Seega võib kromatograafilise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist. Selles praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge nii, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25- 30 cm, täidise kohal umbes 3-4 cm kõrgune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. 2. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine:
Rf saab arvutada valemi järgi Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse komatogrammiks. Antud töös tuleb kromatogramm katseandmete alusel käsitsi koostada. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraktsioonikogurist. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on täidetud väiksema poorsusega dekstraangeeliga Sephadex´i markidega, mis on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsiooni kogumine toimub käsitsi. Valemid ja nendes kasutatavad lühendid Täidise maht (Vt) Kolonni vaba maht, s.o graanulitevahelise vedeliku maht (Vv) Graanulitesisese vedeliku maht (Vs) Geelmaterjali (maatriksi) maht (Vg) Valem täidise mahu arvutamiseks: Vt=Vv+Vs+Vg Liikuvustegur Rf: Töö käik
graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem (,,tipule" vastav maht). Kromatografeerimissüsteem: Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraksioonikogurist ehk kollektorist. Töös oli kasutatud klaaskolonne, mis juba eelnevalt oli täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise krgus kolonnides on 2530 cm. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutati spektrofotomeetrilist meetodit. TÖÖ KÄIK Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine kolonni täidis Sephadex G75, k=0,1 Geelisamba täidise kõrgus L=24 cm, diameeter d=2 cm
samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide mõõtmetega. Geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist, või D-galaktoosist. Kui läbi kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu siis molekulid lahutuvad vastavalt suurustele. Et segu läbi kolonni transportida ning erineva molekulmassiga ained lahutada voolutatakse seda sobiva vesilahusega ning kogutakse eluaati kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Töö käik Ettevalmistus · Töös kasutasin geeli Sephadex G-75 ning tema fraktsioneerimispiirkond on 3000-80000D, k = 0,1 · Täidise kõrguseks mõõtsin L = 32cm ja läbimõõduks d = 1,7cm -> r = 0,85cm · Arvutasin täidise kogumahu: Vt = L·r2= 32 · 0,852 = 72,63cm3 · Arvutasin geelmaatriksi mahu: Vg = k·Vt = 72,63 · 0,1 = 7,263cm3 ja maksimaalse eludeerimismahu Vxmax = Vt Vg = 72,63 7,273 =65,357 cm3 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu teades, et ühe fraktsiooni maht on 2ml. n = Vxmax/2 = 65,357 / 2 33
molekuli suurusele). Geelkromatograafias kasutatavd geelid koosnevad kas dekstraanist, agaroosist või polüakrüülamiidist (margid erinevad üksteisest poorsuse poolest). Geelkromatograafia kolonne iseloomustavad mahud: Täidise üldmaht Vt Kolonni vaba maht (graanulitevahelise Vv vedeliku maht) Graanulitesisese vedeliku maht Vs Geelimaterjali (maatriksi) maht Vg Vt=Vv+Vs+Vg Kasutasin kolonni, mis sisaldas Sephadex G-75 geeli. Uuritava segu läbi kolonni transportimiseks ja erineva molekulmassiga ainete eraldamiseks, voolutatakse ehk elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx (see arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest.
Liikuvustegur Rf iseloomustab aineid, mis on võimelikud difundeeruda geeli pooridesse. min Vx - Vx R f = max min Vx - V x Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Töö käik Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine: · Kontrollin kolonni vertikalsust. On vertikaalne. · Märgin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k , mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1. · Mõõden geelisamba (täidise) kõrgus L ja diameeter d, kasutades sobiva joonlauda. L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml.
kollektorist PÕHILINE MEHHANISM: Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Kolonni väljavoolukraani avamisel algab kohe eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel on võimalik kolonnist välja voolavaid fraktsioone automaatselt õiges mahus koguda. Selles praktikumis on kasutusel klaaskolonnid, mis on juba eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Töös uuritavate ainesegude lahutamiseks sobivad üldiselt väiksema poorsusega ehk tihedamad Sephadex'i margid, mis on mehhaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine osa täidetud klaasvillaga. Kolonn peab olema kinnitatud sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas ning täidise kohal peab alati olema mõne cm paksune vaba eluendi kiht
elueerimismahtu ( eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid mis geeli pooridesse täielikult sisenevad). Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja mahu vahelist graafikut. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraktsioonikogurist. Tihti on kasutusel automaatkolonnid, mis automaatselt lisavad kolonni eluenti, antud töös on aga kasutusel klaaskolonnid, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex G - 75. Kolonn on kinnitatud statiivile sellisele kõrgusele, et alla mahuks katseklaas. Käsitsi tuleb lisada nii eluenti kui ka fraktsioone koguda. Ainete kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kolonn asetataksse statiivile vertikaalselt · Kolonni täidise mark ja seda iseloomustav tegur k märgitakse üles. · Mõõdetakse geeli kõrgus L ja diameeter d.
Valem on selline: Rf=Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin, kusjuures Rf väärtused peavad jääma vahemikku 0...1. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelise sõltuvuse graafik. Ainete väljumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerimismahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem. Kromatogrammil on see ,,tipule" vastav maht. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis on juba eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Väiksema poorsusega, st tihedamad, Sephadex'i margid on mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni suhteliselt kiiret voolutamist. Kolonni alumine osa on täidetud klaasvillaga, et täidis ei saaks välja voolata. Kolonn on statiivi küljes ning selle alla peab mahtuma katseklaas. Täidise kõrgus on tavaliselt 25-30 cm ja täidise kohal on tavaliselt 3-4 cm eluendi kiht. Ainete kontsentratsioonide kindlaks määramiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit.
on kromatogramm. Tüüpiline kromatografeerimissüsteem:kolonn, eluendi reservuaar ja automaatne fraktsioonikogur. Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgeval asetseva eluendi reservuaariga siis algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi kogumine. Meie töös kasutame: klaaskolonn, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Kolonn on kinnitatud statiivi külge ja selle alumine osa on täidetud klaasvillaga.Täidise kõrgus kolonnides on tavaliselt 25-30 cm, täidise kohal reeglina 3-4 cm paksune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine kolonni ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Antud töös kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik: Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine
mahuga väljunud fraktsioonide ainete sisaldust (fraktsioonide optilise tiheduse kaudu). Geelkromatograafiakolonni iseloomustavad mahud · Töö käik etappide kaupa Kõigepealt iseloomustasin kolonni ja valmistasin selle ette: o Kontrollisin kolonni vertikaalsust, geelisamba vertikaalsema piiri saamiseks sai seda loksutatud ning lastud sellel uuesti settida. o Märkisin ülesse kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi Sephadex G-75 ja seda iseloomustava teguri k=0,1. o Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse l=32 cm ja diameetri d=1,6 cm, kasutades sobivat joonlauda. o Arvutasin täidise kogumahu Vt = Vv + Vs + Vg = PI*(d/2)2*l = 64 cm2. o Arvutasin geelmaatriksi mahu Vg = k*Vt = 0,1*6,4= 6,4 cm2 ja sellest lähutvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 64cm2 6,4 cm2 = 57,6 cm2.
Vt = Sp*h = r2*h = *(1,15)2*29,5 =122,56 cm3 k = 0,1 Vg = k*Vt = 0,1*122,56 = 12,256 cm3 Vxmax = Vt Vg = 122,56 12,256 = 110,30 cm3 Fraktsioonide teoreetiline arv: n = Vxmax/2 =110,3/2 = 55,15 Kogusin kolonni väljavooluavast tilkuva eluaadi koonilisse kolvi ning hiljem mõõtsin ära vedeliku mahu: Vv = 27 ml Uuritav segu koosneb kolmest komponendist: dekstraansinine 3mg/ml, müoglobiin 6mg/ml ja DNA-aspartaat 0,3mg/ml, elueerimispuhvriks oli pH=7,4 20mM Tris 0,15M NaCl Kolonn sisaldab: Sephadex G-75 Lainepikku Fraktsiooni Eluaadi Optiline s (nm) nr maht tihedus (ml) 1 36 0,007 2 38 0,067 670 3 40 0,160 4 42 0,248 5 0,180 44 6 46 0,039 6 46 0,113
diffundeeruvad geeli pooridesse (=). Aineid, mille molekuli suudavad täielikult diffundeerida geeli pooridesse ja mille antud kolonnis on teada, iseloomustatakse liikuvusteguriga : Selle värtusedjäävad vahemiku 0...1 Töö käik 1. Proovi andmed: =0.5 ml. Koostis: Dekstraansinine (6 mg/ml), Müoglobiin (6 mg/ml), DNP-aspartaat (0.3mg/ml), proovi lahusti ja eluent NaCl lahus. 2. Märgin ära kolonni andmed: geel on Sephadex G-75, koeffitsient k=0.1, geelisambla kõrgus L=27.4 cm, diameeter d=1.9 cm. 3. Arvutan vajalikud mahud: ; ; 4.Arvutan fraktsioonide üldarv: n= (tegelikult 29-s fraktsioonis oli nii vähe elueerivat ainet, et sellega ma lõpetasin fraktsioonide kogumist). 5. Asetan katseklaase statiivi ja nummerdan neid. 6. Geeli kohal olevat lahust kogun eraldi keeduklaasi (19.5 ml) 7. Kogun fraktsioone (29). Iga fraktsioon ~2 ml. 8
Kui kolonnis liikuv esimene sinine riba oli jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A)
kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. Vxmax = Vt - Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on kindlaks määratus, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik · Kontrollitakse kolonni vertikaalsust · kolonni täidis: Sephadex G-75, tegur k = 0,1 · geelisamba kõrgus l = 31,4 cm · diameeter d = 1,6 cm · täidise kogumaht Vt = 63 ml · geelimaatriksi maht Vg = 0,1 63 = 6,3 ml · maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 63 6,3 = 56,7 ml · fraktsioonide üldarv n = 56,7 / 2 = 29 · statiivi võetakse vastav arv katseklaase · eluendi koostis: 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH = 7,5 · uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml)
Väiksema molekulmassiga ained liiguvad aga aeglasemalt, sest nende molekulid sisenevad pooridesse ja liikumine aeglustub. Kogu protsess viiakse läbi kolonnis. Kogu protsessei käigus on võimalik teha kindlaks iga aine elueerimis- ehk väljumismaht. See on selline elulaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Esmalt märkisime üles Sephadex’i margi=> 675 ja seda iseloomustava teguri k=>0,1. Seejärel mõõdetakse geelisamba kõrgus L=>12,5 cm ja ja diameeter d=>2,7 cm. Arvutatakse täidise kogumaht Vt=>71,53 Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt=>7,15 ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vx max = Vt – Vg=>64.38. Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n =
Vx max = Vt Maksimaalse elueerimismahu saab arvutada, kui geelimaatriks on teada: Vx max = Vt - Vg Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk
elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf Rf = Kromotogramm-kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonn nr.1.Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t)
elueerimismaht on antud kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) , kus 0 < Rf < 1 Fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammi. Käesolevas töös kasutatakse konstentratsioonide kindlakstegemisel spektrofotomeetrilist meetodit. Töö käik Antud töös kasutan Sephadex G-75 geeli, mille k=0,1. Mõõdan geelisamba kõrguse L=15,5 cm ja sisediameetri d=2,7 cm. Siit saan arvutada geelitäidise kogumahu Vt. d Vt = S p × L = × ( 2 )2 × L 2,7 cm Vt = × ( 2 )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3 Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg. Vg = k × V t Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3 Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax Vxmax = Vt - Vg Vxmax = 88,7 cm3 8,9 cm3 = 79,8 cm3
Vxmax - maksimaalne elueerimismaht, eluaadi maht, mille juures väljuvad need molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema. Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse sisenema, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvusteguriga Rf. Rf = (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad parameetrid: Kasutatav geel: Sephadex G-75 Geeli pundumisaste k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 17 Täidise diameeter d= 2,5; r = 1,25 Täidise kogumaht Vt= П*r2*L => 3,14* 1,252*17=83,41 Geelimaatriksi maht Vg= K*Vt => 0,1*83,41=8,341 Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg => 83,41-8,341 = 75,069 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/2 => 42,84/2 = 37,5 Katseklaasistatiivi asetati 38 katseklaasi nummerdatult. Seejärel avati kolonni väljavooluava ja reguleeriti kiirus optimaalseks (2 ml fraktsiooni kogumiseks kulub 2-3 minutit)
liikuvusteguriga Rf V x −V min x Rf = V max−V min x x Kromotogramm - kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Tööd teostasin kolonni juures nr 2. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 23,3 cm ja diameetri D = 1,6 cm. Arvutasin 2 täidise kogumahu Vt = π ∙ r ∙ L = 0,82*23,3* π =46,85 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n =
geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt. Vxmax = Vt Vg Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex fine G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·r2 = 114,45 · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53
ka automaatne fraktsioonide kogumine. Sellel praktikumil aga kasutasin mitte autoaatne kromatogrageerimissüsteem. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis juba eelnevalt on täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Meie töös uuritavate ainesegude lahutamiseks sobivad reeglina väiksema poorsusega (tihedamad) Sephadex'i margid, mis on samas ka mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine, kooniline osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on
ka automaatne fraktsioonide kogumine. Sellel praktikumil aga kasutasin mitte autoaatne kromatogrageerimissüsteem. Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis juba eelnevalt on täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Meie töös uuritavate ainesegude lahutamiseks sobivad reeglina väiksema poorsusega (tihedamad) Sephadex'i margid, mis on samas ka mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine, kooniline osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on
¾ graanulitesisese vedeliku maht (Vs), ¾ geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), ¾ täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt = Vv + Vs + Vg Geelfiltratsioonimaterjalide iseloomustus Fraktsioneerimispiirkond, Materjal Mark daltonit (D) Sephadex G-10 50700 G-25 10005000 Dekstraan G-50 100030000 G-75 3000-80000 G-100 4000150000 G-200 5000600000 Bio-Gel
4. Liidab rakke agregaatideks. 5. Takistab hapniku difusiooni rakku (streptokokid, õhulämmastiku sidujad) 6. Lima suunatud eritamine rakust välja libiseval liikumisel. 7. Aitab kleepuda pinnale ja seob mineraale. Eri koostisega kapslid. Homopolüsahhariidsed kapslid Sahharoosist saab sünteesida kahte sorti homopolüsahhariide: glükaane (koosnevad glükoosist) ja levaane (koosnevad fruktoosist). Leuconostoc mesenteroidese poolt sünteesitavat dekstraani kasutatakse kromatograafias (Sephadex), toiduainetetööstuses paksendajana (jogurt, jäätis jne) ning ka vereasendajana meditsiinis. Sahharoosist sünteesivad levaani paljud taimedega koos elavad bakterid, näiteks Zymomonas mobilis ja Pseudomonas syringae. Levaan on veidi sarnane taimsele varupolüshhariidile inuliinile. Inimesele hea! Stimuleerib soolestikku jne. Acetobacter xylinum'il on tselluloosist kapsel. Sarcina ventriculi'l seob rakke tetraadideks samuti rakuväline tselluloos
a. Dekstraankapsel. Dekstraankapslid sünteesivad Streptococcus mutans, Leuconostoc mesenteroides. S. mutans- kapsel kleebib bakteri hamba pinnale, suhkru käärimisel moodustuv piimhape tekitab kaariest. L. mesenteroides- ohtlik saastaja suhkru- ja kondiitritööstuses. Leuconostoc mesenteroidese poolt sünteesitavat dekstraani (glükoosi polümeer, monomeeride vahel alfa-1,6- sidemed) kasutatakse kromatograafias (Sephadex), toiduainetetööstuses paksendajana (jogurt, jäätis jne) ning ka vereasendajana meditsiinis alates 1947 aastast. Alates 1955 aastast kasutatakse dektraani sünteesil Leuconostoc'i tüve B512, kelle dekstraanis on vähe ahela hargnemisi. Ensüüm, mis dekstraani sünteesib on rakupinnaga seotud dekstraansukraas. Dekstraani tootmiseks kasutatakse bakterist väljapuhastatud ensüümi. Saadud dekstraan
annaabi.ee 
