed kooslusi moodustavad
Bakterid või kokid violetse värvusega
Etapp2. Mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvuse uurimine

temperatuurist:

• võetakse tardsöötmetel eelkasvatatud organisme ehk 2 bakterit ja pärmi
  
• tehakse väljakülvid joonkülvi meetodil, jälgides järgmise skeemi
  

Bakterid : 4 tassi PCA-söötmega
Pärm: 4 tassi Malt agariga.

• inkubeeritakse järgmistel temperatuuridel: külmutuskapis +5 ºC,
  

toatemperatuuril +18 – 22 ºC;
termostaadis +35 ºC ja
termostaadis +50 ºC.

• iga 48 järel märgitakse üles tassidel toimunud muutused
  

Saccharomyces cerevisiae
Pseudomonas sp „pruun „
Staphylococcus sp
+5C
+20C
+35C
+50C
+5 C
+20C
+35C
+50C
Külvi skeem

keskkonna pH-st ehk pH optimumi määramine

• 3 erineva pH-ga söödet (5, 7 , 9) ja iga on 3 erineva katseklaasi (kokku 9 katseklaasi)
  
• igast kultuurist tehakse 3 külvi vedelsöötmesse, viies steriilse külviaasaga veidi biomass katseklaasi, jälgides järgmise skeemi
  
• kasvatatakse toatemperatuuril
  

Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp „pruun „ Staphylococcus sp

• iga 48 tundi järel märgitakse üles katseklaasides toimunud muutused
  
• 3 nädala pärast viimasel vaatlusel mõõdetakse lahuste optilised tihedused lainepikkusel 540 nm
  

soola ja suhkru kontsentratsioonist:

• 3 söödet erineva NaCl sisaldusega (0, 10 ja 20%) ja 3 söödet erineva glükoosi kontsentratsiooniga (0, 20 ja 40%) á 3 katseklaasi - kokku 18 katseklaasi.
  
• igast kultuurist tehakse 3 külvi erineva soola sisaldusega söötmesse ning samuti 3 külvi erineva suhkru kontsentratsiooniga (soola kontsentratsiooniga) söötmesse
  
• külve inkubeeritakse toatemperatuuril
  
• iga 48 tundi järel vaadetakse toimunud muutusi katsekklaasides
  
• viimasel vaatlusel 3 nädala pärast mõõtsime optilised tihedused lainepikkusel 540 nm.
  

keskkonnavõõrastest ainetest

• söötmed lisanditega:
  

Pärmile: Malt agar + fenool ning Malt agar + kütteõli
Bakteritele: PCA + fenool ja PCA + kütteõli

• võetakse tardsöötmetel eelkasvatatud organisme ehk 2 bakterit ja pärmi
  
• tehakse väljakülvid joonkülvi meetodil järgmise skeemi järgi:
  

Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp „pruun „ Staphylococcus sp

• iga 48 järel märgitakse üles tassidel toimunud muutused
  
• hinnasime neid 5-palli süsteemis, kusjuures
  

0 – kasvu puudumine
1 – väga nõrk kasv
2 – mõõdukas kasv
3 – tugev kasv
4 – väga tugev kasv (tassi kattev kultuur).
Katse tulemused
Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule
Uuritav faktor
Staphylococcus sp
Pseudomonas sp „pruun „
Saccharomyces cerevisiae
I vaatl. II vaatl. Lõppv.
I vaatl. II vaatl. Lõppv.
I vaatl. II vaatl. Lõppv.
1. T
Hinne pallides (0–5)
+5o C
 2
2 
2
1
2
1
2 
3
2
+20o C
3
3
2
3
3
2
3
4
1
+35o C
3
2
0
1
1
0
4
3
2
+50o C
0
0
 0
0
0
0
0
0
0
2. pH
Hinne pallides (0–5) ja D =540 nm (lõppvaatlusel)
5
3
3
1
0 
3
1
1
2
1
7
2
4
1
3
3
1
1
2
1
9
1
4
1
3
4
1
2
2
1
3 NaCl
Hinne pallides (0–5) ja D =540 nm (lõppvaatlusel)
0%
2
3
1
1
2
1
1
2
0
10%
3
2
0
0
1
0
1
3
1
20%
1
1
0
0
0
0
1
1
0
3 Glc
Hinne pallides (0–5) ja D =540 nm (lõppvaatlusel)
0%
2
4
1
2
4
0
1
2
1
20%
1
2
0
0
1
0
3
4
2
40%
0
1
0
0
0
0
3
3
1
4.Ks.-d
Hinne pallides (0–5)
Fenool
2
2
0
1
0
0
2
1
0
Kütteõli
2
3
1
4
4
2
2
2
1
Optiline tihedus
Optiline Tihedus
 
Staphylococcus sp
Pseudomonas sp „pruun „
Saccharomyces cerevisiae
pH
 
 
 
5
0.601
0.935
0.426
7
0.845
0.948
0.635
9
0.503
0.783
0.511
sool, %
 
 
 
0
0.533
0.660
0.445
10
0.250
0.060
0.622
20
0.099
0.037
0.264
suhkur,%
 
 
 
0
0.454
0.755
0.599
20
0.329
0.077
0.840
40
0.076
0.062
1.041
Järeldused:
Soola ja suhkrusisaldus:
Etteantud või uuritavad preparaadid on madala soola- ja suhkrusisalduse taluvusega. Mida suurem kontsentratsioon, seda väiksem optiline tihedus. Seda tõestavad ka järgmised graafikud
Tulemuste järgi võib öelda, et antud mikroorganismide vahel ei ole halofiile. Kuid ikka iga mikroorganismi tüve talub soola sisaldust erinevalt.
Pseudomonas sp „pruun „ kasv oli eriti intensiivne, kui sööde ei sisalda NaCl. Mida suurem NaCl kontsentratsioon söödel, seda väiksem Rhodococcuse kasv. Ehhki Pseudomonas sp „pruun „ võib areneda soolases keskkonnas.
Pseudomonase kasv oli eriti intensiivne ilma soolata ja soola juuresolekul bakteri kasvu üldse ei ole.
Saccharomyces cerevisiae kõige parem talub soola sisaldust bakterite võrreledes. Kuid tema kõige intensiivne kasv oli soolasisaldusega 10%. Võib ka öelda, et soola kontsentratsiooni suurendades pärmi kasv väheneb.
Tulemuste järgi võib öelda, et antud iga mikroorganismi tüve talub glükoosi sisaldust erinevalt.
Kõige intensiivne kasv mikroorganismide vahel oli Saccharomyces cerevisiae , eriti intensiivselt ta kasvas sukrusisaldusega 20%, 40% glükoosi sisaldusega pärmi kasv suurendas. Suhkruta pärm kasvas halvasti.
Staphylococcus sp kasv oli intensiivne antud tingimustel.Eriti intensiivselt ta kasvas sukrusisaldusega 20%, 40% glükoosi sisaldusega bakteri kasv pidurdas. Kuid võib öelda, et rakkud taluvad erinev suhkru sisaldus.
Pseudomonas kasv ei olnud intensiivne antud tingimustel. Suhkruta bakter kasvas suurepäraselt, vaid suhkru sisaldusega suurendamisel kasvu ei toimunud.Kuid võib öelda, et rakkud taluvad erinev suhkru sisaldus. Graafikult on näha, et Pseudomonase kasv on eriti intensiivne suhkru sisalduga 0%.
Temperatuuri mõju:
Uuritavad bakterid (Pseudomonas sp „pruun „ Staphylococcus sp) ja pärm - Saccharomyces cerevisiae, kasvavad erinevatel temperatuuridel erinevalt.
Staphylococcus sp optimaalne temperatuur on 20oC, selle temperatuuri juures oli kasv eriti suur, kuid 35oC ja 5 oC juures kasvas kultuur ka hästi. 50oC juures kultuur ei ole kasvanud Võib õelda, et see bakter on mesofiil, kuna tema temperatuuri optimum on vahemikus 20-35 oC
Pseudomonas’e optimaalne temperatuur on 20oC, mille juures bakterite kasv oli kõige suurem. Kõrgematel temperatuuridel Pseudomonas’e kasvu eriti ei jälginud. Madalatel temperatuuridel bakter kasvas piisavalt hästi. Pseudomonase bakter kuulub psührofiili rühma, kuna bakterid hästi kasvasid 5 oC ja 20 oC juures.
Saccharomyces cerevisiae optimaalsed temperatuurid kasvuks on 20 oC ja 35 oC. Madalal temperatuuril pagariparmi kultuur kasvas ka hästi, kuid 50 oC ei kasva üldse. Pagaripärm kuulub mesofiilide rühma, sest bakterite kasvu optimum oli 20-35 oC. Kuid ta hästi kasvas ka madalatel temperatuuridel.
pH optimum:
Migroorganismid rohkem eelistavad neutraalsed keskkonnad kasvamiseks ja arengumiseks, kuid on ka neid mikroobid , mis ka võivad areneda ja paljuneda happelises või leeliselises keskkonnades.
Saccharomyces cerevisiae pH optimum on 7, järelikult parem ta areneb neutraalses keskkonnas, kuid ta hästi areneb aluselis keskkonnas. Saccharomyces cerevisiae suhtub alkalofiilide rühma.
Staphylococcus sp optimaalne arenevuse keskkond on neutraalne ja tema pH optimum on 7. Kuna bakter arenes suhteliselt võrdselt happelises ja aluselises keskkonnas, siis ei saa öelda antud tulemuste järgi kas ta on atsidofiil, või alkalofiil. Kuid pH 9 juures Rhodococcuse lag-faas on kõige väiksema kestvusega, siis võib öelda et ta on alkalofiil
Pseudomonas’e optimaalne arenevuse keskkond on neutraalne ja tema pH optimum on 7. Kuna bakter arenes suhteliselt võrdselt happelises ja aluselises keskkonnas, siis ei saa öelda antud tulemuste järgi kas ta on atsidofiil, või alkalofiil. Kuid pH 5 juures Rhodococcuse lag-faas on kõige väiksema kestvusega, siis võib öelda et ta on atsidofii.
Ksenobiootikumide mõju:
Staphylococcus sp bakterid kasvavad intensiivselt nii fenoolis kui ka küteõlis. Küteõlis vad natukene parem.
Pseudomonas’e bakterite kasv on kõige intensiivne küteõlis, fenoolis ta kasvab pahasti.
Saamuti pärmi kasv küteõlis oli ka hea, mida ei saa öelda fenooli kohta, kus ta peamiselt ei kasvanud..
Hapnikku vajadusel analüüsivad tüved:
Pseudomonas on aeroob , kuna vedelsöötmes ta kasvas kõigis söötme ruumalas eriti ruumala pinnal.
Staphylococcus sp anaeroob kuna vedelsöötmes ta kasvas kolvi põhjal.
Pärm on fakultatiivne anaeroob.
Kokkuvõte
Antud töös oli vaja analüüsida antud bakterite tüved, nende kasv ja arenemine erinevatel füüsikalis-keemiliste tingimustel.
Oli tegemist Pseudomonasega, mis on gram-negatiivne aeroob. Ta ei talu soola ja suhkru sisaldut. Pseudomonas on psührofiili ja atsidofii. Erinevad ksenobiootikumid mõjusid erinevalt, fenooli juureolekul Pseudomonas praktiliselt ei kasvanud, kuid kütteõli juuresolekul ta kasvas hästi.
Staphylococcus on gram-positiivne, anaeroob, mis ei talu ei soola ega suhkru sisaldust. Staphylococcus on mesofiil ja alkalofiil. Ksenobiootikumite juureolekul ta kasvas hästi.
Pärm on gram-positiivne, fakultatiivne anaeroob, mis ei ole halofiil, kuid ta talub soola sisaldust. Väike suhkru kogus stimuleerib pärmi kasvut. Pärm on atsidofiil ja mesofiil; ksenobiootikumite juureolekul ta kasvas hästi.