· Keskmistatud proove (liitproove), s.o. kahe või enama üksik- või sariproovi (osaproovi) segu kindlas vahekorras, võetakse uuritava näitaja keskmise väärtuse määramiseks. · Ajakeskmine proov võetakse vähe muutuva vooluhulga korral, selle saamiseks segatakse kokku kindla aja tagant võetud ühesuguse mahuga üksikproovid ning seejärel võetakse saadud segust analüüsimiseks vajalik kogus. Kõrgsurvevedelikkromatograafia töö põhimõte: Vedelikkromatograafia on väga efektiivne ja laialt kasutatav meetod keskkonnauuringuteks. See meetod sobib eriti hästi vedelike analüüsiks, sest vedeliku proovi ettevalmistamine ei eelda ekstraktsiooni ja vastavalt sellele ei teki aine kadusid. Vedelikkromatograafias puuduvad piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid. Kromatograaf: kõrgsurvevedelikkromatograaf CLAS MPm (Labio) Detektori tüüp: SAPHIRE UV/VIS detektor
TTÜ keemia ja biotehnoloogia instituut YKA0060 Instrumentaalanalüüs Vedelikkromatograafia Kofeiini ja teobromiini määramine jookides kasutades vedelikkromatograafiat Õpperühm: Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: 1 Töö eesmärk Eesmärgiks on määrata kofeiini ja teobromiini kontsentratsioon joogis (antud juhul rohelises tees) vedelikkromatograafia meetodil. 2 Töö käik Uuritav proov: ROHELINE TEE 1. Valmistada standardlahused (dest. vees) kontsentratsiooniga 3, 10, 15 ja 30 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL (ruumala 1mL) 3 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 0,1 mL lahust + 0,9 mL vett 10 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 0,3 mL lahust + 0,7 mL vett 15 μg/mL (ruumala 1mL)g/mL: 0,5 mL lahust + 0,5 mL vett
Kombineeritud meetodid: kromatograafia ja massispektromeetria see võiks olla vedelikkromatograafia + massispektromeetria. Kõigepealt peaks tutvustama mõlemat meetodit 1-2 kausega, Siis mainima ära, et kuna töö teema on 2 meetodi ühendusest, siis on valitud kummastki meetodiklassist üks esindaja pidades silmas, et need omavahel sobiksid. Siis võib rääkida vedelikkromatograafiast - mis head seal on, kuidas seda keeruliste segude lahutamisel toimib ja ka mis seal puudu jääb (vahel ei lahutu piigid hästi, ainete identifitseerimiseks on vaja standardeid)
Ribosoomid Valkude eraldamise meetodid Väljasoolamine erinevad valgud sadestuvad erineva soolakontsentratsiooni juures Dialüüs eraldamine läbi poolläbilaskva membraani Geelfiltratsioonkromatograafia suuremate ja väiksemate molekulide erinev liikuvus läbi geeli Ioonivahetuskromatograafia laenguga valkude seondumine kolonni Afiinsuskromatograafia valkude afiinsus spetsiifiliste keemiliste rühmade suhtes Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia Valkude keemilised omadused Valkude denatureerumine-pöördumatu muutmine Küsimused Mis on valgud? Mis on valkude ülesanne? Mis on kõige suurem valk? Mis on valkude denatureerumine? Mis on saperonid? Sõnaseletused Dalton-aatommassiühik Saperonid-tugivalgud Aminohapped-orgaanilised uhendid Geenitranskriptsioon-ümberkirjutis/kujutis Ligand-seotav molekul Ensüümid-kõrgmolekulaarsed bioloogilised katalüsaatorid Protos-esimene, tähtsam
sorbtsioon/desorbtsioonMobiilne faas e. eluentStatsionaarne faas e. kolonni täidismaterjalAine retensiooniruumala ; mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik poole aine koguse elueerimiseks kolonnist Kromatograafia tüübid: Ioonvahetus kromatograafia: *Komponendid liiguvad piki kolonni, rohkem kinni peetud komponent asendab vähema. *Näiteks vee pehmendamine, ioonvahetuskolonniga; *ei saa komponente täielikult lahutada; *kolonni pikendamine ei mõju -Gaaskromatograafia: -Vedelikkromatograafia (LC): A on väga väike, B ja C on väikesed, sest vedelikes on difusioon palju väiksem kui gaasides. -Elektroforees:Meetodid: Paber-, geel-, kapillaarelektroforees Põhimõte: elektrivoolu toimel liiguvad ioonid, aminohapped või valgud läbi keskkonna (statsionaarse faasi) või läbi kapillaari. Selle protsessi käigus liiguvad ioonid erinevate kiirustega ja on eraldatavad. Kasutamine: DNA, RNA, ioonsed ühendid Põhimõisted kromatograafia:
YASM11 Õppejõud: Piia Teostati: 12.10.15 Jõul Teooria Gaasikromatograafia on füüsikaline lahutusmeetod, kus segu komponendid jaotatakse kahe faasi vahel, millest üks on liikumatu sorbent ja teine, kandegaas, liigub määratud suunas. Tingituna erinevast sorbeeritavusest liiguvad segu komponendid läbi kolonnis oleva sorbendi erinevate kiirustega. Tulemusena komponendid eralduvad üksteisest, moodustades tsoonid, mis on eraldatud puhta kandva gaasi tsoonidega. Gaasi-vedelikkromatograafia puhul kasutatakse sorbendina kõrgeltkeevaid vedelikke, mis suurema kontaktipinna loomiseks kantakse tahkele kandjale (täidiskolonnid) või peene kapillaari siseseintele (kapillaarkolonnid). Komponentide eraldamine põhineb nende jaotuskoefitsientide erinevusel vedela ja gaasifaasi vahel. Siin mängib rolli nii komponentide erinev lenduvus kui erinev lahustuvus vedelfaasis. Vedelfaasis hästilahustuvad komponendid hoitakse kolonnis kauem kinni, halvemini lahustuvad väljuvad kiiremini.
elueeriv jõud ehk võime kanda ainet läbi liikumatu faasi. See tähendab, et kromatografeeritav aine ja liikuv faas konkureerivad üksteisega liikumatu faasi pinna pärast. Mida lähedasemad on liikumatu faasi ja uuritava aine polaarsused, seda paremini seondub aine liikumatule faasile. 3.1 Kromatograafia liigid. Agregaatoleku järgi 1) gaaskromatograafia liikuvaks faasiks on sobiv gaas, nt lämmastik,vesinik või heelium. Solvendiks võib olla vesi, benseen vms; 2) vedelikkromatograafia; 3) gaas-vedelikkromatograafia tegemist kromatograafia eriliigiga. Kolonn on täidetud tahke kandja osakestega, millele on kantud vedel faas. Absorbeerub vedelas faasis, mitte tahkel. Liikumatu faasi ja aine vastasmõju järgi 1) molekulaarkromatograafia see on kromatograafia liik, millest enamasti räägime. Sorbaat on sorbendile sorbeerunud aine ehk aine, mida soovime lahutada. Sorbendi ja sorbaadi vaheline mõju on üsna nõrk ehk tegemist on füüsikalise sorptsiooniga
mitmekordne sorbtsioon/desorbtsioonMobiilne faas e. eluentStatsionaarne faas e. kolonni täidismaterjalAine retensiooniruumala ; mobiilse faasi ruumala, mis on vajalik poole aine koguse elueerimiseks kolonnist Kromatograafia tüübid- Ioonvahetus kromatograafia: Komponendid liiguvad piki kolonni, rohkem kinni peetud komponent asendab vähema. Näiteks vee pehmendamine, ioonvahetuskolonniga; ei saa komponente täielikult lahutada; kolonni pikendamine ei mõju Gaaskromatograafia: Vedelikkromatograafia (LC): A on väga väike, B ja C on väikesed, sest vedelikes on difusioon palju väiksem kui gaasides. Elektroforees: Meetodid: Paber-, geel-, kapillaarelektroforees Põhimõte: elektrivoolu toimel liiguvad ioonid, aminohapped või valgud läbi keskkonna (statsionaarse faasi) või läbi kapillaari. Selle protsessi käigus liiguvad ioonid erinevate kiirustega ja on eraldatavad. Kasutamine: DNA, RNA, ioonsed ühendid Põhimõisted kromatograafias-
........................ 21 4.6 Aatom-massispektroskoopia ......................................................................... 21 4.7 Röntgenfluorestsents spektroskoopia (XRF) ................................................ 22 5 Kromatograafia ................................................................................................. 22 5.1 Gaaskromatograafia ...................................................................................... 24 5.2 Vedelikkromatograafia .................................................................................. 24 5.3 Ioonkromatograafia ....................................................................................... 25 5.4 Ainete identifitseerimine mass-spektromeetriliselt ....................................... 26 6 Keskkonnaproovide eripära: hapnikutarbel põhinevad meetodid ....... 27 6.1 Ühendite degradeeruvus ..........................................................................
TTÜ keemiainstituut Analüütilise keemia õppetool YKA0040 Lahutusmeetodid keemias Laboratoorne töö: Segu komponentideks lahutamine HPLC pöördfaasikromatograafia abil ning detekteerimine UV- detektoriga Õpperühm: Teostaja: Ilona Juhanson YASM11 Õppejõud: Heidi Teostati: 23.10.15 Lees Teooria: Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) on füüsikaline lahutusmeetod, kus analüüsitava proovi lahutamine koostisosadeks põhineb komponentide jaotumisel statsionaarse ja mobiilse faasi vahel, lubades erinevate ainete kvalitatiivset ja kvantitatiivset analüüsi. Statsionaarne faas on paigaldatud kolonni sisse ning mobiilne faas voolab läbi kolonni kandes endaga kaasa analüüsitavat proovi. Mobiilse faasina kasutatakse polaarseid (nt vesi) või mittepolaarseid orgaanilisi solvente (nt heksaan) ja statsionaarse faasina
Lambert-Beeri seadus ütleb, et lahuse neelduvus on võrdeline absorbeeriva aine kontsentratsiooni ja lahusekihi paksusega. Fikseeritud lahusekihi paksuse korral on UV/Vis spektroskoopiaga võimalik määrata neelava aine kontsentratsioon lahuses. Selleks on vaja teada, kui kiiresti neelduvus muutub kontsentratsiooni suurenemisel. Seda saab leida molaarsete neeldumiskoefitsientide tabelitest või määrata kalibreerimisgraafikult. UV/Vis spektromeetrit saab kasutada HPLC(kõrgefektiivne vedelikkromatograafia) detektorina. Analüüdi olemasolu annab signaali, mis on proportsionaalne kontsentratsiooniga. Täpsete tulemuste saavutamiseks on vaja analüüdi signaali tundmatus lahuses võrrelda referentsaine signaaliga. See lähenemine sarnaneb kalibreerimisgraafiku meetodile. Absorptsiooni piikide lainepikkus korreleeruvad molekulis olevate keemiliste sidemetega. See aitab määrata, milliseid funktsionaalrühmi molekul sisaldab. Woodward-Fieser´i reeglid on
Siiski, ka väga efektiivse kapillaarkolonni puhul võivad mõnede ühendite retentsiooniindeksid kokku langeda ja sellepärast ei saa alati kindel olla identifitseerimise tulemustes. Sel juhul tuleks kasutada lisaks teistsuguse polaarsusega kolonni või ka massispektromeetria abi. Retentsiooniindeksite süsteeme kasutatakse tänapäeval ulatuslikult eriti lõhna- ja maitseainete tööstuses ja naftaproduktide analüüsil. 24. Vedelikkromatograafia põhimõte Mobiilseks faasiks on vedelik, sobib kõikidele analüütidele mis lahustuvad vedelas faasis (bioloogilised ained, anorgaanilised ühendid), retsensioon sõltub interaktsioonidest nii mobiilses kui ka statsionaarses faasis. Statsionaarse faasina kasutatakse väga peeneteralisi kromatograafilise kolonni täidiseid. Peeneteraalise täidise suure takistuse tõttu tuleb proovi elueerimiseks läbi kolonni kasutada survepumpa. 25
Retentsiooniindeksi definitsioon ja kasutamine gaasikromatograafias. Gaaskromatograaf- Leekionisatsioon- põlevad ained; soojusjuhtivus- universiaalne. Vedelikkromatograaf- Retsensiooniindeksi ja nende kasutus gaaskromatograafias- 14. Võrrelge omavahel gaasikromatograafiat ja vedelikkromatograafiat (mobiilse ja statsionaarse faasi olemus, lahutusmehhanism). Keemilisel seotud statsionaarsete faaside süntees. Vedelikkromatograafia variandid: pööratud faasi kromatograafia, eksklusioonkromatograafia, ioonkromatografia. Võrdlus- Gaaskromatograafias on mobiilseks faasiks heelium, lämmastik, õhk, argoon. Vedelikkromatograafis on mobiilseks faasiks vedelik. GK on statsionaarseks faasiks 700 erinevat ühendit. VG on statsionaarseks faasiks- Lahutusmehhanismid- GK ainete öahutamist kolonnis põhjustab proovi molekulide erinev adsorptsioon liikumatus gfaasi pinnal
detektoriga ühilduvad (MS-i puhul peab gaasiks olema He), ökonoomne, ohutu, efektiivne (ajaliselt). H2, N2, He Ei vaja pumpasid, kuna ballooni rõhust piisab. Võib-olla voo regulaator Voolukiiruse mõõtmiseks kasutatakse kolonni alguses rotameetrit või seebimulliga voolumeetrit kolonni lõpus. Täidiskolonnid - 2-4 mm siseläbimõõt, reeglina 1-2 m pikkused. Täidiseks poorne materjal. Gaas-adsorptsioonikromatograafia (täidis on stats.faas), gaas-vedelikkromatograafia (täidis on kandja stats.faasile). Kapillaarkolonnid - 0,1-0,5 mm siseläbimõõt, piikkuseks 5-100 m. Materjaliks polüimiidiga kaetud kvartskapillaarid. Vedelikukile on stats.faasiks, mis kantakse 0,1 - 5 μm paksuselt kapillaari siseseinale. GC stats.faas peab olema termiliselt stabiilne ja hea eristusvõimega. Siloksaanid on head. CH3-rühmaga modimine vähendab polaarsust, tsüaanopropüülrühmad aga just suurendavad polaarsust.
· Produkti adsorbeerimine tahkele kandjale nagu paber, klaas, ioonvahetuskandjad. · Kromatograafilised lahutusmeetodid: o lahutus võib põhineda substraadi ja produkti erineval, o molekulmassil (geelfiltratsioon), o hüdrofoobsusel (pööratud faasi kromatograafia), o ioniseeritusel (ioonvahetuskromatograafia) , o adsorptsioonil (adsorptsioon-kromatograafia). HPLC ehk kõrgsurve vedelikkromatograafia, paberkromatograafia, kromatograafia õhukesel kihil. Radioaktiivsuse kasutamine ensüümreaktsioonide jälgimiseks: Aktiivsuse määramise radioaktiivselt märgistatud substraadiga: 1. Ensümaatiline reaktsioon: 2. Reaktsiooni peatamine ning P* ja S* lahutamine (kromatograafia, sadestamine, ekstraktsioon jt.) 3. Radioaktiivsuse mõõtmine ja produkti hulga arvutamine Eelised: · Kõige tundlikum meetod, võimalik on määrata produkti koguses10-18-10-17 mooli
seob teatud proovi komponendid. Ülejäänud proov elueerub kolonnis sorbeerumata. Väga suur selektiivsus, mis on kasulik preparatiivseks tööks. Tahked kandjad on hüdrofoobsed: agaroos, tselluloos, polüakrüülamiid. Ligandid: ensüümid, antikeha. Seotud ühendite elueerimine: ligandi lahuse abil. Kasutatakse biokeemilistes rakendustes, kus analüüt seostub statsionaarse faasiga, kõik muu ei seostu. Valides sobiva eluendi saame analüüdi statsionaarse faasi küljest lahti VEDELIKKROMATOGRAAFIA 116. Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC), selle aparatuur. Ainete eraldamine võib toimuda mitmete erinevate omaduste järgi. Tavalisim: Polaarsus ("tavaline" vedelik-kromatograafia), Iooni laengu ja suuruse suhe (ioonkromatograafia). Vaatleme siin vedelik-kromatograafiat ja ioonkromatograafiat koos. Et eraldamine oleks efektiivne, peab kolonn olema statsionaarse faasiga täidetud väga tihedalt. See toob kaasa vajaduse kasutada kõrget rõhku eluendi surumiseks läbi kolonni
Suured on üle 1000 aluspaarilised deletsioonid ja duplikatsioonid, tuvastatakse kas tsütogeensete meetoditega või: Southern Blot: Näide: kadunud on üks EcoRI restriktsioonisait. Paneme koos normaalse geeniga kokku, lisame EcoRI, mis lõikab kõik juppideks. Lisame fosforiga märgistatud sondi, mis hübridiseerub EcoRI restriktsioonisaidiga. Geelil tuleb välja, sond hübridiseerus erinevate bändidega. [kahtlen sügavalt teksti õiguses] dHPLC denatureeriv kõrgsurve vedelikkromatograafia. Normaalne kõrgsurve kromatograafia denaturatsioonikolonniga. Kolonn lahutab produkte. Hetero- ja homodupleksid tulevad erineval ajal läbi kolonni, sest denatureeriv mõju neile on erinev. Väga kiire, väga täpne, väga kallis. Üldiselt kasutatakse teadaolevate mutatsioonide leidmiseks. SSCP punktmutatsioonide tuvastamiseks (90% 1 nukleotiidi vahetustest leiab üles). 1- ahelaline geenifragment amplifitseeritakse, denatureeritakse, kantakse mittedenatureerivale
Enamkasutatavad on nikkel, koobalt ja vask histidiini sisaldavate valkude puhastamiseks ning raud, tsink või gallium fosforüülitud valkude ja peptiidide puhastamiseks. Reeglina on kromatografeerimisprotsessid aeglased ja labiilsete komponentide koostises võivad toimuda muutused. Samuti on oht proovi komponentide hajumiseks kolonni läbimise vältel, mistõttu lahutusvõime langeb. Kaasajal kasutatakse laialdaselt kõrgsurve- vedelikkromatograafia meetodit (HPLC, high-performance liquid chromatography). Sellega saavutatakse kõrge lahutusvõime tänu väga väikeste (35 m), sfääriliste ja võimalikult ühesuuruste kandjaosakeste kasutamisele, mille puhul vedeliku kolonnist läbisurumiseks rakendatakse rõhku suurusjärgus 50700 atm. Mõistetavalt kasutatakse HPLC-s tugevaid metallkolonne. Tulemuseks on segu komponentide väga hea lahutumine ja protsessi kiirenemine tundidelt minutiteni.
annaabi.ee 
