Geelkromatograafia protokoll 2020 (0)

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA  MEETODIL  Protokoll   
 
 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


Sissejuhatus 
 
Geelkromatograafia on kromatograafia meetod, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate                   ainete lahutamine ehk ​fraktsioneerimine molekulmassi suuruse järgi​. Lahuses                 sisalduvad erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise võimalikult ühesuguse                   poorsusega geeli erineva kiirusega. Protsess viiakse läbi kinnises süsteemis - kolonnis, mis                         on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus                     lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega.  
 
Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:  ● kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht Vv 
● graanulitesisese vedeliku maht Vs 
● geelimaterjali ehk maatriksi maht Vg 
● täidise kogumaht ehk üldmaht Vt   
Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu lahutuvad                     molekulid üksteisest vastavalt nende suurusele ehk võimele difundeeruda geeli pooridesse.                     Uuritava ainete segu kolonni transpotimiseks ja ainete eraldamiseks voolutatakse ehk                     elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse                       kindla mahuga fraktsioonide kaupa.  
 
Igat uuritavas segus sisalduvat ainet iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille                       arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Uuritavas segus                     sisalduva aine x väljumismaht on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub                         fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Kui segus on molekule,                       mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, väljuvad nad kolonnist                         esimesena ehk minimaalse elueerimismahuga Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahuga.                       Ained, mille molekulmass võimaldab täielikult geeli pooridesse difundeeruda, liiguvad                   kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on                     arvväärtuselt lähedane kolonni kogumahule Vt. Kromatografeerimise protsessi võib lugeda                   lõppenuks, kui kolonnist väljunud vedeliku üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.  
 
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks olulised parameetrid:  ● kolonni vaba maht Vv ehk eluaadi maht, millega väljuvad antud geeli pooridesse                         mittemahtuvad molekulid  ● maksimaalne elueerimismaht Vxmax ehk eluaadi maht, millega väljuvad geeli                   graanulitesse täielikult sisenevad molekulid   
Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille                       elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse                 liikuvusteguriga Rf ​, mis arvutatakse vastavalt valemile ​Rf=(Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)   
Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist                     sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks.  
 


Töö käik 
  1. Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine  Praktikumis kasutati klaaskolonni, mis oli eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga                   Sephadex G75, k=0,1 ​. Kolonni alumine kooniline osa oli täidetud klaasvillaga täidise                       väljavoolamise vältimiseks.  
 
Mõõtsin joonlauaga vajalikud andmed:  ● geelisamba kõrgus L=13,1cm 
● diameeter d=2,8cm   
Tegin vajalikud arvutused:  ● Täidise kogumaht:  ​Vt​=​π​*1,4​^2​*13,1=​80,66cm​^3  ● Geelimaatriksi maht  ​Vg​=k*Vt=0,1*78,2=​8,066cm^3  ● Maksimaalne elueerimismaht  ​Vxmax​=Vt-Vg=80,66-8,066=​72,53cm^3  ● Fraktsioonide üldarv  ​n​=Vxmax/2=​36,3~36    2. Proovi sisestamine ja segu komponentide lahutamine  Avasin kolonni väljavooluava ning lasin vedeliku tasemel langeda täidise pinnani. Seejärel                       sulgesin kolonni väljavooluava ja kandsin pipetiga täidise pinnale 0,5ml uuritavat proovi, mis                         koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Lasin uuritaval proovil                 täidisesse siseneda, hoides kolonni väljavooluosa avatuna. Kandsin pipetiga geeli pinnale                     ~2ml eluenti, milleks oli 0,15M NaCl (0,01% NaN3) ning lasin sellel täidisesse imbuda.                           Kordasin eluendi lisamist ja olles veendunud, et kogu uuritav proov on täidisesse sisenenud,                           kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit nii, et moodustus ~5cm kõrgune vedeliku kiht.  
 
Kogusin eluenti keeduklaasi ühendatud fraktsioonina seni, kuni kõige kiiremini liikuv                     komponent dekstraansinine kolonni alaossa jõudis. Seejärel hakkasin eluenti koguma 2ml                     fraktsioonidena 15ml tuubidesse. Jälgisin pidevalt, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt                       eluenti ja lisasin seda vajadusel pipetiga juurde. Lõpetasin elueerimise siis, kui eluaat oli                           värvituks muutunud. 
  3. Fraktsioonide analüüsimine.   Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorptsiooni                   väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Selleks                 mõõtsin kõikide fraktsioonide optilise tiheduse spektrofotomeetril kolmel lainepikkusel -                   360nm (DNP-aspartaadi neeldumismaksimum), 410nm (müoglobiini neeldumismaksimum)             ja 670nm (dekstraansinise neeldumismaksimum). Tulemused on esitatatud järgnevas                 katseandmete tabelis ja neeldumismaksimumid erinevatel lainepikkustel on esile tõstetud.  
 


Fraktsiooni 
nr  Elueerimismaht V,     ml  Optiline tihedus     A lainepikkusel     360nm  Optiline tihedus     A lainepikkusel     410nm  Optiline tihedus     A lainepikkusel     670nm  Ühendatud 
fraktsioon  18  0  0  0  1  20  0  0  0  2  22  0,1673  0,1346  0,1966  3  24  0,1972  0,1620  0,2289   4  26  0,0965  0,0722  0,1114  5  28  0,0285  0,0253  0,0282  6  30  0,0066  0,0231  0  7  32  0,0159  0,0768  0  8  34  0,0518  0,1875  0  9  36  0,1061  0,3502  0  10  38  0,1642  0,5182  0  11  40  0,2071  0,6435  0  12  42  0,2348  0,7177  0  13  44  0,2305  0,7091  0  14  46  0,1984  0,6217  0  15  48  0,1522  0,4891  0 


 
  16  50  0,1079  0,3619  0  17  52  0,0678  0,2429  0  18  54  0,0422  0,1547  0  19  56  0,0366  0,0963  0  20  58  0,0456  0,0633  0  21  60  0,0820  0,0536  0  22  62  0,1331  0,0632  0  23  64  0,1834  0,0754  0  24  66  0,2220  0,0872  0  25  68  0,2471  0,0968  0  26  70  0,2479  0,0953  0  27  72  0,2300  0,0876  0  28  74  0,1932  0,0701  0  29  76  0,1546  0,0536  0  30  78  0,1143  0,0344  0  31  80  0,0786  0,0184  0  32  82  0,0499  0,0055  0 


Koostasin katseandmete alusel alloleva kromatogrammi ning tõin sellel välja ka segus                       sisaldunud ainete neeldumismaksimumid. Esimesena segust väljunud dekstraansinise               neeldumismaksimum 0,2289 on mõõdetud lainepikkusel 670nm, müoglobiini               neeldumismaksimum 0,7177 lainepikkusel 410nm ja DNP-aspartaadi neeldumismaksimum               0,2479 lainepikkusel 360nm.  
        4. Tulemused ja nende interpreteerimine  Segus sisaldunud komponendid väljusid järgmises järjekorras:   1. Dekstraansinine 
2. Müoglobiin 
3. DNP-aspartaat  Sellest võib järeldada, et   ● Dekstraansinise molekulmass on kõige suurem ja aine väljus minimaalse                   elueerimismahuga Vxmin. Järelikult olid dekstraansinise molekulid liiga suured                 selleks, et geeli pooridesse mahtuda.  ● DNP-aspartaadi molekulmass kõige väiksem ja aine väljus maksimaalse                 elueerimismahuga Vxmax. Järelikult võimaldas DNP-aspartaadi molekulmass             täielikult geeli pooridesse difundeeruda.  
  Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni                 Vxmin=Vv=24ml ​.   Eluaadi maht kuni kõrgeima kontsentratsiooniga valgu väljumiseni  ​Vx=42ml​.   Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsiooniga                 fraktsiooni väljumiseni  ​Vxmax=70ml​.   
Arvutuslik Vxmax väärtus oli 72,53ml, mis on lähedal katse käigus saadud tulemusele 70ml.                           Ebatäpsus võis tekkida näiteks geelisamba kõrguse ja kolonni diameetri mõõtmisel või                       hoopis fraktsioonide kogumisel.  


Liikuvusteguri Rf väärtus segus sisaldunud valgu (müoglobiini) jaoks: 
Rf ​=(42ml-24ml)/(72,53ml-24ml)=​0,37   
 
Kokkuvõte 
 
Antud laboratoorse töö käigus tutvusin geelkromatograafia põhimõtetega ning lahutasin                   geelkromatograafia kolonnis segu, mis koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja                 DNP-aspartaadist. Kolonnist väljus esimesena suurima molekulmassiga aine, milleks oli                   dekstraansinine. Katsetulemuste põhjal koostasin ise kromatogrammi ja katse tulemusel                   leitud Vxmax oli lähedane arvutuslikule Vxmax’ile.