1. Selgita ,,tömbi" ja kohessiivse otste põhimõtet (,,blunt" ja ,,sticky ends") Need otsad saadakse erinevate restriktsiooni tüüpide tulemusena. Tömbi otstele on iseloomulik komplimentaarse aluste baaspaari olemasolu. Lihtsam ligeerida vektoriga. Probleemiks DNA võib endast ümber pöörata ning valesti sisse minna. Kohessiivsed otsad ilmuvad astmelise katkestuste tõttu (trepi sarnased otsad.)
molekulaarbioloogia peamisi meetodeid, mis leiab uha enam kasutamist ka veterinaarias. Rekombinant-DNA tehnoloogia kasutusele votmine on oluliselt avardanud voimalusi uurida geenide molekulaarset struktuuri ning parilikkuse biokeemiat. Uhtlasi on tanu rekombinant- DNA tehnoloogiale astutud kvalitatiivne samm edasi biotehnoloogias ja nakkushaiguste diagnostikas. Rekombinant-DNA tehnoloogia pohimeetodid on jargmised: DNA molekuli lohestamine e loikamine fragmentideks restriktsiooni ensuumide abil, mis lohuvad sidemed nukleiinhapete (NH) vahel spetsiifilise nukleiinhapete jarjetusega piirkonnas (iga ensuumi jaoks eri NH jarjestus) Nukleiinhappeline hubridiseerimine -tanu DNA, RNA molekulide voimele siduda vabasid Nhid on voimalik teataud NH-jarjestusega vabade margistatud DNAfragmentide abil avastada komplementaarse jarjestusega loike uuritavas DNA voi RNA molekulis. DNA kloonimine -uhe DNA fragmendi alusel on voimalik sunteesida sama fragmendi miljoneid koopiaid.
3) Faagi poolt kodeeritud lüsotsüüm lõhub rakuseina Bakteriofaag T4 assambleerimine Kapsiidi komponentide assambleerimisrajad on üksteisest sõltumatud Restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem bakterites Kaitseb bakterirakku bakteriofaagide eest W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud) E. coli tüve B rakkudes paljundatud faagi edasine paljunemine on takistatud tüve K rakkudes ja vastupidi
Seda nähtust kirjeldati esmalt faag lambda ja P2 puhul. W. Arber leidis, et T4 paljunemine on osades E. coli tüvedes restrikteeritud (piiratud). Rakus on olemas metülaasid, mis modifitseerivad nukleotiide spetsiifiliselt restriktaaside poolt äratuntavatest 4 - 6 bp pikkustest DNA järjestustest. Metüleerimata DNA on substraadiks restriktaasidele, mis lõikavad DNA kleepuvate või tömpide otstega fragmentideks. Edasise degradatsiooni viib läbi rakuline nukleaas ExoV. Restriktsiooni- modifikatsioonisüsteemi bioloogiliseks funktsiooniks on võõra DNA degradatsioon (raku enda DNA on spetsiifiliselt samade restriktaaside äratundmissaitidest metüleeritud). Enamlevinud on klass I ja klass III restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem. T-faagide DNA sisaldab hüdroksümetüültsütosiini (HMC) tsütosiini (C) asemel. Selline modifikatsioon kaitseb T4 faagi DNA-d T4 poolt kodeeritud endonukleaaside eest. Vahetult peale faagi infektsiooni ja faagi
Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada. Pärast kui DNA molekul on lahti keerdunud interakteerub EtBr lämmastikaluste vahel ja pärast fluorestseerib UV-kiirgusel. 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi. 8 Töö nr 4: Rekombinantse plasmiidi inserdi suuruse määramine restriktsiooni ja/või PCR abil (kumba meetodit kasutada, otsusta eelmise töö põhjal, hinnates inserdi ligikaudset suurust) Elektroforeesi tulemuste analüüsi käigus otsustati ,et minuga saadud insert on pikk ja sellega pole mõtet PCR-ga analüüsida. Inserdi suuruse määran restriktsiooni teel. Lähteained: Rekombinantne DNA (~100 ng/l) Restriktaas Cfr42I (SacII) (10u/l, Fermentas; http://www.fermentas.com/; vt lisa) Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust)
puudub Põrna DNA endo(II) ahelasisene ester desoksüribonukleaas side, aluse spetsiif. puudub Maomürgi DNA, RNA ekso(I) 3´ ots, aluse fosfodiesteraas spetsiif. puudub Restriktsiooni endonukleaasid Restriktaasid Järjestusspetsiifilised DNA endonukleaasid Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks, et degradeerida ehk restrikteerida võõr DNA molekule Peremeesraku DNA on kaitstud tänu lämmastikaluste spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas Restriktaasid
SNPd - TANDEEMSED kordusjärjestused (nt ACACACAC) · ALLEELE TÄHISTATAKSE NUMBRIGA, MIS ON VASTAVUSES DNA AHELA PIKKUSEGA ALUSPAARIDES (ap VÕI bp BASE PAIRS); mõnikord (hobused) teisendatud tähestikuliseks. e. Piimavalkude polümorfism -Valgu polümorfismid aminohappe muutus peptiidahelas ühe või mitme SNP tõttu DNA kodeerivas piirkonnas (ka indel-id). Polümorfisme piimavalkude geenides saab tuvastada restriktaaside kaasabil . Muutliku DNA lõigu paljundamine. Restriktsiooni reaktsioon. Restriktsioonifragmentide tuvastamine elektroforeesiga seos jõudlusega (piima kg, v% ...) ·mõju piima tehnoloogilistele omadustele ·mõju inimtoidule (sh allergeene) 2. Põlvnemisandmete kontrollimine (ülesanne) 3. Populatsioon. Panmiktiline/ideaalne/geneetilises tasakaalus (Hardy-Weinbergi tasakaaluseadus). Panmiktilises populatsioonis, mis on geneetilise tasakaalu seisundis, püsivad alleeli- ja genotüübisagedused põlvkonniti konstantsed
2 µl 6x DNA värv Arvutused: Puhver: 10 x 1/10 = 1µl Restriktaas: 10U/ µl Tahame saada 0,1U/ µl ja meil on 10 µl. 0,1x10 = 1U 1/10 = x/1 ehk x=0,1 Vesi- 10-5-1-0,1 = 3,9 µl DNA värv: 10 / 5 = 2. Töö käik: Pipeteerime kokku DNA, MQ, restriktaari ja puhvri. Inkubeerime 37 kraadi juures 30 minutit. Valame agaroosgeeli (meie töö puhul oli see enne juba valmis) Peale 30 minutit tsentrifuugin oma kontroll- restriktsiooni, et koguda kokku kaanelt ja seintelst veeaur. Lisame 2 µl 6X DNA värvi ja pipeteerime kogu segu agaroosgeeli hambasse. Voolutame 150V juures 10-15 minutit. Teeme geelist pildi. 13 Minu rada: 5 Milleks teostatakse kontroll-restriktsioon? Et kontrollida, kas eraldatud plasmiid on õige Millise tulemuse sain kontroll-restriktsioonist? Minu tulemus on väga ilus, eraldatud plasmiid tuli õige.
fluorestseerub), vähendab DNA laengut (DNA muutub pikemaks ja jäigemaks). 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1.5% geeli on vaja 0,6 g agaroosi ja , et valmistada 80 ml 0,8% geeli on vaja 0,64 g agaroosi. 10 Töö nr 4: Rekombinantse plasmiidi inserdi suuruse määramine restriktsiooni ja/või PCR abil (kumba meetodit kasutada, otsusta eelmise töö põhjal, hinnates inserdi ligikaudset suurust) Kasutame PCR-i. Restriktsiooni ei saa kasutada, sest meie inserdid on <1000 nukleotiidi ning me ei suuda neid enam detekteerida, kui restriktaasiga lõikame. Lähteained: Rekombinantne DNA (~100 ng/l) Restriktaas Cfr42I (SacII) (10u/l, Fermentas; http://www.fermentas.com/; vt lisa) Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) Agaroos (FMC)
üheahelalisi otsi. Taoliselt on võimalik defineerida ka inserdi sisestamise suunda. 2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga, Näit. CIP (calf intestin phosphatase). Selle tulemusel eemaldatakse vektori 5'fosfaat rühmad ja vektor ei religeeru iseendaga kokku. 3. Tömpide otstega DNA lõikude paremaks sisestamiseks kasutatakse ka linkereid või adaptereid. Linkerid ja adapterid on kaheahelalised sünteetilised oligod, mis sisaldavad restriktaaside poolt äratuntavaid DNA järjestusi (restriktsiooni saite) Esimeses ringis ligeeritakse adapterid või linkerid, mida võetakse DNA fragmentide suhtes suures ülehulgas, et ligeerimisel liidetaks iga fragmendiga adapterid või linkerid. Seejärel linkeritega varustatud DNA restrikteeritakse, et eemaldada linkerite ülearused osad. Edasi fragment puhastatakse ja ligeeritakse soovitud vektorisse.
Seetõttu on faagiteraapia kasutusele võtt efektiivne lahendus biofilmi tekkele ja bakterite multiresitsentsusele. Siiski ei ole faagiresistentsuse tekkimine täielikult välistatud. Bakterid võivad muutuda faagiresistentseteks näiteks siis, kui neil tekivad mutatsioonid vastavates retseptorites, millega faag kinnitub bakteriraku pinnale. Võib ka juhtuda, et need retseptorid kaovad mutatsioonide toimel täielikult ära. Faagiresistentsus võib tekkida ka siis, kui bakter omandab restriktsiooni-modifikatsiooni süsteemi või kui bakteris tekib CRISPR järjestuste blokeerimisel adaptiivne immuunsus. Mõlemal juhul omandab bakter võime lagundada sisse tunginud faagi DNA-d (Nobrega et al., 2015). Siiski ei ole faagiresistentsus nii ulatuslik kui antibiootikumide resistentsus. Faagid üldiselt ei ületa liikide vahelisi piire ning kuna faagid mõjuvad spetsiifiliselt üksikutele bakteritüvedele, siis tekib faagiresistentsus vaid üksikul tüvel,
sageli välja tsentromeeri piirkondades asuva heterokromatiini, siis nimetatakse vastavaid alasid ka C- vöötideks. C-vöötide meetod ehk CBG-meetod (C-vöödid baariumhüdroksiidi ja Giemsa värviga). Meetod hõlmab endas denatureerimist leelisega, järgnevat inkubeerimist 65ºC juures ja värvimist Giemsa lahusega. C-vöödistusega värvuvad valikulkiselt struktuurse heterokromatiini alad nii metafaasis kui ka interfaasi tuumas. C-vöödid on päranduvad kromosoomielemendid. Restriktsiooni endonukleaas/ Giemsa meetod sisaldab endas kromosoomide fikseerimist metafaasis metanool/jää-äädikhappega ja töötlust Dnaasidega. Töötluse tagajärjel tekib C-vöödi sarnane muster. DA/DAPI fluorestsentsanalüüs. Kui inimese kromosoome värvida ainult DAPI-ga (4´-6-diamidino-2- fenüülindool), siis näeb lisaks Q-vöödistusele sarnase mustri ka suuri briljantselt hiilgava heterokromatiini blokke, kuid seda vaid 1. ja 16. kromosoomi puhul. Kui kromosoome värvida
Enamus automatiseeritud sekvenaatoreid laetakse robotitega ja need töötavad 24 tundi järjest. Minimaalne tööjõu kulu. DNA fingerprinting ehk DNA tüpiseerimine (profiling). Ei ole olemas kahte ühesuguse genotüübiga sugulisel teel paljunevat organismi (va. Ühemuna kaksikud) sest: Meioosi I profaasis ristsiire homoloogsete kromosoomide vahel; Juhuslik homoloogide jaotus gameetide küpsemisel; Mutatsioonid; DNA replikatsiooni vead. DNA fingerprinting markerid: RFLP (restriktsiooni saidid). Polümorfsed lõikude pikkused detekteeritakse PCR(forees). Alleel-spetsiifilised oligonukleotiidid. Kordus DNA. Minisatelliidid (VNTR = variable number tandem repeats) - kordused 5-10 aluspaari ( A. J. Jeffreys 1985). Mikrosatelliidid (STR = short tandem repeats) - kordused 2-6 aluspaari. Markerite valiku kriteeriumid: Peavad olema polümorfsed, ainult siis on informatiivsed. Markerid peavad olema ühes lookuses (ainult ühes kohas genoomis). Markerid on neutraalsed
a) Aktiveeritakse omandatud immuunvastus ja indutseeritakse antikehade süntees b) Aktiveeritakse tsütotoksilised T lümfotsüüdid (CTL vastus) c) Aktiveeritakse kaasasündinud immuunsüsteem 13. Milliseid meetodeid allpool toodud valikust on võimalik kasutada, et kontrollida, kas imetaja rakkudesse viidud transgeen on sisenenud meie poolt soovitud kohta? a) Positiiv-negatiiv selektsioon b) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) c) Restriktsiooni fragmentide pikkuse polümorfismi (RFLP) analüüs d) Western blot 14. Mitteinvasiivse prenataalse diagnostika puhul uuritakse? a) Amnioni vedelikus leiduvaid loote rakke b) Koorioni hattudest (platsentast) saadud loote rakke c) Ema veres leiduvat loote rakuvaba DNA-d d) Ema ja loote võimalikku reesuskonflikti e) Kõik siintoodud võimalused on valed 15. Geenide knock-out on väga levinud tehnoloogia meie poolt uuritavate geenide funktsiooni selgitamiseks
pisike plasmiidse DNA sade, mille pealt eemaldasin supernatanti. 8. Pipeteerisin sademele 200 μl 70% EtOH, fuugisin 5 min jooksul, et vabaneda sooladest, ning eemaldasin jälle sademe pealt etanooli. 9. Asetasin sadet kuivatada, et vabaneda etanooli jääkidest. Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s. 58. Nüüd DNA on puhas kontrolliks. 59. 60. 61.Kontroll-restriktsioon 62. Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1
DNA eraldamine: Purusta rakud Lisa soolalahus, et DNA viia lahusesse Lisa orgaaniline lahus (kloroform), et valgud ja rasvad eralduks Lisa alkohol ja DNA sadestub välja Kloneerimine Vektor - DNA molekul mida kasutatakse geneetlise materjali kandjana (viib DNA teise rakku) Neli tüüpi: Plasmiid Bakteri või viiruse faag Kosmiidid Kunstlikud kromosoomid BAC, YAC) Sisaldab: OriC (Origin of replication) multikloneerimise koht (multiple cloning site) Marker geen Restriktsiooni ensüümid - Nö. ,,DNA käärid". Tunnevad ära teatud DNA järjestuse ja katkestavad ahela ( Eco Ri). Bakterid produtseerivad ensüüme nimega restriktsioonilised endonukleaasid. Need ensüümid lõikavad DNA ahelat kindlate 4 - 8 aluspaari pikkuste järjestuste juurest. Funktsioon: kaitsta baktereid faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest
miljoneid koopiaid. 4) DNA fragmendi nukleotiidide järjestuse määramine e sekveneerimine, mis võimaldab määratleda geenide NH-lise koostise, nende täpse asukoha kromosoomis, aga ka geeni poolt kodeeritavate valkude aminohappelise koostise. 5) Insenergeneetika- geenide DNA järjestuse muutmine ja muudetud geenide vôi uute geenide viimine rakkudesse ja organismi. Organismide geneetiline modifitseerimine. Restriktsiooni- ehk piiravad ensüümid 1970. a avastati, et paljudel bakteritel on omadus lõhustada bakterirakku tunginud võõrast DNA-d (peamiselt bakterviiruseid) fragmentideks. Ensüüme e nukleaase, mille abil viiruste DNA lõhkumine toimus hakati nimetama restriktsiooniensüümideks, kuna nad olid määravaks teguriks sellise nähtuse puhul nagu peremehepoolne bakterviiruste infitsee- rivuse piiramine (ingl.k. host restriction).
8. Mis on sünteetilised nukleiinhapped? 1:22-29. Aminohappeid, mis on sünteesitud arvuti poolt kontrollitava robotiga. Saab kasutada kindlalt valku tootva geeni sünteesimisel. Kui teada on nii geneetiline kood kui ka huvipakkuva valgu aminohappeline järjestus on selle info põhjal võimalik sünteesida seda valku sünteesiv geen. 9. Mis on restriktsiooniensüümid? 1:30-36. Ensüümid, mis lõikavad DNA'd spetsiifiliselt järjestustest ning neid nim. ka restriktsiooni kohtadeks. Looduses kasutavad bakterid restriktsiooniensüüme kaitseks neid nakatavate bakteriofaagide eest. Bakteriofaagi sisenedes bakteri rakku restsiktsiooniensüümid lõikavad viiruse DNA mittefunktsionaalseteks väikesteks tükkideks ning päästavad bakteri infektsioonist. 10. Milliseid tüüpe restriktsiooniensüüme te teate ja millised on nende toimimise mehhanismid? Esimeseks restriktsiooniensüümide alamtüübi esindajaks on EcoRI, mis lõikab DNA'd kahest ahelast erinevast
Kordamisküsimused Geenitehnoloogia I Restriktaasid. Restriktaasid on ensüümid, mis lõikavad DNA-d spetsiifilise nukleotiidse järjestuse järgi. Nad teevad seda kõikide DNA’de puhul samamoodi. Neid spetsiifilisi järjestusi nimetatakse restriktsiooni aladeks. Selliseid ensüüme on leitud bakteritest kaitsmaks neid kahjulike viiruste eest. DNA kloneerimine baseerub restriktaaside avastamisel. DNA järjestuse äratundmine varieerub erinevate restriktaaside vahel, lõigates tekivad eri pikkusega “kleepuvad” üleulatuvad osad. “Kleepuvad” üleulatuvad osad võivad olla nii peaahelal kui “komplementaarsel” ahelal. Selliste otstega DNA ahelaid on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita, tekib rekombinantne DNA.
leidmiseks RT-PCR – reverse transcriptase PCR, RNA kopeeritakse pöördtranskriptaasi kasutades cDNAks, seega vaja mRNAd. cDNA amplifitseeritakse Alleelspetsiifiline PCR – praimeri 3’ ots on disainitud nii, et see seostuks täpselt mutatsiooni kohta. Kui ei seondu, ei ole mutatsiooni DNAd võib kloneerida kasutades spetsiaalseid rakkuliine, selleks on vaja tüüp II restriktsiooni endonukleaase. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid palindroomseid (järjestus on mõlema ahela 5’-3 suunas sama) DNA järjestusi ja on võimelised neid kindlas piirkonnas kindlas suuruses (tüüpiliselt 4-8 kb pikk) lõikama, tekitades ülekattuvate otstega fragmente, mis on samaaegselt identsed ja kompelmentaarsed, et saaks komplementaarselt paarduda. Lõigatud DNA fragmente saab sisestada sarnaselt lõigatud vektorisse, mis
Veterinaargeneetika ja aretus 2. kontrolltöö kordamisküsimused 2015 1. Mis on rekombinant-DNA? Restriktaaside abil loodud DNA molekule nimetatakse rekombinant DNA molekulideks 2. Millised on rekombinant-DNA tehnoloogia põhimeetodid? (1) DNA molekuli lôhestamine e. lôikamine fragmentideks restriktsiooni ensüümide abil, mis lôhuvad sidemed nukleiinhapete (NH) vahel spetsiifilise nukleiinhapete järjetusega piirkonnas (iga ensüümi jaoks eri NH järjestus) (2) Nukleiinhappeline hübridiseerimine- tänu DNA, RNA molekulide vôimele siduda vabasid NHid on vôimalik tetaud NH-järjestusega vabade märgistatud DNA-fragmentide abil avastada komplementaarse järjestusega lôike uuritavas DNA vôi RNA molekulis. (3) DNA kloonimine- ühe DNA fragmendi alusel on vôimalik sünteesida sama
saagisele bakteri genoomseid järjestusi ning väheneb renatureeruva plasmiidse DNA kogus iv. hoolikus supernatandi eemaldamisel (tuleb eemaldada võimalikult suur kogus supernatanti, ilma, et sade kaasa tuleks, vastasel juhul kas kaotatakse osa saagisest, või võetakse kaasa jääke) 6. Kontroll-restriktsioon a. Kontroll-restriktsiooni on vaja, et kontrollida, kas saadud plasmiid on õige, see võimaldab ka näha, kas puhastamine oli efektiivne foreesipildilt on näha, kui proovis on lisaks saadud plasmiidile ka näiteks bakteriaalset DNA-d. Valides sobivad restriktaasid, on võimalik kontrollida, kas insert on plasmiidi sisenenud õiget pidi. b. Kasutasime restriktaasi EcoRI, mis lõikab kahelt poolt EcoRV lõikamissaiti, kuhu sisestasime oma inserdi
Seejärel väljub mRNA rakutuumast ja viib endas sisalduva info valgusünteesi paika- ribosoomidesse. Initsiaator(tRNA)koodon määrab ära milline on mRNA molekuli nukleotiidide jaotuvus järgnevatesse koodonitesse. II etapp: Aminohapped asetataxe õigesse järjestusse vastavalt mRNA-ga etteantud geneetilise info dekodeerimisele.Fermendid aktiveerivad aminohappeid ja kindlustavad peptiidsideme tekke aminohapete vahele- translatsioon e. geneetilise info ülekandmine valgule. 43.RFLP e. restriktsiooni fragmendi pikkuse polümorfism(restriction fragment length polymorphisms, RFLP) kui geenimarker. Geneetilise tüpiseerimise meetod. Nende polümorfsete markerite pärandumise analüüsil saab koostada erinevate RFLP-ide aheldatuse kaarte ning analüüsida siis neid juba teadaolevate geenide asukohtade suhtes. 44.Mutatsiooniteooria- (H. de Vries; T. Morgan; H. Muller) *mutatsioonid tekivad äkki; puuduvad nii ülemineku kui ka vahevormid *uued vormid on konstantsed
Seejärel väljub mRNA rakutuumast ja viib endas sisalduva info valgusünteesi paika- ribosoomidesse. Initsiaator(tRNA)koodon määrab ära milline on mRNA molekuli nukleotiidide jaotuvus järgnevatesse koodonitesse. II etapp: Aminohapped asetataxe õigesse järjestusse vastavalt mRNA-ga etteantud geneetilise info dekodeerimisele.Fermendid aktiveerivad aminohappeid ja kindlustavad peptiidsideme tekke aminohapete vahele- translatsioon e. geneetilise info ülekandmine valgule. 43.RFLP e. restriktsiooni fragmendi pikkuse polümorfism(restriction fragment length polymorphisms, RFLP) kui geenimarker. Geneetilise tüpiseerimise meetod. Nende polümorfsete markerite pärandumise analüüsil saab koostada erinevate RFLP-ide aheldatuse kaarte ning analüüsida siis neid juba teadaolevate geenide asukohtade suhtes. 44.Mutatsiooniteooria- (H. de Vries; T. Morgan; H. Muller) *mutatsioonid tekivad äkki; puuduvad nii ülemineku kui ka vahevormid *uued vormid on konstantsed
[9] Regulatsioon Eukarüoodid Eukarüootides on DNA replikatsioon kontrollitud rakutsükli poolt. Rakk läbib kasvamisel ja jagunemisel erinevad rakutsükli faasid, DNA replikatsioon leiab aset S faasis (sünteesi faas). Eukarüootse raku arenemist läbi rakutsükli mõjutavad rakutsükli kontrollpunktid. Kontrollpunktide läbimine on omakorda reguleeritud erinevate valkude, näiteks tsükliinide ja tsükliin-sõltuvate kinaaside interakstioonide poolt.[10] G1/S kontrollpunkt (restriktsiooni kontrollpunkt) reguleerib seda, kas eukarüootne rakk siseneb DNA replikatsiooni ja jagunemise faasi. Rakud, mis seda kontrollpunkti ei läbi, jäävad G0 faasi ning DNA replikatsiooni ei toimu. Kloroplastide ja mitokondrite genoomide replikatsioon toimub rakutsüklist sõltumatult. Rakutsükkel M-mitoosifaas;raku jagunemine, G0-puhkefaas;rakk ei jagune, G1-valmistumine DNA sünteesiks,S-replikatsioonifaas, G2-
Transgenic art)- Võimalused konstrueerida ebanormaalsete omadustega järglasi (monstrumeid). Näiteks sinised tomatid või helenduvad kalad ja imetajad. 5. Horisontaalne geeniülekanne horisontaalne geeniülekanne (ingl. Horizontal gene transfer)- Liikidevaheline geeniülekanne isenditele, kes pole geenidoonori järglased. 6. Geenide kloonimine 1. Restriktaasid a. Kleepuvad ja tömbid otsad b. Restriktsiooni-modifikatsioonisüsteem 2. Rekombinantne DNA a. Kloonimisvektorid b. Multikloonimissait c. Fagemiidid (ekspressioonivektorid) d. Kosmiidid e. Süstikvektorid f. Kunstlikud kromosoomid 7. Restriktaasid, kloonimissait restriktaas (ingl. Restrictase)- Endonukleaas, mis tunneb ära lühikesi spetsiifilisi DNA-järjestusi ja lõikab DNA-molekuli selles restriktsioonisaidis või selle lähedalt katki.
nendel antiviraalsete valkude tootmist (antiviral proteins -AVPs). Peamised tüüp I IFN tootjad on pDC, epiteeli rakud ja fibroblastid. IFN/ süntees peatab viiruse replikatsiooni (inhibeerivad translatsiooni, degradeerivad RNA-d, indutseerivad apoptoosi) ja muudab naaberrakud viirusresistentseks. Interferoon gamma (Tüüp II) IFN: Toodetakse lümfotsüütide (Th1), NK ja MQ poolt. Akiveerib neutrofiile ja makrofaage. Interferooni poolt indutseeritud viiruse vastased mehhanismid- restriktsiooni faktorid (RF): inhibeerivad viiruse replikatsiooni. RF on näiteks raku sisesed membraan-seoselised PRRs, TLRs (toll like receptors) või raku sisesed tsütoplasmaatilised NLRs (NOD like receptors). Sünteesitakse ka TNF (MQ), soodustab apoptoosi, inhibeerib viiruse replikatsiooni. IL12 toodetakse MQ ja DC poolt, aktiveerib NK rakke ja Th1 rakke. 27. Ekstra ja intratsellulaarsete bakterite vastane kaitse Peamisteks loomuliku immuunsuse kaitsemehhanismideks rakuväliste
poolt oluliselt tugevdatud, mis teeb ka TFide lokaalse kontsentratsiooni hästi kõrgeks. Valmistati plasmiidid, mis koosnesid -globiini geenist koos ja ilma 366-aluspaarise lõiguga SV40 DNAst. Need plasmiidid transfekteeriti rakkude kultuuri ja iga tekkinud RNA hübridiseeriti -globiini DNA prooviks (1, 2). Rakkude poolt sünteesitud -globiini mRNA kogus transfekteeriti ühte plasmiidi või teist töödeldi S1 nukleaasi kaitse meetodiga (3). Restriktsiooni lõigu proov, mis oli saadud -globiini cDNA kloonist, oli komplementaarne 5' otsale -globiini mRNA-s. 5'ots proovis märgistati 32P (punane täpp). -globiini mRNA kaitstud proovi hübridiseeriti ~340-nukleotiidine lõik, mida oli lagundatud S1 nukleaasiga, mis lagundab üksikahelalise DNA, aga mitte RNA-DNA hübriidi. Autoradiograafia elektroforeesitud S1-kaitstud lõikudest (4) näitas, et rakud, mida oli transfekteeritud plasmiid 1-ga (1
restriktsiooniensüümi PvuII. Kui restriktsioonimustrid erinevad, ei ole tekitajad epidemioloogiliselt seotud. Antud näite puhul on kasutatud kahte meetodit – restriktsiooni (REA) ja seejärel tekkinud fragmentide sedastamist hübridisatsiooniga. Nukleiinhapete sekveneerimine ja ensümaatiline restriktsioon SEKVENEERIMINE on meetod, mille puhul määratakse nukleiinhappe täpne nukleotiidne järjestus. Sekveneeritud mikroorganismi nukleiinhappe lõigu järgi saab: (1) avastada ja klassifitseerida seni tundmatuid mikroorganisme; (2) identifitseerida juba tuntud mikroorganisme ja nende alavariante;
annaabi.ee 
