Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule (0)

Tallinnatehnika Ülikool
Biotehnoloogia õppetool
Laboratoorse töö nimetus:
Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule
Üliõpilased:
Robert Risti ja Luise Tiks
Õppejõud:
Tiina Randla
Õpperühm:
YASB52
Kuupäev:
14.10.2013
Tallinn 2014
Sissejuhatus
Erinevate mikroorganismide kasvukiirus ja fermentatsioon sõltub keskkonnatingimustest (temperatuurist, pH-st, keskkonna koostisest jne). Enamik liike on neutrofiilid (eelistavad neutraalset keskkonda) ja mesofiilid (eelistavad temperatuurivahemikku 20-45◦ C. Leidub ka organisme, kes elavad äärmuslikes oludes – neid nimetatakse ekstremofiilideks. Null-kraadi lähedal kasvavad psührofiilsed, kuuma käes termofiilsed ja ekstreemselt kuumades tingimustes hüpertermofiilsed organismi. Äärmuslikult happelisi tingimusi eelistavad atsidofiilid, leeliselisi alkalofiilid.
Organisme, kes vajavad elutegevuseks hapnikku nimetatakse aeroobideks (obligaatsed aeroobid ei saa hapnikuta elada, fakultatiivsed aeroobid eelistavad hapnikuga keskkonda kuid saavad elada ka ilma hapnikuta), hapnikuvaba keskkonda vajavad anaeroobid. Anaeroobid võivad olla aerotolerantsed – suudavad lühikest aega hapnikku taluda, kuid ei paljune sel juhul.
Mitmesugused keemilised ühendid ( antibiootikumid , desinfitseerivad ained jne) on enamikule mikroorganismidest toksilised, samas leidub tüvesid, kes on muutunud vastava ühendi suhtes tundetuks. Ühendi toime sõltub ka kontsentratsioonist, näiteks keedusool ja suhkrud võivad väikeses koguses mikroorganismide kasvuks vajalikud olla, kuid suuremates kontsentratsioonides pärsivad nende kasvu või põhjustavad organismide hukkumise. Paljud ained on omastatavad vaid kindlas kontsentratsioonivahemikus.
Optimaalsete kasvutingimuste järgimine on vajalik, et optimiseerida biotehnoloogilist protsessi.
Käesoleva teema raames uuritakse:
1. Mikroorganismide morfo -füsioloogilisi tunnuseid
2. Mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvust

• temperatuurist,
  
• keskkonna pH-st,
  
• keedusoola ,
  
• suhkru,
  
• ksenobiootikumide sisaldusest keskkonnas;
  

3. Termilise töötluse mõju erinevatele mikroorganismidele.
Kasutatavad materjalid: 3 tardsöötmel ettekasvatatud mikroobikultuuri (Baccillus sp Ps 42, Pseudomonas sp 105, Saccharomyces cerevisae); glükoosi (0%, 20%, 40%), vesinikioonide (pH 5, 7, 9) ja soola NaCl (0%, 10%, 20%) erinevate kontsentratsioonidega katseklaasid; PCA ja MALT söötmed Petri tassidel ilma ja koos ksenobiootikumidega
Töövahendid: katseklaasid, vahendid värvimiseks ja mikroskopeerimiseks
TÖÖ KÄIK
Etapp1. Mikroskopeerimine
Valmistasime uuritavatest mikroorganismidest preparaadid (vastavalt juhendi lisades 4.2 ja 4.3 toodud õpetusele), kusjuures kuumfikseeritud preparaadi bakterist jaoks ja märgpreparaadi pärmi uurimise jaoks. Värvisime Grami järgi, kasutades võrdluskultuuridena Sarcina (G+) ja E. coli (G-).
Vaatlustulemused tabelis 1.
Uuritav kultuur
Märkus
Pilt
Saccharomyces cerevisiae
Üksikud piklikud rakud
Pseudomonas sp 105
Gram –positiivsed, ümara kujuga
Bacillus sp Ps 42
Gram-positiivsed, kepikujulised
Echerihia coli
Gram–negatiivsed kepikesed
Sarcina sp.
Gram positiivsed kooslusi moodustavad
bakterid või kokid
Etapp2. Mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvuse uurimine

Temperatuurist:

• võetsime tardsöötmetel eelkasvatatud organisme ehk 2 bakterit ja pärmi
  
• tegime väljakülvid joonkülvi meetodil
  

Bakterid: 4 tassi PCA-söötmega
Pärm: 4 tassi Malt agariga.

• inkubeerisime järgmistel temperatuuridel : külmutuskapis +5 ºC, toatemperatuuril ~22ºC;
  

termostaadis +35 ºC ja termostaadis +50 ºC.

• umbes iga 48 järel märkisime üles tassidel toimunud muutused
  

Saccharomyces cerevisiae
Pseudomonas sp 105
Bacillus sp Ps 42
+5C
+20C
+35C
+50C
+5 C
+20C
+35C
+50C
Külvi skeem

Keskkonna pH-st ehk pH optimumi määramine

• Tegime igast kultuurist 3 külvi erineva pH-ga vedelsöötmesse (5, 7 , 9) viies steriilse külviaasaga veidi biomass katseklaasi, jälgides järgnevat skeemi
  
• Kasvatasime toatemperatuuril
  

Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp 105 Bacillus sp Ps 42

• iga 48 tundi järel märgitakse üles katseklaasides toimunud muutused
  
• 3 nädala pärast viimasel vaatlusel mõõdetakse lahuste optilised tihedused lainepikkusel 540 nm
  

Soola ja suhkru kontsentratsioonist:

• Tegime igast kultuurist 3 külvi erineva NaCl sisaldusega (0, 10 ja 20%) ja 3 külvi erineva glükoosi kontsentratsiooniga (0, 20 ja 40%) vedelsöötmesse
  
• Inkubeerisime külve toatemperatuuril
  
• Iga 48 tundi järel vaatasime toimunud muutusi katseklaasides
  
• Viimasel vaatlusel nädala pärast mõõtsime optilised tihedused lainepikkusel 540 nm.
  

Keskkonnavõõrastest ainetest

• Võtsime tardsöötmetel eelkasvatatud organisme ehk 2 bakterit ja pärmi
  
• Tegime iga kultuuri väljakülvid joonkülvi meetodil ühele fenooli ja ühele kütteõli sisaldavale petri tassile järgmise skeemi järgi:
  

Saccharomyces cerevisiae Pseudomonas sp 105 Bacillus sp Ps 42
iga 48 järel märkisime üles tassidel toimunud muutused ja hindasime neid 5-palli süsteemis
Katse tulemused
Füüsikalis-keemiliste tegurite mõju mikroorganismide kasvule
Uuritav faktor
Pseudomonas sp 105
Bacillus sp Ps 42
Saccharomyces cerevisiae
I vaatl. II vaatl. Lõpp
I vaatl. II vaatl.Lõpp
I vaatl. II vaatl. Lõpp
1. T
Hinne pallides (0–5)
+5o C
 0
1 
2
0
2
3
0 
2
3
+20o C
2
3
4
2
4
5
2
3
4
+35o C
2
3
4
3
4
5
3
4
4
+50o C
0
0
 0
0
0
0
0
0
0
2. pH
Hinne pallides (0–5) ja D =540 nm (lõppvaatlusel)
5
0
4
5
2 
4
5
3
4
5
7
2
4
4
2
4
4
2
4
5
9
2
3
3
1
3
4
2
4
5
3 NaCl
Hinne pallides (0–5) ja D =540 nm (lõppvaatlusel)
0%
1
4
5
2
4
5
3
4
5
10%
0
0
0
1
2
3
2
3
3
20%
0
0
0
0
1
1
1
1
2
3 Glc
Hinne pallides (0–5) ja D =540 nm (lõppvaatlusel)
0%
2
3
5
1
4
5
2
3
4
20%
1
1
1
0
2
2
1
2
5
40%
0
0
0
0
1
1
0
0
2
4.Ks.-d
Hinne pallides (0–5)
Fenool
1
1
2
1
3
3
1
2
3
Kütteõli
2
2
3
2
3
4
2
4
4
Optiline tihedus
Optiline Tihedus
 
Bacillus sp Ps 42
Pseudomonas sp 105
Saccharomyces cerevisiae
pH
 
 
 
5
1,692
1,253
1,803
7
1,671
0,943
1,470
9
1,259
0,753
1,478
sool, %
 
 
 
0
1,714
0,791
1,465
10
0,538
0,080
0,969
20
0,183
0,000
0,199
suhkur,%
 
 
 
0
1,086
0,656
1,2381
20
0,334
0,050
1,702
40
0,031
0,046
0,449
Järeldused:
pH optimum :
Enamik mikroorganisme eelistab kasvamiseks neutraalset keskkonda ning taluvad pigem aluselist kui happelist keskkonda. Samas vaatluse tulemuste põhjal võib öelda, et uuritud kultuurid olid pigem atsidofiilsed, mida kinnitab ka alljärgnev graafik .
Graafikult on näha, et kõigi uuritud mikroorganismide kasv oli suurim pH 5 juures. Neutraalse pH juures oli Bacilluse kasv praktiliselt sama, mis happelises keskkonnas ning aluselises keskkonnas Bacilluse kasv vähenes. Nii Pseudomonase kui Saccharomycese kasv oli neutraalses keskkonnas väiksem kui pH 5 juures. Aluselises keskkonnas oli Pseudomonase kasv väiksem, kui neutraalses keskkonnas, Saccharomycese kasv neutraalses ja aluselises keskkonnas oli sama.
NaCl sisaldus:
Nii vaatluse tulemused kui ka optiliste tiheduste väärtused näitasid, et kõik uuritud kultuurid kasvasid paremini keskkonnas, kus NaCl kontsentratsioon oli 0 ning mida kõrgem oli NaCl sisaldus, seda väiksem oli organismide juurdekasv. Saadud tulemusi illustreerib ka allolev graafik:
Graafikult võib näha, et kõige halvemini talus soola Bacillus sp Ps 42, Saccharomyces cerevisae kasvas kõige paremini NaCl 0% juures, kuid talus küllalt hästi ka 10% NaCl keskkonda. Bacillus sp Ps 42 kasvu mõjutas ka mõõdukas NaCl sisaldus (10%) järsult.
Tulemuste järgi võib öelda, et antud mikroorganismide hulgas pole halofiile, kuid iga mikroorganismi tüvi talub soolasisaldust erinevalt.
Suhkrusisaldus:
Nii vaatluse tulemused kui ka optiliste tiheduste väärtused näitasid, et uuritud kultuuride kasvu sõltuvus suhkrusisaldusest oli erinev. Seda iseloomustab järgmine graafik:
Graafikult võib näha, et nii Pseudomonas kui Bacillus eelistasid suhkruta keskkonda ning nende kasv vähenes suhkrusisalduse kasvades järsult. 40% suhkrulahuses Pseudomonas ei kasvanud üldse ning Bacillus kasvas äärmiselt vähe.
Saccharomyces cerevisae kasv oli 20%-ses suhkrulahuses kiirem kui 0%-ses lahuses, seega võib teda pidada osmofiiliks. Samas suhkrusisalduse kasvades 40 %-ni Saccharomycese kasv vähenes uuesti.
Temperatuuri mõju:
Vaatluse tulemusena võib öelda, et kõik kolm uuritavat kultuuri (2 bakterikultuuri ja 1 pärmikultuur) eelistasid kasvamiseks sama temperatuuri.
Nii Bacillus sp Ps 42 kui ka Pseudomonas sp 105 optimaalne kasvutemperatuur jäi 20oC ja 35oC vahele, nende temperatuuride juures oli kasv võrdselt suur. Mingil määral toimus kasv ka 5 oC, 50oC juures kultuurid ei kasvanud. Seega võib öelda, et nende näol on tegemist mesofiilidega, kuna nende temperatuuri optimum on vahemikus 20-35 oC.
Ka Saccharomyces cerevisiae optimaalsed temperatuurid kasvuks olid 20 oC ja 35 oC. 35 oC juures oli kasv pisut kiirem, kuid see vahe ei olnud eriti suur. Madalal temperatuuril kasvas pärm samuti küllalt hästi, kuid 50 oC ei kasvanud üldse. Ka Saccharomyces kuulub mesofiilide rühma, sest bakterite kasvu optimum oli 20-35 oC.
Ksenobiootikumide mõju:
Bacillus kasvas hästi nii fenoolis kui ka kütteõlis, kuid kütteõlis oli kasv eriti suur.
Pseudomonase kasv oli samuti intensiivsem küteõlis, samas vähesel määral toimus kasv ka fenoolis.
Saccharomycese kasv kütteõlis oli väga suur, fenoolis jäi kasv mõõdukaks.
Seega võib öelda, et kõik kolm uuritud kultuuri talusid ksenobiootikume küllaltki hästi. Kui võrrelda kultuuride kasvu sama temperatuuri juures ilma ksenobiootikumideta, võib öelda, et kütteõli sisaldus keskkonnas ei mõjutanud ühegi kultuuri kasvu märkimisväärselt. Fenoolisisaldus vähendas kõigi uuritud kultuuride kasvu, kuid ei mõjunud siiski ka päris toksiliselt.
Kokkuvõte
Antud töös uurisime keskkonnategurite (temperatuuri, pH, soola- ja suhkrusisalduse ning ksenobiootikumide) mõju kolme mikroorganismi kasvule - Saccharomyces cerevisaele, Bacillus sp Ps 42-le ja Pseudomonas sp 105-le. Jälgisime nädala jooksul nende organismide kasvu.
Tulemusi kokku võttev tabel:
 
Saccharomyces cerevisae
Bacillus sp Ps 42
Pseudomonas sp 105
pH optimum
pH=5
pH=5
pH=5
NaCl mõju
Optimaalne NaCl konts. on 0, kasvab mõõdukalt ka 10% NaCl lahuses ja vähesel määral 20% lahuses
Optimaalne NaCl konts. on 0, kasvab vähesel määral ka 10% lahuses ja väga vähesel määral 20% lahuses
Optimaalne NaCl konts. on 0, väga vähesel määral kasvab 10% lahuses, 20% lahuses kasvu ei toimu
Glükoosi mõju
Optimaalne glükoosisisaldus on 20%, hästi toimub kasv ka 0% lahuses, vähem 40% juures.
Optimaalne glükoosisisaldus on 0%, 20% juures toimub kasv vähesel määral, 40% juures kasvu ei toimu
Optimaalne glükoosisisaldus on 0%, 20% juures toimub kasv vähesel määral, 40% juures kasvu ei toimu
Temperatuuri mõju
Temperatuurioptimum 20-35◦C, vähesel määral toimus kasv ka 5◦C juures, 50◦C juures kasvu ei toimu.
Temperatuurioptimum 20-35◦C, vähesel määral toimus kasv ka 5◦C juures, 50◦C juures kasvu ei toimu.
Temperatuurioptimum 20-35◦C, vähesel määral toimus kasv ka 5◦C juures, 50◦C juures kasvu ei toimu.
Fenooli mõju
Kasv on mõõdukalt vähenenud
Kasv on mõõdukalt vähenenud
Kasv on tugevalt pärsitud, kuid mitte peatunud.
Kütteõli mõju
Kasv on natuke vähenenud
Kasv on natuke vähenenud
Kasv on natuke vähenenud
Mikroskopeerides selgitasime välja, et Pseudomonase näol on tegemist gram-negatiivse, Bacilluse näol gram-negatiivse bakteriga. Kõik kolm uuritud kultuuri on mesofiilid ning ei suuda kõrgeid temperatuure taluda, kuid kasvasid ka madalatel temperatuuridel (eriti hästi kasvas 5 oC juures pärm). Kõik kultuurid eelistasid pigem happelist keskkonda.
Soolast keskkonda talusd halvasti kõik uuritud kultuurid. Nii Bacillus kui Pseudomonas talusid suhkrusisaldust halvasti, samas Saccharomyces kasvas kõige paremini 20% suhkrusisaldusega söötmes.
Kütteõli sisaldus keskkonnas ei mõjutanud märkimisväärselt ühegi uuritud kultuuri kasvu, samas fenoolisisaldus vähendas kõigi kultuuride kasvu.
Kokkuvõtteks võib öelda, et keskkonnatingimuste mõju kõigile uuritud kultuuridele oli küllaltki sarnane.