tulemusena molekulid ei mahu geeligranulite pooridesse ja liikuvad kiiresti nende vahel. Kromatogrammi järgi elueerimismaht on Vx min = 24 ml 2. Teisena väljus Lysozyme, mis absorbeerib lainepikkusel 280 nm Vx = 48 ml 3. DNP - Aspartaat - absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollase värvusega aine väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekulaarmass ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist. Vxmax = 72 ml Liikuvusteguri Rf väärtus: V x -V min x 48-24 Rf = max min = =0,5 V x -V x 72-24 Järeldus Liikuvusteguri Rf väärtuseks sain 0,5 , mis vastab vahemikule 0 < Rf < 1 Arvutuslikult sain maksimaalseks elueerimismahuks Vxmax = 67,82 ml. Katse tegemisel selgus, et tegelik maksimaalne elueerimismaht oli Vxmax = 72 ml. 72-67,82 Katse viga tuleb: 100 =6,16
tekkida. Ühe võimalusena pakuksin välja, et esialgne voolukiirus oli ettenähtust mõnevõrra kiirem, kuid reguleerisin selle mõne minuti jooksul uuesti täpseks. Pole kindel, kas see võis katse tulemust mõjutada. Küll aga võis seda tulemust mõjutada väike erinevus fraktsioonide mahtudes. Paratamatult oli mõne fraktsiooni maht silma järgi mõõtes pisut suurem või väiksem kui 2 ml. Pigem oli mõni suurem ja rohkem väiksemaid. Liikuvusteguri Rf arvutamine Vx - Vxmin Rf = max Valem: Vx - Vxmin Arvutamisel kasutan Vxmax arvutuslikku väärtust 75,58 ml. 39 - 29 10 Rf = = = 0, 21 75,58 - 29 46,58 Müoglobiini liikuvustegur on 0,21. Järeldused Liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiinile on 0,21, mis jääb nõutud vahemikku 0...1. Loen arvutuse ja katse õnnestunuks. Samuti jään rahule koostatud kromatogrammiga. Graafikute erinevad kõrgused on tingitud vaid
Katse aeg: 19. 03 2007 10.30 12.00 Ruumi keskmine temperatuur: 22 oC Allaniin: lx1 = 0,9 cm W1: = 0,3 cm Arginiin: lx2 = 0,3 cm W2 = 0,3 cm Seriin: lx3 = 0,6 cm W3 = 0,4 cm Fenüülalaniin: lx4 = 1,95 cm W4 = 0,3 cm Uuritav lahus B: lx5 = 0,65 cm W5 = 0,3 cm lx6 = 1,95 cm W6 = 0,3 cm lx7 = 0,65 cm W7 = 0,3 cm lx8 = 1,90 cm W8 = 0,25 cm Lahustifrondi kaugus stardijoonest: lf = 4,2 cm Liikuvusteguri (Rf) välja arvutamine valemi järgi Rf = lx / lf. Rf1 = 0,9 / 4,2 = 0,21 Rf2 = 0,3 / 4,2 = 0,07 Rf3 = 0,6 / 4,2 = 0,14 Rf4 = 1,95 / 4,2 = 0,46 Rf5 = 0,65 / 4,2 = 0,15 Rf6 = 1,95 / 4,2 = 0,64 Rf7 = 0,65 / 4,2 = 0,15 Rf8 = 1,90 / 4,2 = 0,45 Kuna aine Rf väärtust mõjutavad nii palju tegurid, siis on ta vaid ligikaudne identsuse näitaja. Lahutamise efektiivsust väljendatakse teoreetiliste taldrikute arvuga N ja arvutatakse järgmmise valemiga: N = 16 * (lx / W)2. N1 = 16 * (0,9 / 0,3)2 = 144
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 20 40 60 80 100 120 Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian müoglobiinile liikuvusteguri Rf . Täpsuse mõttes võtan andmed tabelist. V x - v xmin R f = max V x - V xmin 50 - 40 Rf = 96 - 40 =0,178 JÄRELDUS. Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena
38 106 0,116 39 108 0,066 40 110 0,040 Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian müoglobiinile liikuvusteguri Rf . Täpsuse mõttes võtan andmed tabelist. V x - v xmin Rf = V xmax - V xmin 52 - 42 Rf = 96 - 42 =0,185 JÄRELDUS. Töö õnnestus enam vähem hästi, ainete piir oli üpriski eristatav. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad läbi kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest
31 83,5 0,542 32 85,5 0,275 33 87,5 0,147 Kromatogramm Vxmin Vx Vxmax Vxmin on eluaadi maht, kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Vx on eluaadi maht kuni valgu kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni ja Vxmax on eluaadi kogumaht kuni DNA-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni. Leian liikuvusteguri Rf . V x - v xmin R f = max V x - V xmin 45,5 - 27,5 Rf = = 0,36 77,5 - 27,5 Järeldus: Töö õnnestus enam vähem normaalselt. Käesolevas lahuses olevad komponendid eraldusid antud järjekorras kuna nende ainete molekulmassid liiguvad kolonni erineva kiirusega. See on tingitud ainete molekulide erinevast jaotumisest geeli pooridesse ja molekulide suurusest. Esimesena väljus
Helelilla 38 - - Kattuvate värvitoonide liikuvustegurid Tumelilla 36 35 36 Tumelilla 0,52 0,52 0,53 lf= 68mm lf= 68mm lf= 68mm Järeldused: Katsest selgub, et värvained koosnevad mitmetest Liikuvusteguri (Rf) arvutamine. erinevatest komponentidest. Kõige paremini on esile kerkinud kõigi ühine komponent- tumelilla. Kõige vähem komponente eraldus Black B-l ning olenemata Black GSP kogusest (üks või kaks tilka) eraldus
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx max = 46,5 ml Võrdlen viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu arvutusliku Vx max väärtusega. Kui töö on korrektselt läbi viidud, peaksid need kokku langema. Vx max = 46,5 ml Vx max arvutuslik= 46,1 ml (46,143 ml) Arvud on päris sarnased, seega võin lugeda töö õnnestunuks. Arvutan liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valgu jaoks, kasutades arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vx max väärtust. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Rf= (23,5 17,5) / (46,1 17,5) = 0,21
Väljub teisena, kuna tol on väiksem molekulmass kui dekstraanil.V2=34ml 3) DNA DNP-Aspartaat. Absorbeerib lainepikkusel 360 nm. Kollane värvus. Väljub viimasena, kuna temal on kõige väiksem molekullmass, ja molekulid hästi mahuvad pooridesse, mis pidurdavad nende liikumist.V3max=74 ml.... Kui kõik on õigesti tehtud siis V3max ja arvutatud Vxmax peavad kokku langem. Arvutatud Vxmax on 74,9 ml.....siis kõik on õige. ·Arvutame liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiini jaoks: Kasutame antud valemi Rf= Vx Vxmin / Vxmax -Vxmin Rf = 34-24/74-24= 0,2 Kokkuvõte: Antud eksperiment demonstreerib ainete segu lahutamise meetodi. Geelkromatograafia meetodi põhimõtteks on ainete segu lahutamine molekulmassi järgi. Meie juhul kõige suuremad molekulid oli dekstraansinisel, mis tõestatakse sellega, et dekstraansinine väljub kolonnist esimesena. Müoglobiini mass oli väiksem ja DNP-aspartaati kõige
väljumiseni Vxmin= 28,5 ml 2)Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx= 48,5 ml 3)Eluaadi kogumaht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax= 82,5 ml Mõõdetud ja arvutusliku Vxmax erinemine: Mõõdetud Vxmax = 82,5 ml; arvutuslik Vx(max)= 82,16665 ml Töö õnnestus hästi, sest mõõdetud ja arvutatud Vxmax erinesid väga vähe. Müoglobiini liikuvusteguri väärtus (segus sisaldunud valk): Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin = 48,5 28,5 / 82,5 28,5 = 20 / 54 0,3704
kus kõige suurema molekulmassiga aine väljus esimesena ning kõige väiksema molekulmassiga väljus viimasena. Dekstraansinine 200 kDa, müoglobiin 16 800 Da ja DNP- aspartaat 299,5 Da. Antud geeli lahutuspiirkond on 3000-80000 Da. Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx=32 ml Katseliselt sain Vxmax 58 ml, mis sobib arvutuslikult saadud 59,7 ml-ga. Liikuvusteguri Rf väärtus müoglobiini jaoks: Rf= =0,22
Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima konstentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmin = Vv = 31ml Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 39 ml Eluaadi maht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni – Vxmax = 75 ml Viimasena väljunud DNP-aspartaadi elueerimismaht on võrdne arvutusliku Vxmax väärtusega. Arvutan liikuvusteguri: Rf = 39-31/75-31 = 0,18 Töö tulemusega võib rahule jääda kuna arvutuslik jakatse tulemusena saadud viimasena väljunud DNP-aspartaadi elueerimismahud on võrdsed.
Eluaadi maht kuni kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni: Vxmax = 65,5 ml. D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahu võrdlemine arvutusliku Vxmax-ga Viimasena väljunud komponendi elueerimismaht on V = 65,5 ml, arvutuslikult tuli Vxmax = 60,24. Erinevus on ~5 ml, mis võis tingitud olla näiteks geeli või täidise mahtude arvutamisel tekkinud ebatäpsustest, kuna joonlauaga ei pruukinud geeli samba kõrguse ja diameetri mõõtmistulemused olla väga täpsed. E. Liikuvusteguri Rf väärtuse leidmine segus sisaldunud valgu jaoks Rf = (Vx Vxmin)/(Vxmax Vxmin) = (33,5 25,5)/(60,24 25,5) = 8/34,74 = 0,23
oluliselt väiksemad müoglobiini omadest. eluaadi kogumaht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx1= Vxmin= 33 +22= 37 ml eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx2= 33 + 2 8= 49 ml eluaadi kogumaht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx3= Vxmax= 33 + 2 29= 91 ml Arvutatud Vxmax= 91,8 cm3 Mõõdetud Vxmax= 91 cm3 Müoglobiini liikuvusteguri Rf väärtus, kasutades arvutuslikku Vxmax väärtust Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (49-37)/(91,8-37)0,22 Järeldused Katse põhjal võis kindlaks teha, et suurim molekulmass on dekstraansinisel, talle järgneb väikese vahega müoglobiin ning väikseimat molekulaarmassi omab DNP-aspartaat. Kromatogrammil on ainete kontsentratsioonide üleminekud kindlalt piiritletud ning sujuvad.
väljumiseni Vxmin= 30 ml 2)Eluaadi kogumaht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx= 48 ml 3)Eluaadi kogumaht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax= 102 ml Mõõdetud ja arvutusliku Vxmax erinemine: Mõõdetud Vxmax = 102 ml; arvutuslik Vx(max)= 103,01 ml Töö õnnestus üpriski hästi, sest mõõdetud ja arvutatud Vxmax erinesid suhteliselt vähe. Müoglobiini liikuvusteguri väärtus (segus sisaldunud valk): Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin = 48 30 / 102 30 = 18 / 72 = 0,25
D. Viimasena väljunud komponendi elueerumismahtu võrdlus arvutusliku V xmax väärtusega. Arvutuslik Vxmax = 67,86 ml Katset läbiviides sain viimasena väljunud komponendi elueerumismahuks 66,75 ml. Minu saadud tulemus erineb arvutuslikust 1,11 ml võrra. Suhteline viga seejuures on umbes 1,64%, mis tähendab, et tulemused on üsnagi kokkulangevad. Viga võis tekkida kolonni mahu mõõtmisel. E. Rf = (Vx Vxmin) / (Vxmax Vxmin) Segu sisaldas aromaatse tuumaga valku, seega leian tema liikuvusteguri väärtuse: Rf = (28,75 - 24,75) / (66,75 - 24,75) = 0,095
Liikuvustegur : Järeldused: Antud laboratoorse töö käigus lahutasin kolmekomponentse uuritava lahuse geelkromatograafia meetodit kasutades. Uuritav segu koosnes dekstraansinisest, müoglobiinist ja DNP-aspartaadist. Kõige väiksema molekulmassiga neist oli dekstraansinine, mis väljus kolonnist esimesena, ja kõige suurema molekulmassiga neist oli DNP-aspartaat, mis väljus kolonnist viimasena. Liikuvusteguri väärtus tuli arvutuslikult 0,185, mis jääb ilusti ettemääratus vahemikku .
väärtusega. Vxmax (tegelik) = 54 ml Vxmax (tegelik) = 78 ml Vxmax (arvutuslik) = 111,96 ml 112 ml Vxmax (arvutuslik) = 77,76 ml 78 ml Arvutuslik Vxmax-i on oluliselt suurem tegelikust Vxmax ist. Selline viga tekkis ilmselt seetõttu, et ma ei kandnud proovi geelile ühtlaselt. Viga võis tekkida ka kolonni diameetri ja kõrguse mõõtmisel, mis viis arvutusliku Vxmax-i veani. Arvestades kolonni diameetri mõõtmise viga, tulevad arvutuslik ja tegelik Vxmax võrdsed. E. Liikuvusteguri Rf väärtus. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin = (18 6)/(111,96 6) = 0,1133 Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin = (40 28)/(77,76 28) = 0,2412 KOKKUVÕTE Eraldasin geelkromatograafiliselt kolme erineva molekulmassiga ained segust. Katse oleks võinud õnnestuda paremini. Viga tekkis kohe katse alguses, kui viisin uuritavat lahust geelile, ei saanud ma seda ühtlaselt jaotatud. Ka kulus katses palju vähem katseklaase, kui ma välja
Järeldus
Arvutuslikult sain maksimaalseks elueerimismahuks Vxmax =99,7 cm3. Katse tegemisel selgus,
et tegelik maksimaalne elueerimismaht oli hoopis Vxmax=86 mL.
Katse viga tuleb: . See on küllatki suur erinevus, mis võis tulla näiteks sellest, et mõõtsin
geelisamba kõrguse või kolonni diameetri ebatäpselt. Erinevus võib tulla sisse ka sellest, et
mõni 2 mL fraktsioon sai pisut suuremaks ja teine jälle jäi väiksemaks kui 2 mL.
Liikuvusteguri väärtus peab olema 0
Eluaadi maht DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni:Vx;max= 56+34=90ml. D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahtu võrreldakse arvutusliku Vx;max väärtusega. Arvutuslikult sain, et Vx;max=95.4ml. Katse tulemusel sain aga 90 ml. On näha, et need on natukene erinevad. Arvatavasti on põhjus ebatäpses fraktsioonide kogumises või viimaste fraktsioonide kogumatajätmises,kuna silmaga vaadates enam värvi ei paistnud. E.Leian liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valkude jaoks, kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust. Rf=(Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin)= (56ml-32ml)/(95.4ml-32ml)=24ml/63.4=0.38. Juhendis on antud müoglobiini liikuvusteguriks Rf=0.55, kuid selles näites oli kasutatud ka teist marki Sephandex geeli.
Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud)
väljumiseni Vx = 30 ml.
Eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi DNP-aspartaadi kõrgeima
kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmax = 56 ml.
D. Viimasena väljunud komponendi (DNP-aspartaat) elueerimismaht oli 56 ml. Arvutuslik
Vxmax = 57,6. Need arvud langevad suhteliselt kokku, järelikult on töö korrektset läbiviidud.
E. Segus sisaldunud valgu jaoks liikuvusteguri Rf väärtuse arvutamine, kasutades Rf
arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust.
Rf = Vx-Vxmin/Vxmax-Vxmin = 0,225 - Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0...1 (0
25 73cm3 0,059 26 75cm3 0 Viimase komponendi elueerimismaht on 65 cm3 ning arvutuslik Vxmax on võrdne 70,87 cm3-ga. Elueerimismaht on väiksem. Selle põhjuseks võib olla see, et mingid mõõtmeid oli tehtud valesti. Ning, kui kõik vajalikud mõõtmed on leitud, saab leida Rf, ehk liikuvusteguri väärtus segus sisaldunud valgu jaoks kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin = (33 25) /( 70,87 25 )= 0,17
ÜLDARV (n) Katse tulemuste põhjal saadud kromatogramm: 1. Eluaadi maht kuni dekstraansinise kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmin = 29,5 ml 2. Eluaadi maht kuni müoglobiini kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vx = 41,5 ml 3. Eluaadi maht kuni DNP-aspartaadi kõrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni väljumiseni Vxmax = 77,5 ml Arvutan liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valgu jaoks, kusjuures pean silmas, et valemis kasutan arvututatud Vxmax väärtust: Kokkuvõte Nagu katse tulemusel selgus, siis arvutuslik ja eksperimentaalne V xmax erinesid üksteisest tublisti. Kuigi arvutuslikuks Vxmax väärtuseks sain 91,7 ml, siis katse käigus selgus, et minul oli viimasena väljunud komponendi elueerimismaht 77,5 ml. Viga arvan peituvat ebatäpses lahuse kandmises geelile
26 75cm3 0 Viimase komponendi elueerimismaht on 65 cm3 ning arvutuslik Vxmax on võrdne 70,99 cm3-ga. Elueerimismaht on väiksem. Selle põhjuseks võib olla see, et voolukiirus oli liiga suur ning aine ei lahutanud nii hästi. Teiseks põhjuseks võib olla see, et mingid mõõtmeid tegin valesti. Ning, kui kõik vajalikud mõõtmed on leitud, saab leida Rf, ehk liikuvusteguri väärtus segus sisaldunud valgu jaoks kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust: Rf = Vx Vxmin / Vxmax Vxmin = (33 25) /( 70,99 25 )= 0,17
arvatud) väljumiseni Vx, ¾ milline on eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi krgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmax. D. Viimasena väljunud komponendi elueerumismahtu võrreldakse arvutusliku Vxmax väärtusega. Töö korrektse läbiviimise korral peaksid need kokku langema. Kui eksperimentaalne Vxmax on oluliselt suurem või väiksem arvutuslikust Vxmax-st, siis analüüsitakse võimalikke põhjusi. E. Arvutatakse liikuvusteguri Rf väärtus segus sisaldunud valgu jaoks, kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vxmax väärtust. Kontrollküsimused 1. Mis on kromatograafia, millel see põhineb ja milliseid kromatograafia liike teate? 2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet. 3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale? 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? 5
annaabi.ee 
