mahuga. Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeerida geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga , mis on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule . Kromatografeerimise protsessi võib lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud eluaadi üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu välja arvutada. Geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu (eluaadi maht, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu (eluaadi maht, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad). Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga .
Vxmin on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga: Vxmin=Vv Ained, mis täielikult difundeeruvad geeli pooridesse (väiksema molekulmassiga), liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, mis on lähedane suurus kolonni kogumahule Vt. Protsessi saab lõppenuks lugeda, kui Vxmax=Vt (kolonnist väljuva eluaadi maht on ligikaudu võrdne kolonni kogumahuga). Kui on teada geelimaatriksi maht Vg, siis saab maksimaalse elueerimismahu Vxmax arvutada nii: Vxmax=Vt-Vg. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx on vaadeldavad kolonnis kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf. Valem on selline: Rf=Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin, kusjuures Rf väärtused peavad jääma vahemikku 0...1. Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelise sõltuvuse graafik. Ainete väljumismahtusid näitavad nende fraktsioonide
Vxmin = Vv
MAKSIMAALNE ELUEERIMISMAHT (Vxmax):
- Ained, mille molekulmass on väiksem, difundeeruvad täielikult geeli pooridesse ning
liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt
- on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt.
Kromatografeerimise protsess on lõpetatud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi)
üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.
Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis võib maksimaalse elueerimismahu ka arvutada
Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja kaht parameetrit:
· kolonni vaba mahtu Vv ), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud
geeli pooridesse ei mahu
· maksimaalset elueerimismahtu , s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid,
mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad
LIIKUVUSTEGUR (Rf): ---> Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse väljuvad kolonnist esimesena ehk minimaalse elueerimismahuga, see aga on võrdne kolonni vaba mahuga. Vx min = Vv Vastupidises olukorras, kui molekulmass on piisavalt väike täielikult geeli pooridesse difundeerumiseks, siis need molekulid liiguvad kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga, mis vastab peaaegu kasutatava kolonni kogumahule. Vx max = Vt Maksimaalse elueerimismahu saab arvutada, kui geelimaatriks on teada: Vx max = Vt - Vg Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1
liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik: Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 32,2 cm ja diameetri d 1,9 cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = 91,296. · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 9,1296 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 82, 16665. · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 41,08. · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat.
Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonn nr.1.Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t) Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3 mg/ml
Töö käik Antud töös kasutan Sephadex G-75 geeli, mille k=0,1. Mõõdan geelisamba kõrguse L=15,5 cm ja sisediameetri d=2,7 cm. Siit saan arvutada geelitäidise kogumahu Vt. d Vt = S p × L = × ( 2 )2 × L 2,7 cm Vt = × ( 2 )2 × 15,5 cm = 88,7 cm3 Siit saan arvutada geelimaatriksi mahu Vg. Vg = k × V t Vg = 0,1 × 88,7 cm3 = 8,87 cm3 = 8,9 cm3 Ning kolonni maksimaalse elueerimismahu Vxmax Vxmax = Vt - Vg Vxmax = 88,7 cm3 8,9 cm3 = 79,8 cm3 Siit arvutan fraktsioonide üldarvu, kus ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml max Vx n= 2ml 79, 8 ml n= 2 ml = 39,9 = 40 Seejärel lasen eluenti (0,15 M NaCl lahus) kolonnist keeduklaasi, kuni eluendi tase kolonnis langeb täidise piirini. Pean silmas, et vedelikunivoo alla täidise piiri ei langeks, muidu satub geelikihti õhk, mis võib katsetulemusi mõjutada. Hoides
27 76 2,422 360 28 78 1,168 360 29 80 0,414 360 30 82 0,119 360 31 84 0,027 360 32 86 0 360 Elueerimismahu ja optilise tiheduse suhe 4 3.5 3 2.5 A 2 1.5 1 0.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 x-teljel elueerimimaht V (ml), y-teljel optiline tihedus A, maksimumpunktid A=0,972 (24 ml), A=3,436 (36 ml) ja A=3,135 (74 ml). 0-18 ml on ühendatud fraktsioon. Vxmin = 24 ml Vx = 36 ml Vxmax = 74 ml
Tööd teostasin kolonni juures nr 2. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 23,3 cm ja diameetri D = 1,6 cm. Arvutasin 2 täidise kogumahu Vt = π ∙ r ∙ L = 0,82*23,3* π =46,85 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 42,165/2≈21. Võtsin 21 kaliibritud katseklaasi Märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, Panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine Segu koostis: deksatraansinine 3 mg/ml; müoglobiin 6 mg/ml; DNP-aspartaat 0,3
Eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vx = 33,5 ml. Viimasena väljus kolonnist DNP-aspartaat, mis näitab seda, et selle aine molekulmass on kõige väiksem, st küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse. Seetõttu liigub ta kolonnis kõige aeglasemalt ja väljub maksimaalse elueerimismahuga. Eluaadi maht kuni kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmax = 65,5 ml. D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahu võrdlemine arvutusliku Vxmax-ga Viimasena väljunud komponendi elueerimismaht on V = 65,5 ml, arvutuslikult tuli Vxmax = 60,24. Erinevus on ~5 ml, mis võis tingitud olla näiteks geeli või täidise mahtude arvutamisel tekkinud ebatäpsustest, kuna joonlauaga ei pruukinud geeli samba kõrguse ja diameetri mõõtmistulemused olla väga täpsed. E. Liikuvusteguri Rf väärtuse leidmine segus sisaldunud valgu jaoks
liikuvusteguriga Rf: Rf = Vx - Vxmin / Vxmax - Vxmin Töö käik Kolonn ja selle ettevalmistamine: · Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex fine G-75 k=0,1. · Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 16,8 cm ja diameetri d = 2,7 cm r= 1,35cm, kasutades joonlauda. Arvutasin täidise kogumahu Vt = L·r2 = 114,45 · Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k * Vt = 11,44 ja kolonnile iseloomuliku max elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 103,01 · Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 53 · Nummerdasin vajaliku arvu kaliibritud katseklaase, märkisin üles voolutuslahuse koostise: elueerimispuhver NaCl M =0,15 pH = 7,5, panin valmis 50 ml seisukolvi täidise pinnal oleva eluendi kogumiseks. Segu komponentide lahutamine: · Segu nr. I: Dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat.
vedeliku mahuga Vv. Vxmin = Vv Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga V xmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule V t. Vxmax = Vt. Kromatografeerimise protsess on lõppenud, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib arvutada maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg Kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin) ja maksimaalset elueerimismahtu Vxmax. Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile: Rf = (Vx Vxmin) / (Vxmax Vxmin) Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1. Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist
Vxmin, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Teisena väljus kolonnist müoglobiin, sest selle molekulid difundeerusid kasutatava geeli pooridesse. Kolmandana väljus kolonnist DNP aspartaat, sest selle aine molekulmass oli nii väike, et see difundeerus täielikult geeli pooridesse ja liikus kolonnist kõige aeglasemalt välja. Elueerimismaht on maksimaalne Vxmax D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahu võrdlus arvutusliku Vxmax väärtusega. Vxmax (tegelik) = 54 ml Vxmax (tegelik) = 78 ml Vxmax (arvutuslik) = 111,96 ml 112 ml Vxmax (arvutuslik) = 77,76 ml 78 ml Arvutuslik Vxmax-i on oluliselt suurem tegelikust Vxmax ist. Selline viga tekkis ilmselt seetõttu, et ma ei kandnud proovi geelile ühtlaselt. Viga võis tekkida ka kolonni diameetri ja kõrguse mõõtmisel, mis viis arvutusliku Vxmax-i veani.
o Märkisin ülesse kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i margi Sephadex G-75 ja seda iseloomustava teguri k=0,1. o Mõõtsin geelisamba (täidise) kõrguse l=32 cm ja diameetri d=1,6 cm, kasutades sobivat joonlauda. o Arvutasin täidise kogumahu Vt = Vv + Vs + Vg = PI*(d/2)2*l = 64 cm2. o Arvutasin geelmaatriksi mahu Vg = k*Vt = 0,1*6,4= 6,4 cm2 ja sellest lähutvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 64cm2 6,4 cm2 = 57,6 cm2. o Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n= Vxmax/2 = 57,6/2 =~29. o Katseklaasistatiivile asetasin fraktsioonide arvule (29) vastava hulga kindla mahu järgi (2 ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdasin. o Kolonni lähedusse paigutasin voolutuslahuse (eluendi) pudeli ning märkisin
Vx min = Vv Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem, kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt). Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.
Vx min = Vv Aine, mis jõuab kolonnist viimasena, väljub maksimaalse elueerimismahuga(Vxmax). Selle aine molekulid on küllaltki väiksed, et täielikult difundeeruda geeli pooridess ning liiguvad aeglasem, kui teiste ainete molekulid. See maht on peaaegu võrdne kasutava kolonni kogumahuga(Vt). Vx max Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vxmax = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: · kolonni vaba mahtu Vv (Vx min), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, · maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.
liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vxmax, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt. 48 Seega võib kromatografeerimise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga. Vxmax Vt Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vib maksimaalse elueerimismahu Vxmax ka arvutada. Vx max = Vt Vg Seega kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit: ¾ kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, ¾ maksimaalset elueerimismahtu Vxmax, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.
annaabi.ee 
