Ainete identifitseerimine õhukese kihi kromatograafia meetodil (1)

Laboratoorne töö IV
Ainete identifitseerimine õhukese kihi kromatograafia meetodil
Töö eesmärk:
Uurida aminohapete lahutamist tõusva vooluga vertikaalse õhukese kihi kromatograafia abil.
Töövahendid:
Kromatograafiline plaat, harilikpliiats, joonlaud , klaaskapillaarid, Petri tass, voolutinõu, uuritav lahus B, puhaste aminohapete lahused ( alaniin , arginiin , seriin ja fenüülalaniin), n-butanool-äädikhape-vee lahus, 0,2 % ninhüdriini lahus etanoolis .
Töö käik:
Kromatograafilisele plaadile tõmmatakse 10 mm kaugusele stardijoon. Sellele kantakse klaaskapillaari abil uuritav proov mõlemasse äärde ja sinna vahele 7 mm vahedega kantakse puhaste aminohapete lahused. Proov kantakse plaadile võimalikul väikese laiguna ja soovitavalt ühekorraga. Mida väiksem on sorbendiosakese läbimõõt, seda kiiremini saabub tasakaal statsionaarse ja mobiilse faasi vahel, seda väiksemaks kujuneb komponendi laik, seda kõrgemaks aine kontsentratsioon selles ja lihtsamaks aine avastamine. Pärast proovi pealekandmist tuleb lasta lahustil auruda.
Voolutamiseks valitakse sobiv vooluti vastavalt lahustatava segu komponentide polaarsusele. Aminohapete lahutamiseks kasutatakse voolutit, mis koosneb n-butanoolist, äädikhappest ja vees, vahekorras 3:1:1. Meetod põhineb aminohapete erineval lahustuvusel kahes teineteisega osaliselt segunevas vedelikus . Vesi kui polaarne lahust adsorbeerub sorbendile ja moodustab kromatograafilise süsteemi statsionaarse faasi. Mobiilseks faasiks on vooluti väiksema polaarsusega komponendid.
Kromatografeerimiseks avatakse voolutinõu kaas, asetatakse pintsettidega voolutusnõusse ja voolutusnõu suletakse. Vooluti hulk olgu selline, et nivoo jääks voolutusnõus 3 -4 mm stardijoonest madalamale. Vooluti liigub kapillaarjõudude toimel üles ja kannab stardijoonelt kaasa ka aminohapped , mille liikumiskiirus sõltub radikaalide polaarsusest. Polaarsete radikaalidega aminohapped interakteeruvad tugevamini statsionaarse faasiga, mille moodustab sorbendisse imbunud vesi.
Vooluti nivool lastakse tõusta 5 – 10 mm kaugusele plaadi ülemisest servast, milleks kulub umbes 0,5 – 1 tund. Plaat võetakse kromatografeerimisnõust välja, frondi asukoht tähistatakse pliiatsiga ja plaat kuivatatakse algul õhukäes ja hiljem lõplikult kuivatuskapis .
Kromatogrammi ilmutamiseks kasutatakse aminohapete segu lahutamisel ilmutina ninhüdriini lahust, millese plaat korralikult kastetakse. Aminohapetele iseloomulikud laigud ilmuvad plaadi kuivatamisel kuivatuskapis (60 – 70 oC juures). Laigud ümbritsetakse grafiitpliiatsiga tõmmatud ringidega. Ninhüdriin ja aminohape reageerivad omavahel leeliselises keskkonnas, andes produktidesk H2O, CO2, RCOH, aspargiini puhul oranzikaspruuni, proliini ja hüdroksüproliini puhul kollase ning ülejäänd teiste aminohapete puhul sinise või lilla värvusega ühendi.
Katseandmed ja nende töötlus:
Katse aeg: 19. 03 2007 10.30 – 12.00
Ruumi keskmine temperatuur: 22 oC
Allaniin: lx1 = 0,9 cm
W1: = 0,3 cm
Arginiin: lx2 = 0,3 cm
W2 = 0,3 cm
Seriin: lx3 = 0,6 cm
W3 = 0,4 cm
Fenüülalaniin: lx4 = 1,95 cm
W4 = 0,3 cm
Uuritav lahus B: lx5 = 0,65 cm
W5 = 0,3 cm
lx6 = 1,95 cm
W6 = 0,3 cm
lx7 = 0,65 cm
W7 = 0,3 cm
lx8 = 1,90 cm
W8 = 0,25 cm
Lahustifrondi kaugus stardijoonest: lf = 4,2 cm
Liikuvusteguri (Rf) välja arvutamine valemi järgi Rf = lx / lf.
Rf1 = 0,9 / 4,2 = 0,21
Rf2 = 0,3 / 4,2 = 0,07
Rf3 = 0,6 / 4,2 = 0,14
Rf4 = 1,95 / 4,2 = 0,46
Rf5 = 0,65 / 4,2 = 0,15
Rf6 = 1,95 / 4,2 = 0,64
Rf7 = 0,65 / 4,2 = 0,15
Rf8 = 1,90 / 4,2 = 0,45
Kuna aine Rf väärtust mõjutavad nii palju tegurid, siis on ta vaid ligikaudne identsuse näitaja.
Lahutamise efektiivsust väljendatakse teoreetiliste taldrikute arvuga N ja arvutatakse järgmmise valemiga: N = 16 * (lx / W)2.
N1 = 16 * (0,9 / 0,3)2 = 144
N2 = 16 * (0,3 / 0,3)2 = 16
N3 = 16 * (0,6 / 0,4)2 = 36
N4 = 16 * (1,95 / 0,3)2 = 676
N5 = 16 * (0,65 / 0,3)2 = 75,11
N6 = 16 * (1,95 / 0,3)2 = 676
N7 = 16 * (0,65 / 0,3)2 = 75,11
N8 = 16 * (1,90 / 0,25)2 = 924,16
Kokkuvõte:
Lahuses B oli seriin ja fenüülalaniin. Seda tõestab puhaste aminohapete ja uuritava lahuse laigute sama värvus, kaugus stardijoonest, sama liikumisteguri ja teoreetilise taldriku väärtused.