Geenitehnoloogia - molekulaargeneetika rakendusharu, DNA-fragmentide (geenide) siirdamine rakkude ja organismide geneetilise informatsiooni muutmiseks või nende käsutamine pärilike haiguste diagnoosimisel ja indiviidide geneetilisel tuvastamisel. Restriktaas -bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. Ligaas -ensüüm, mis ühendab kovalentse sidemega DNA-fragmentide ahelate otsad Kimäär - biol. erineva genotüübiga ja eri organismidest pärit rakkudest koosnev organism. Geeninokaut - geenitehnoloogiliselt rikutud (,,nokauti löödud") geeniseisund Transg. Org. Mikroorganismid, bakterid Uute omadustega organismide abil toodetakse bioloogiliselt aktiivseid aineid: raviühendeid,antikehi,verehüübimisfaktoreid,kasvufaktoreid
fosfodiesteraas spetsiif. puudub Restriktsiooni endonukleaasid Restriktaasid Järjestusspetsiifilised DNA endonukleaasid Produtseeritakse erinevate bakterite poolt selleks, et degradeerida ehk restrikteerida võõr DNA molekule Peremeesraku DNA on kaitstud tänu lämmastikaluste spetsiifilisele metülatsioonile Isoleeritud ja biokeemiliselt iseloomustatud on sadu restriktaase Nomenklatuur tähis tuletatakse isoleerimiseks kasutatud liigi nimest EcoRI E. coli tüvest R isoleeritud esimene restriktaas Restriktaasid Enamus restriktaase on kaksikahelalise DNA spetsiifilised Erinevate restriktaaside hüdrolüüsi tulemusena tekkivad molekulide otsad võivad olla erinevate "etteulatuvate" ahelatega Restriktaasid on endo(I) tüüpi nukleaasid DNA fragmentide katalüütiline HaeIII 5´...GGCC..
On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) vôi siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad".
- bioloogia rakenduslik haru,mille ül-ks organismide geenide muutmine - seisneb DNA valitud lõikude eraldamises,töötlemises in vitro ja siirdamises sana või muu liigi isendi geneetilisse struktuuri - lähtekohaks rekombinantse DNA metoodika loomine - rekombinante DNA-DNA molekul,milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA-fragmendid - restriktaas-ensüümid,mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järejestuste kohalt - enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse(4-8 nukleotiidipaari) eri otstest - kui sama restriktaasiga töödekda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised(nn kleepuvad) otsad - kui need fragmendid lahuses kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad - lõigatakse katki kahte moodi: 1. tekivad kleepuvad otsad-DNA ahelale jäävad ühe ahelalised otsad
46. rekombinantne DNA - DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud 47. reproduktiivne kloonimine - inimese kloonimisvõimaluste käsitlemisel kasutatav mõiste, mis tähendab tuumkloonimist uute isendite saamise eesmärgil 48. restriktaas - bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. 49. retroviirus - RNA-viirus, mis sisaldab pöördtranskriptaasi ja kopeerib selle abil oma genoomi DNA-sse ning võib sel viisil integreeruda peremeesraku genoomi. 50. roheline revolutsioon arengumaade toetamiseks loodi lühikõrrelised teraviljad ning käiustati sealset agrotehnikat 51. somaatiliste rakkude hübriidimine - rakutehnoloogiline protseduur, milles
2. Viirustega – viirusvektori abil 3. Kullapüstoliga – Au kuulikesele on kinnitatud DNA, see “tulistatakse” rakku 4. Taimedesse Agrobakteriga – taimi kergesti nakatav bakter 5. Homoloogiline rekombinatsioon – Dna molekuli homoloogiliste piirkondade vaheline ristsiire, kus rekominantne DNA asendab olemasoleva Erinevate DNA-de liitmisel same rekombinantse DNA. Kuidas DNA-d lõigata? Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks. Restriktaase on erinevaid, igaühel oma “äratundmiskoht” DNA-l. Restritaasid lõikavad DNA sagely nii, et tekivad üheahelalised otsad - “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA lõike on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? - üle viidavale geenile on markergeen külge pandud (GFP-geen). Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meis on intronid ja eksonid, kuid bakteris neid ei ole
Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema? Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja
(1970) restiktaasid bakterites leiduvad ensüümid mis tagavad neile nn ,,immuunsuse" viiruste vastu lõigates nende DNA juppideks. · Bakterid omavad võõra DNA vastu nn R/M süsteemi · toimub kahe ensüümi koostöö : restriktaas(R) mis lõikab DNA tükkideks ja metüültransferaan(M) mis metüleerib ära oma DNA ja kaitseb seega oma DNA-d lõhkumise eest. · Restriktaasid tunnevad ära teatud järjestusega nukleotiidi paarid (4-8)DNA-s · teada erinevaid restriktaase üle 3500 · vastavalt restriktaasi toimele lõigatakse DNA lahti kas lõikuvalt või tömbilt. Kahe DNA kleepuvate otste liitumine toimub komplementaarsus printsiipide alusel ja ahelate aheald liituvad omakorda ligaasi abil. Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid( nukleotiidsed järjestused mis ei määravalgu ehitust) ja eksonid. (sisaldavad aminohapete järjekorra informatsiooni)
On omane retroviirustele. 50. Rekombinantne DNA DNA molekul, mis koosneb tehnogeneetiliste meetoditega ühendatud eri liikidelt pärit geenidest ning muudest järjestuslõikudest. 51. Restriktaas (restriktsiooniensüüm) bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. 52. Retroviirus RNA-viirus, mis sisaldab põõrdtranskriptaasi ja kopeerib selle abil oma genoomi DNA-sse ning võib sel viisil integreeruda peremeesraku genoomi. 53. Transgeenne organism (siirdgeenne, geneetiliselt muundatud, GM) organism või rakk, mille genoomis sisaldub, avaldub ja pärandub järglastele teiselt liigilt pärit geen; loodud geenitehnoloogilise protseduuriga. 54
uue raku nakatamisel) Rakkude lüüsimise tulemusena vabaneb iga nakatatud raku kohta 200-350 uut PFU-d. Endonukleaasid ja DNA metüültransferaasid Chlorella viiruse DNA sisaldab 5mC ja 6mA jääke positsioonides, mis erinevad peremehe DNA metüleerimissaitidest. See metüleerimine toimub viiruse poolt kodeeritud 5mC ja 6mA- metüültransferaaside poolt. Lisaks modifikatsiooni-ensüümidele (mõnel viirusel kuni 18 erinevat) kodeerib PBCV-1 veel ka DNA-sait-spetsiifilisi endonukleaase (restriktaase). Seega on vetikate viirused esimeseks mitte-prokarüootseks restriktaase kodeerivaks süsteemiks. Chlorella viiruste poolt kodeeritud restriktaaside lõikamissaidid: - Võivad sarnaneda bakteriaalsete restriktaaside saitidele (nt. R.CviAI lõikab GATC järjestust). - Olla unikaalsed (nende puhul pole bakteriaalseid analooge teada). - Asuda ainult ühes ahelas – vetikate viirustele on omased ka järjestus- spetsiifilised nikeerimisensüümid (nt
ligaasi abil. Ligaas katalüüsib kovalentse sideme moodustumist 5'-fosfaat- ja 3'- hüdroksüülrühma vahel. Enamasti kasutatakse T4 DNA ligaasi. Optimaalsete tingimuste korral on inserdi kloonimisse efektiivsus keskmiselt 1:50 st. ühel juhul siseneb insert vektorisse ja 49-l juhul toimub lihtne vektori retsirkulariseerumine. Vektori retsirkularisatsiooni vältimiseks / vähendamiseks ja kloonimise efektiivsuse tõstmiseks on mitmeid võimalusi. 1. Kasutada vektori lineariseerimiseks restriktaase, mis annavad erinevaid üheahelalisi otsi. Taoliselt on võimalik defineerida ka inserdi sisestamise suunda. 2. Vektorit töödeldakse aluselise fosfataasiga, Näit. CIP (calf intestin phosphatase). Selle tulemusel eemaldatakse vektori 5'fosfaat rühmad ja vektor ei religeeru iseendaga kokku. 3. Tömpide otstega DNA lõikude paremaks sisestamiseks kasutatakse ka linkereid või adaptereid. Linkerid ja adapterid on kaheahelalised sünteetilised oligod, mis sisaldavad
, 2005). Bakterite massilisel hävitamisel in vivo on oht, et bakteris olevad toksiinid pääsevad rakust välja, hakkavad kuhjuma organismi ning põhjustavad seal põletikke. Selle vältimiseks on üritatud geneetiliselt muuta faage nii, et nad ei hakkaks kiirelt replitseeruma infektsioonisaiti jõudes ning ei lüüsiks liiga kiirelt rakke. Selleks on faagi genoomidest välja lõigatud eksportvalke kodeerivaid geene või sisestatud restriktaase ja holineid ekspresseerivaid geene (Nobrega et al., 2015). Holinid on väikesed membraanivalgud, mis akumuleeruvad rakumembraanis. Nende geenidesse on programmeeritud täpne aeg, millal nad muudavad rakumembraani läbitavaks endolüsiinidele. Endolüsiinide toimel toimub mureiini lagundamine ning selle tagajärjel rakk lüüsub. Seega holinite abil on võimalik infektsiooni aega pikendada ning vältida bakterirakkude massilist lüüsumist (Wang et al., 2000).
4)loomariik 41. Algloomade raku ehitus. Vibur! Võivad sisaldada ka kloroplaste. 42. Seeneraku ehitus. Samad organellid, mis loomsesrakus, taimedele omased plastiidid puuduvad, sh vakuoolid. Üherakulised seened on ümarad, kuid hulkraksed, hüüfemoodustavad seened on niitjad, otste kaudu liiguvad organellid ja rakutuumad. 43. Restriktaasid. Paljud bakterid produtseerivad ensüüme, restriktsioonilisi endonukleaase e. klass II restriktaase, mis tunnevad kindlaid 4 8 aluspaari pikkusi DNA järjestusi ning lõikavad DNA d ainult nendest spetsiifilistest kohtadest. Nii kaitsevad restriktaasid baktereid näit faagide sissetungi eest, lagundades nende DNA enne, kui faag jõuab mikroobi kahjustada. Omaenese restriktaaside suhtes on bakterid resistentsed, sest bakteri enda genoomis on need järjestused kaitstud adeniini ja tsütosiini jääkide metüleerimisega.
HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa c) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa d) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 5' üleulatuva otsa e) Tüüp 2 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa 14. Kuidas nimetatakse restriktsioonilisi endonukleaase (restriktaase), mis tunnevad ära ühe ja sama DNA järjestuse ning lõikavad seda sarnaselt, aga pärinevad erinevatest bakteriliikidest? a) Neoskisomeerid b) Isoskisomeerid c) Isokaudomeerid 15. Leidke iga järgneva eksperimendi jaoks allpool toodud meetoditest sobiv a) Mutatsiooni analüüsimiseks uuritavas DNA-s - kasutatakse alleelspetsiifilist PCR-i b) Teatud geeni ekspressioonitaseme hindamiseks - eraldatakse mRNA ja tehakse Northern blot
amplifitseeritakse PCR abil, lisades praimeri (forward ja reverse), Mg (katalüsaator), dNTP-d, Taq polümeraasi (teostab sünteesi kõrgel temperatuuril). PCR käigus toimub ahelate denatureerimine, praimeritega seondumine ja süntees. Seda tsüklit korratakse 30 korda. Seda etappi kontrollitakse kasutades elektroforeesi. Järgmisena toimub selle järjestuse ja vajaliku vektori töötlemine. Sõltuvalt sellest, mis otsad tahetakse saada (,,blunt" või ,,sticky") kasutatakse vastavalt vajalikud restriktaase. Lõigatakse sama restriktaasidega nii vektorit kui ka järjestust. Puhastatakse saadu produktid. Siis ligeeritakse vektorisse saadud järjestust (takistades ise-ligeerimist, kasutades nt. defosforüülimist). Siis teostatakse vektori transformeerimine bakterirakku, kus huvipakkuva järjestuse ekspresseeritakse. Seejärel bakteriraku lõhutatakse, jäädes vektori huvipakkuva järjestusega, mille saadakse sekveneerimisele. Iga etapi kontrollitakse elektroforeesi abil, samuti
sama või muu liigi isendite geneetlisse struktuuri - kromosooni, plasmiidi või viirusesse. Osa geenitehnoloogilisi meetodeid piirdub DNA uurimisega. Geenitehnoloogia lähtekohad *Rekombinantse DNA metoodika loomine -See on DNA molekul, milles on ühendatud eri liikidest pärit DNA-lõigud -See on võimalik tänu ensüümidele (restriktraasid) mis lõikavad DNA-molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. -Teised ensüümid (ligaasid) ühendavad ahelate otsad Enamik restriktaase lõikab DNA eri ahelaid vastava järjestuse (4-8 nukleotiidipaari) eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda eri päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (nn. ,,kleepuvad") otsad. GMO - geneetiliselt muundatud organismid 1.Organismid, kelle genoomi on siirdatud mõne võõrliigi geene, mis neis organismides avalduvad ja päranduvad ka järglastele. Neil organismidel ilmneb üks või mõni uus, mingile liigile omane tunnus. 2
Osa geenitehnoloogilisi meetodeid piirdub DNA uurimisega. Geenitehnoloogia tekke lähtekohaks oli rekombinantse DNA metoodika loomine (Joonis 1). Rekombinantseks DNA-ks nimetatakse DNA molekuli, milles on ühendatud eri liikidelt pärist DNA-fragmendid. Selle metoodika eelduseks oli omakorda restriktsiooniensüümide ehk restriktaaside avastamine bakterites 1970. aastal. Need on omapärased ensüümid, mis lõikavad DNA molekuli kaksikahelat kindlate järjestuste kohalt. Enamik restriktaase lõikab DNA mõlemat ahelat vastava järjestuse (4-8 nukleotiidipaari) eri otstest. Kui sama restriktaasiga töödelda erinevat päritolu DNA-d, siis on tekkinud fragmentidel komplementaarsed üheahelalised (nn. kleepuvad) otsad. Kui need fragmendid kokku viia, siis otste paardumisel nad ühinevad. Ensüüm ligaasi toimel ühinevad ahelate otsad ka kovalentsete sidemetega ja rekombinantsed molekulid ongi moodustunud. Geenitehnoloogiad võimaldavad otseselt muuta indiviidide pärilikke omadusi.
Lisame 2 µl 6X DNA värvi ja pipeteerime kogu segu agaroosgeeli hambasse. Voolutame 150V juures 10-15 minutit. Teeme geelist pildi. 13 Minu rada: 5 Milleks teostatakse kontroll-restriktsioon? Et kontrollida, kas eraldatud plasmiid on õige Millise tulemuse sain kontroll-restriktsioonist? Minu tulemus on väga ilus, eraldatud plasmiid tuli õige. Mille järgi valisime sobiva restriktaasi? Veel sobivaid restriktaase. Valisime EcoRI restriktaasi, kuna meie insert sisenes pSTBlue-1 vektorisse EcoRV saiti. Mõlemalt pool enne seda saiti on EcoRI sait. Seega oli väga hea valita just see restriktaas, saime mõlemalt poolt ühe restriktaasiga lõigatud ja vee täpselt väga lähedalt. Võiksime valida ka muud restriktaasid, nt PstI ja HindIII aga see oleks tülikas, kuna me ei eraldaks ainult meile huvipakkuvat fragmenti ja peaksime puhvritega jändama, kuna iga restriktaasi jaoks on erinevat
On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) vôi siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad".
geeni mingisse plasmiidi vaid alustame sellest, et puhastame rakkudest vastava geeni pealt sünteesitud ja juba ära splicetud mRNA. Nüüd katseklaasis kasutades pöördtranskriptaasi sünteesime sellele mRNA'le ühe kaheahelalise DNA koopia. Seda koopiat kutsutakse sidiDNA'ks (?). Ja kõik jätkub endisel viisil. 05/11/09 Erinevad bakterid sünteesivad erinevaid restriktaase, erinevatel restriktaasidel on järjestusspetsiifika. Kui tahame kindlat lõiku DNA'st, siis valime sellise restriktaasi, mis lõikab katki sobivaid järjestusi. Kuidas me teame DNA nukleotiidset järjestust? Sequencing sekveneerimine. DNA nukleotiidse järjestuse väljaselgitamise meetodi mõtles välja F.Sanger. metoodika baseerub sellel, et Sanger võttis kasutusele nn modifitseeritud nukleotiidid. /ribonukleotiidis on nii 3'
iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli 4-8 pikkusega. Restriktaasid lõikavad DNA ahele läbi kindlas piirkonnas, see sõltub DNA nukleeinhappelisest järjestusest. Kusjuures igal ensüümil on oma „äratundmiskoht“. Restriktaaside abiga võime saada erinevaid DNA lõike – siduvate ja tömpide otsadega. Siduvate otstega fragmendid on ühekordsete ahelatega ning neid saab taas omavahel liita. Restriktaase toodavad bakterid enesekaitseks, purustades erinevaid DNA ahelaid, jättes sellele „kleepuvad otsad“. Need jupid liidetakse uuesti komplementaarsuseprintsiibi kohaselt. Erinevate DNA lõikude liitmisel saame rekombinantse DNA. 39. Plasmiidid Plasmiidid – bakteris asuvad DNA väikesed rõngasmolekulid, millel on põhiliselt ainevahetuslik tähtsus. Plasmiidid sisaldavad geene, mis on vajalikud bakteri kasvukeskkonna eripärast tulenevate ensüümide sünteesiks
Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s. 58. Nüüd DNA on puhas kontrolliks. 59. 60. 61.Kontroll-restriktsioon 62. Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1. Kontroll-restriktsiooni teostamiseks esmalt pipeteerisin kokku 5,5 μl vett, 3 μl puhastatud DNA-d, 1 μl restriktaasi 10x puhvrit, 0,5 μl EcoRI restriktaasi, fuugisin ja inkubeerisin 37 °C 30 min jooksul 2
Naaberrakkude tsütoplasmad ühenduvad tsütoplasmaväätide ehk plasmodesmide kaudu. Taimerakus on vakuoolid, plastiidid(proplastid, kloroplastid, kromoplastid, leukoplastid), ribosoomid, karedapinnaline ja siledapinnaline tsütoplasma võrgustik, tuum, mitokonder, Golgi kompleks, tsütoplasma, lüsosoomid. 43. Restriktaasid. Ehk endonukleaasid lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes suhkur-fosfaat selgroos nukleotiidide vahelist sidet ehk fosfodiestersidet ahelasiseselt, mitte otstest. Restriktaase toodavad bakterid. Restriktaasid on järjestusspetsiifilised. 44. DNA kloneerimise etapid. 1. Lõigatakse nii vektorit B-saidis(vektoriteks kasutatakse tihti plasmiide) kui ka uuritavat DNA- d retriktaasiga, mis genereerib "kleepuvad" otsad. (kui nii kloneerimisvektori DNA-d kui ka kloneeritavat DNA-d on lõigatud ühe ja sama restriktaasiga, saame klonerimisvektoi otste vahele "kleepida" uuritava DNA lõigu. Fosfodiestersidemete moodustamiseks
tugevad vesiniksidemete moodustajad. Nukleiinhapete hüdrolüüs RNA vastupidav lahjades hapetes, hüdrolüüsitakse lahja leelise poolt DNA vastupidav lahjades leelistes, lahjades hapetes depurineeritakse Polünukleotiidahelaid lõigatakse nukleaaside abil. Eksnukleaasid hüdrolüüsivad fosfodiestersidemeid terminaalsete jääkide juurest, endonukleaasid sisemiste fosfodiestersidemete juurest. Bakterid kasutavad enda kaitsmiseks võõra DNA eest restriktaase, lõikavad DNA ahelaid kindlate järjestuste kohalt. RNA · rRNA ribosoomne RNA, ribosoomi struktuuri ja funktsiooni alus, moodustavad umbes 2/3 ribosoomi ehitusest. Toimib toena ribosoomi valkudele. · tRNA transporti RNA, kannab aminohappeid valgusünteesis, ristikulehekujuline sekundaarstruktuur. tRNA's leidub palju ebaharilikke ribonukleosiide. Iga erineva aminohappe jaoks on vähemalt üks ainult talle vastav tRNA
Rakukest on mitmekihiline. Peptidoglükaanis on tetrapeptiidid seotud otse. Välismembraanis on ka poriinid.Välismembraan takistab mitmete hüdrofiilsete AB (penitsilliin) rakku tungimist ja seetõttu on g(-)bakterid penitsilliinile vähem tundlikud. Välismembraani ja rakumembraani vahelist ruumi g(-) bakteritel nimetatakse periplasmaks. Periplasma sisaldab mitmesuguseid valke, mis osalevad ainete transpordis (transporterid). Periplasmas on ka detoksifikatsiooniensüüme (penitsillinaas), restriktaase ja hüdrolaase (glükosidaasid, proteaasid, lipaasid), mis lagundavad neid molekule, mis hüdrolüüsimata kujul rakumembraani ei läbi. Poorid välismembraanis neid läbi ei lase, sest poori diameeter on selleks liiga väike. Lipopolüsahhariidide (LPS) erinevused annavad bakteritele erinevad seroloogilised omadused. LPS lipiidosa on toksiline inimesele ja loomadele, põhjustades palavikku, lööbeid ja sokki. Seetõttu nimetatakse LPS kaendotoksiinideks
On olemas järjestusspetsiifilised restriktaasid ja restriktaasid, mis lõikavad DNA ahelat suvalistest kohtadest. Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad".
On järjestusspetsiifilised ristriktaasid ja need restriktaasid, mis lõigavd DNA ahelat suvalistes kohtades. Restriktaasidel on omadus lôigata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lôikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis-järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) vôi siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.
Läbi nende pooride difundeeruvad väikesed hüdrofiilsed molekulid, mis läbi lipiidse kihi välismembraanis ei pääse. Välismembraan takistab mitmete hüdrofiilsete AB (penitsilliin) rakku tungimist ja seetõttu on g(-) bakterid penitsilliinile vähem tundlikud. Välismembraani ja rakumembraani vahelist ruumi nim periplasmaks. Periplasma sisaldab mitmesuguseid valke, mis osalevad ainete transpordis (transporterid). Periplasmas on ka detoksifikatsiooniensüüme (penitsillinaas), DNA restriktaase, hüdrolaase (glükosidaasid, proteaasid, lipaasid), mis lagundavad neid molekule, mis hüdrolüüsimata kujul rakumembraani ei läbi. Välismembraan on vajalik ka selleks, et periplasmas paiknevad valgud sealt välja ei difundeeruks. Poorid välismembraanis neid läbi ei lase, sest poori diameeter on selleks liiga väike. Mis eristab mükoplasmasid teistest prokarüootidest? Neil puudub rakukest. Kuidas toimib bakterirakule penitsilliin? Kuidas lüsotsüüm? Mis on nende märklauaks?
On olemas järjestusspetsiifilised restriktaasid ja restriktaasid, mis lõikavad DNA ahelat suvalistest kohtadest. Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad".
nii, et tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli palindroomsed, pikkusega 4-8 nt (AIAS SADAS SAIA) Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks – need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.
nii, et tekivad iseloomulikud otsad. Äratundmiskohad on sageli palindroomsed, pikkusega 4-8 nt (AIAS SADAS SAIA) Restriktaasidel on omadus lõikata DNA topeltahel läbi kindlas piirkonnas (lõikepiirkond- ingl. k. cleavage site), mille määrab ära antud piirkonna DNA nukleiinhappeline-järjestus (äratundmis- järjestused; ingl. k. recognition sequences- koosnevad 4-8 nukleotiidipaarist), kusjuures iga ensüümi jaoks on see erinev. Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela juppe. Siduvate otsadega fragmente võib omavahel taas liita. Seega vôib teoreetiliselt mistahes geene omavahel liita. Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad".
polümeraasi) seostumist promootorpiirkonnaga. Reproduktiivne kloonimine - inimese kloonimisvõimaluste käsitlemisel kasutatav mõiste, mis tähendab tuumkloonimist uute isendite saamise eesmärgil; vastandatakse terapeutilisele kloonimisele. Restriktaas (restriktsiooniensüüm) - bakteritel esinev endonukleaaside hulka kuuluv ensüüm, mis katkestab DNA kaksikahela kindla nukleotiidijärjestuse kohalt, tekitades üheahelalised ,,kleepuvad" otsad; bakteritest on leitud palju restriktaase, millest igaüks tunneb ära oma spetsiifilise DNA-järjestuse. Retroviirus - RNA-viirus, mis sisaldab pöördtranskriptaasi ja kopeerib selle abil oma genoomi DNA-sse ning võib sel viisil integreeruda peremeesraku genoomi. Retseptorvalk - rakumembraani koostises esinev valgu molekul, mis edastab väliskeskkonna infot raku sisemusse. Retsessiivne alleel - alleel, mille poolt määratud tunnus avaldub üksnes vastava alleeli homosügootses olekus.
Tegemist on bakteriaalset päritolu ensüümidega, mis on bakterites oluliseks viirusvastaseks kaitsemehhanismiks. Restriktaasid tunnevad ära kindlaid DNA järjestusi ja järjestusega seondumise järel lõikavad DNA ahela katki. Näiteks tunneb tuntumaid sedalaadi ensüüme EcorI DNA ahelas spetsiifiliselt ära järjestuse GAATTC, seondub ning lõikab DNA G ja A nukleotiidide vahelt katki. Kuna DNA koosneb kõigis organismides samadest nukleotiididest, on restriktaase võimalik kasutada ka imetajate genoomi analüüsimiseks. Restriktaasiga töödeldud DNA ahelast tekkinud erineva pikkusega fragmendid lahutatakse teineteisest geelelektroforeesi (vt allpool) abil. Sel moel on võimalik teha indiviiditi kindlaks, kas vaadeldud piirkonnas esineb indiviidide vahel erinevusi. Mõnel juhul on neil väikestel erinevustel väga suur mõju konkreetse indiviidi fenotüübile. Näiteks on võimalik tuvastada inimese vastuvõtlikkust
Võrdluseks - nt DNA-aasid lõhustavad DNAd juhuslikult. Praegu tuntakse üle 100 restriktsiooni ensüümi ning praktiliselt on vôimalik mistahes geen vôi mistahes DNA fragment genoomist välja lõigata. Alljärgnevalt on toodud näitena viie enamkasutatava restriktaasi äratundmis-järjestused ja lõikepiirkonnad. 49 Joonis. Restriktsiooniensüümid Kasutades erinevaid restriktaase, võime saada DNA fragmente, millel on kas tömbid (Hpa I) või siduvad otsad (ingl. k. cohesive ends). Viimased kujutavad endast lühikesi ühekordse ahela fragmente. Siduvate otsadega fragmente vôib omavahel taas liita, s.t teoreetiliselt võib mistahes geene omavahel liita. Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant-DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule
annaabi.ee 
