Marilin Karu 142627YAGB22 Juhendaja: Malle Kreen Töö teoreetilised alused Proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. E + S = ES = EP -> E + P Töös kasutati proteaasi alkalaas, mis lagundab valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, saades vabu aminohappeid. Alkalaas kuulub endopeptisaaside rühma. Alkalaasi aktiivsuse määramine toimus pH=8,4 juures (boraatpuhvri pH=8,4), mis tähendas, et tegu oli leelisproteaasiga. Substraadiks kasutati kaseiini (2%). See on piima põhivalk, koostiselt fosfoproteiin. Proteaasi aktiivsust määratakse meetodiga, mis põhineb kaseiini hüdrolüüsil alkalaasi toimel ja järgneval TKÄ-ga (trikloroäädikhappega) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. TKÄ (5%) lisamisel peatatakse edasine
kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. 3.2.2 Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST TÖÖLAHUSE VALMISTAMINE: 1. Valmista uuritavast protaasi preparaadist (ALKALAAS) ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus. NB! Ensüümi kontsentratsioon olgu vahemikus 1-5 mg/ml 2. Kooskõlasta juhendajaga: · Alkalaasile sobiv puhver Boraatpuhver, pH= 8,4 · Lahuse täpne maht 5 ml · Alkalaasi kontsentratsioon lahuses 1,66 mg/ml 3. Arvuta ensüümpreparaadi kaaluklaasi vajalik kogus ensüümpreparaati (analüütiline kaal): 4. Kaalu sobiva suurusega kaaluklaasi vajalik kogus (8,3 mg) alkalaasi. 5. Vii kadudeta (kvalitatiivselt) preparaat lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse (gradueeritud katseklaas). 6. Lisa väike kogus puhverlahust ja sega klaaspulgaga minutit kuni alkalaasi lahustumiseni. NB! Selget lahust ei teki, sest preparaadid sisaldava täiteainet
sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja. Lahusesse jäävad pärast filtreerimist vabad aminohapped ja madalamolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Trp, Phe) on nähtavad spektrofotomeetriliselt lainepikkustel 270-280 nm. Töö käik Kõigepealt valmistatakse ensüümipreparaadist töölahus. 5 ml töölahuse saamiseks pidin kaaluma 10 mg alkalaasi preparaati. Kaalumisel sain aga 12,0 mg ning pärast õppejõuga konsulteerimist otsustasin selle kaalutis edasi töötada. Uue kaalu korral oli vaja võtta puhverlahust (boraatpuhver, pH=8,4) 6 ml. Paraku valasin seda graduleeritud katseklaasi liiga palju ning sain 10 ml lahust. Järjekordsel konsulteerimisel õppejõuga otsustasin jätkata väiksema kontsentratsiooniga lahusega. Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml. Edasi tehakse ettevalmistusi ensüümireaktsiooniks
sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja. Lahusesse jäävad pärast filtreerimist vabad aminohapped ja madalamolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (Tyr, Trp, Phe) on nähtavad spektrofotomeetriliselt lainepikkustel 270-280 nm. Töö käik Kõigepealt valmistatakse ensüümipreparaadist töölahus. 5 ml töölahuse saamiseks pidin kaaluma 10 mg alkalaasi preparaati. Kaalumisel sain aga 12,0 mg ning pärast õppejõuga konsulteerimist otsustasin selle kaalutis edasi töötada. Uue kaalu korral oli vaja võtta puhverlahust (boraatpuhver, pH=8,4) 6 ml. Paraku valasin seda graduleeritud katseklaasi liiga palju ning sain 10 ml lahust. Järjekordsel konsulteerimisel õppejõuga otsustasin jätkata väiksema kontsentratsiooniga lahusega. Kontsentratsioon pidi olema 2 mg/ml, minu katses oli 1,2 mg/ml.
sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270- 280nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi (leelisproteaas, pH 8,4) · Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 7,6 mg (soovitatav oli 7,5 mg) ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) · Lahus tehakse 10 ml graduleeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine · Võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2% kaseiini lahust pH 8,4 juures · Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 kraadi juurde 10 minutiks · Võetakse 4 kuiva katseklaasi ja nummerdadakse · Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5% TKÄ lahust
detekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml, kusjuures 1 µmol = 181µg = 0,181 mg. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Alkalaasi preparaadist valmistasin ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse. Arvutasin, et 5 ml lahuse valmistamiseks on vaja 10 mg alkalaasi preparaati. Analüütilisel kaalul sain kaalutiseks 10,7 mg. Viisin ensüümipreparaadi kadudeta katseklaasi. Lisasin 5 ml boraatpuhvrit, mille pH oli 8,4. Segasin lahust klaaspulgaga, et ensüüm lahustuks. Kuna preparaadid sisaldavad ka täiteainet, siis selget lahust ei tekkinud.
Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine • Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi. • Alkalaasi kaaluti analüütilisel kaalul 17,9 mg ja tehti sellest 5 ml lahust boraatpuhvris (pH 8,4) gradueeritud katseklaasi Ensüümireaktsiooni läbiviimine • Võetakse 50 ml katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2% kaseiini lahust pH 8,4 juures • Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 kraadi juurde 10 minutiks • Võetakse 4 kuiva 20 ml katseklaasi ja nummerdadakse • Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5% TKÄ lahust
Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml sobiva pH väärtusega 2% kaseiini lahust ja asetatakse vesitermostaati 30 oC juures umbes 5-10 minutiks soojenema. Siis võetakse 4 kuiva katseklaasi pipeteeritakse igaühte 3 ml 5% TKÄ lahust. TKÄ-d kasutan, kuna see ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab hüdrolüüsireaktsiooni. Kui kaseiini lahus on 30 oC-ni soojenenud, alustatakse kaseiini hüdrolüüsi. Selleks pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml alkalaasi lahust, loksustatakse ja fikseeritakse aeg kella järgi. Peale ensüümi lisamist võetakse võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu ning viiakse esimesse TKÄ-d sisaldavasse latseklaasi (0-proov). Loksutatakse hoolega. Täpselt 5 minuti pärast korratakse toimingut. Nii kolm korda. Peale viimast proovi aga võtan kolvi reaktsiooniseguga vesitermostaadist välja. Katseklaasid proovidega jäetakse täielikuks sademe formeerumiseks 10-15 minutiks seisma.
Proteaasid jagunevad seriin-, tiool-, aspartaat-, ja metalloproteaasideks. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik · Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni puhverlahusega ja loksutati läbi.
Proteaasid jagunevad seriin-, tiool-, aspartaat-, ja metalloproteaasideks. Kuna hüdrolüüsinud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav siis avaldatakse proteaaside aktiivsus valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide hulga kaudu. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgnevad trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Töö käik · Alkalaasi ensüümist valmistati 5ml lahust, kus ensüümi konsentratsioon oli 1,5mg/ml. Selleks kaaluti analüütilisel kaalul kaaluklaasi 5 · 1,5 = 7,5mg = 0,0075g ensüümipreparaati ja viidi see kvantitatiivselt gradueeritud katseklaasi. · Lisati väike kogus boraatpuhvrit (pH = 8,4) ja segati 5 min klaaspulgaga. Seejärel täideti katseklaas 5ml-se mahuni boraatpuhvriga ja loksutati läbi.
kus C türosiini kontsentratsiooni muutus, mg/ml t hüdrolüüsi kestus, s V1 hüdrolüüsisegu üldmaht, ml V2 ensüümilahuse üldmaht, ml V3 ensüümi maht hüdrolüüsisegus, ml g proteaasi kaalutis 181 türosiini molekulmass 2 TKÄ lahusest tingitud lahjendus A = kat/ml Järeldus o Saadud tulemus näitab, et 30 C juures on alkalaasi aktiivsus 9,38 kat/ml, st 1 sekundi jooksul hüdrolüüsiti 9,38 mooli peptiidsidemeid.
II kolb 5mg/ml III kolb 8,2mg/ml Invertaasi preparaadi aktiivsus arvutatakse: A = (C2 – C1) • V1 V2 • 103 / (T • 180 • V3 • V4 • g) C1 =1,8mg/ml C2 =5mg/ml ja 8,2mg/ml V1 =25ml V2 =5ml 103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele T =600s ja 1200s 180 – glükoosi molekulmass V3 =1ml V4 =1ml G =0,01g A1=370,4 µkat/g A2=370,47 µkat/g Kokkuvõte Invertaasi preparaadi aktiivsus oli 370,43 µkat/g. Ühik kat/g tähendab, et 1 sekundi jooksul 1g alkalaasi katalüüsib 1mol kaseiini. Kuna A1 ja A2 arvutused andsid sarnase tulemuse, olid mõõtmistulemused õiged ja üsnagi täpsed.
Seetõttu avaldatakse valgu hudroluusi produktide sisaldus turosiini mikromoolidena (1 mikro mol = 0,181 mg). Aktiivsus väljendatakse 1 g ensuumi või 1 ml ensuumilahuse kohta (mikro kat/g, mikro kat/ml). 3. Töö käik: 1. Võtsime antud ensüümi alkalaasi ja tegime segu: 0,0055 grammi ensüümi (kaalusime analüütilistel kaaludel) lahjendasime 5 ml-ni boraat puhvri lahuega. 2. Võtsime 50 ml-lise katseklaasi ja valasime sinna kaseiini, panime 10ks minutiks termostaati 30ne kraadi juurde soojenema 3. Siis valmistasime 4 katseklaasi kuhu panime TKÄ 3 ml igasse. 4. Kui 10 minutit möödus, võtsime 1 ml ensüümi lahust elektroonpipetiga ja
funktsioonide täitmises. Näiteks toiduvalkude seedimises ja kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadides. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase: · Eksopeptidaasi esindajateks on karboksüpeptidaasid ja aminopeptidaasid- need lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid. · Endopeptidaasideks on näiteks savinaasi, alkalaasi omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Ensüümi toimimiseks optimaalne keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (ph~2,5), neutraalseid (pH~7,2), leelisproteaase (pH~9). Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsi uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega mittesadenevaid hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel
Graafikult: Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus arvutatakse vastavalt valemile: Kus: türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus, hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik, reaktsioonisegu (substraat+ensüüm) üldmaht, valmistatud ensüümilahuse üldmaht, TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus ensüümi maht hüdrolüüsisegus, proteaasi preparaadi kaalutis, türosiini molekulmass Järeldused: Alkalaasi proteolüütiline aktiivsus oli minu katse tulemusena , s.t et 1 sekundi jooksul hüdrolüüsiti juures peptiidsidemeid.
annaabi.ee 
