Töö käik Tööreaktiiv 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Sidrunimahl Mul oli sidrunimahl lahjendatud 1:50 1 ml mahla + 49 ml dest.vett Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Kaliibrimisgraafiku koostamiseks tuleb võtta kolm teatud glükoosikontsenratsiooniga proovi ja võrrelda kontsentratsioone spektrofotomeetriga antud tulemustega (lainepikkus 410 nm) ning koostada graafikut. Proovide mistamine aldab standard+lahusest, mis sisaldab täpselt 1 mg/ml glükoosi. Sellest lahusest valmistatakse kolm lahjemat proovi, reeglina nande kontsentratsioonid on 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Skeem on toodud allpool. Värvusreaktsiooni läbiviimine
Käesolevas töös määratakse glükoosisisaldus mingis bioloogilises objektis, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. Peroksüdaasi substaadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Töö käik: Mahl või mõni muu vedelik · Tundmatuks prooviks oli värskest sidrunist pressitud sidrunimahl, millest tegin lahjenduse . · Filtreerisin sidrunimahla viljalihast. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamine Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard- lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt . · Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust järgmiselt. kontsentratsiooniga standardlahust pipeteerisin sobiva suurusega katseklaasi 2,5 ml, millele pipeteerisin 7,5 ml destilleeritud vett. Katseklaasi sulgesin korgiga ning loksutasin glükoosilahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks
Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon, oli minu katse puhul sidrunimahl. Sidrunimahlast tuli valmistada 25-kordne lahjendus. Selleks pipeteerisin gradueeritud katseklaasi 1 mL sidrunimahla ja ülejäänud 24 mL täitsin destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi standardlahus sisaldab 1,0 mg/mL glükoosi. Standardlahusest valmistasin 3 lahjendust kontsentratsioonidega 0,25 mg/mL, 0,125 mg/mL ja 0,062 mg/mL. Lahjendamisel lähtsuin põhimõttest, et lahjendamiseks võetud standardlahuse mahus ja lahjendatud lahuse lõpmahus sisaldub võrdne ainehulk. Lahjendatud lahuse mahuks oli 10 mL. Lahjendatud glükoosilahuste tegemiseks võtsin kolm puhast ja kuiva kaliibritud katseklaasi.
Uuritavaks lahuseks käesolevas töös on mee lahus, mis valmistatakse kuuma destilleritud veega, et soodustada süsivesikute lahustumist. Analüütilistel kaaludel kaalutakse 0,1 kuni 0,2 g mett ja viiakse kadudeta 100 ml mõõtekolbi. Selleks loputatakse 2-3 korda kuuma destilleritud veega kaaluklaasi ja viiakse vedelik lehtri abil samasse mõõtekolbi. Kolb täidetakse destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, suletakse korgiga ja loksutatakse hoolega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi konsentratsiooni kindlakstegemiseks tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis ühendab endas glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. X-teljel on glükoosi konsetratsioon, y-teljel absorptsiooni väärtus. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, milles on glükoosi 1,0 mg/ml. Lahjenduste konsentratsioonid: 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Kasutasin sammsammult lahjendamist
Tööreaktiiv sisaldas 2,5 mg GOx, 1,5 mg POx, 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 ning ülejäänud 0,1% kaaliumheksatsüanoferraati (II), et täita 25 ml mõõtekolb. Mina töötasin juba ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl. Pigistasin sidrunist välja väikese koguse mahla, juhendajalt sain juhised lahuse lahjendusmäära osas: tuli võtta 1ml sidrunimahla 25 ml lahuse jaoks. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni kindlaksmääramiseks sidrunimahlas tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni (x telg) lahuse optilise tihedusega (y telg) lainepikkusel 410 nm. Glükoosilahuste valmistamisel lähtusime glükoosi standardlahusest, mille glükoosisisaldus on 1,0 mg/ml. Esmalt tuli sellest valmistada kindel maht (10ml) glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, seejärel tuli seda lahjendada 2 korda ning saadud lahjendust
ettevalmistatud tööreaktiiviga. Tööreaktiiv säilitatakse külmkapi temperatuuril. Uuritava lahuse ettevalmistamine Antud töös määrasin sidruni glükoosisisaldust. Selleks pressisin sidrunist natuke mahla välja. Praktikumi juhendajalt sain lahjendusmäära: 1 ml sidrunimahla 25 ml lahuses. Lisasin 25 ml-sesse mõõtekolbi 1 ml sidrunimahla (automaatpipetiga) ning täitsin kolvi sisu destilleeritud veega kriipsuni. Sain sidrunimahla 25x-se lahjenduse. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlakstegemiseks tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel λ=410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsent-ratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (=optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel. Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard-
2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Tundmatu proovi ettevalmistamine Sidruni mahl 50ml katseklaasi valan 1ml filtreeritud sidruni mahla ja lahjendan x50 korda destilleeritud veega. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel =410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel. Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi
Töö käik. 1) Tööreaktiivi valmistamine (25 ml): (tööreaktiv on vajalik glükoosisisalduse määramiseks). - 2,5mg glükoosi oksüdaasi - 1,5 mg püroksüdaasi - 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0 - K4{Fe(CN)6} 0,1-list lahustkoguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks lõppmahuni. 2) Uuritava lahuse ettevalmistamine. Uuritavaks lahuseks kasutame mandariinimahle lahuse. Võtame 2-3ml mahla ja lahjendame (1:100) 3) Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. - Glükoosi kontsentratsiooni uuritavas lahuses kindlaks teha, tuleb aluseks koostada koliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga lainepikkusel 410 nm. - Valmistame 3 kaliibrimislahuse: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml - Selle jaoks võtakse 3 puhast kolbi, ja samm-sammult lahjendamise meetodi kasutamisel valmistame kolme erineva glükoosilahuse. 4) Värvusreaktsiooni läbiviimine.
K3[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6, sest reaktsioon toimub happelises keskkonnas. Töö reaktiiv on ettevalmistatud, materjalide kokkuhoiu mõttes. Uuritava proovi (greibimahla lahjendus) ettevalmistamine: Valmistasin greibimahlast 1:100 lahjenduse. Selleks pipeteerisin automaatpipetiga 0,5 ml pigistatud greibi mahla 50 ml kolbi, täitsin kolvi kriipsuni destilleeritud veega ning loksutasin segamini. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 2,5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 7,5 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin. Pipeteerisin esimest lahjendust 5 ml teise katseklaasi, kus oli juba 5ml destilleeritud vett ning loksutasin, nii sain 0,125 mg/ml lahjenduse. Teisest lahjendusest pipeteerisin 5 ml
POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötatakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: · 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2M fosfaatpuhver, pH=6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Tundmatu lahuse ettevalmistamine Uuritav proov on melonilahus. Etteantud melonotüki riivisin ära, selle käigus sain vajaliku hulga mahla, millest kasutasin 1 ml. Saadud mahla lahjendasin destilleeritud veega 50ml mahuni, seega teostasin 50 kordse lahjenduse.
Katseklaas nr.4: 0, 186 A Katseklaas nr.5: 0,117 A Katseklaas nr.6: 0,085 A Kuna kontrollproov andis madala optilise tiheduse näidu, siis kõikidest väärtustest (katseklaasid 2-6) lahutan kontrollproovi optilise tiheduse väärtust. Katseklaas nr.1: 0,054 A Katseklaas nr.2: 0,144 A - 0,054 A = 0,090 A Katseklaas nr.3: 0,139 A 0,054 A = 0,085 A Katseklaas nr.4: 0,186 A 0,054 A = 0,132 A Katseklaas nr.5: 0,117 A 0,054 A = 0,063 A Katseklaas nr.6: 0,085 A 0,054 A = 0,031 A Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Koostan kaliibrimisgraafik katseklaaside nr.4, nr.5 ja nr.6 absorptsiooni väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni C (mg/ml) ja y-telg näitab proovi absorptsiooni väärtust (A). Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide (katseklaasid nr.2 ja nr.3) keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi. Paralleelproovide keskmine väärtus:
Analüütilistel kaaludel kaalutakse 0,1-0,2 g mett ja viiakse kadudeta 200 ml mõõtkolbi. Seda tehakse kuuma destilleeritud veega, mida lisatakse vähehaaval mõned korrad keeduklaasi, sisu segatakse klaaspulgaga ja valatakse lehtri abil mõõtkolbi. Kui seda on 3-4 korda tehtud, siis täidetakse mõõtkolb tavalise dest-veega kriipsuni ning ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks loksutatakse lahus läbi. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni absorptsiooniga (A) ehk optilise tihedusega lainepikkusel 410 nm. X-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni ja y-telg absorptsiooni väärtust antud lainepikkusel. Glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standardlahusest, mis sisaldab täpselt 1 mg/ml glükoosi
lahjendama). Selleks kasutasin kuuma dest. vett. Loputasin kaaluklaasi 3 korda. 3. Täitsin 2/3 kolvi mahust kuuma dest veega ja hoidsin kolbi 15 minutit kuumas vesivannis, loksutasin aeg-ajalt. 4. Kontrollisin lahuse pH väärtust universaalindikaatorpaberiga, ei olnud vaja lahust neutraliseerida. 5. Täitsin kolvi märgini külma dest. veega, sulgesin korgiga ja loksutasin. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks: 1. Valmistasin 1,0 mg/ml kontsentrasiooniga glükoosi lahusest 3 lahjendust: 0,25, 0,125 ja 0,062 mg/ml. 2. Alglahuses ja lahjenduses sisaldub üks ja sama ainehulk: Cst * Vst = Clahj * Vlahj. 3. 0,25 mg/ml lahjendus: pipeteerisin puhtasse katseklaasi 5 ml glükoosi standardlahust ja lisasin dest. vett 15 ml, panin katseklaasi korgi peale ja loksutasin. Sain 20 ml 1. lahjendust. 4
Selleks kasutatakse tööreaktiivi, mis sisaldab eelpoolnimetatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOD) ja peroksüdaasi (POD), kromatogeenset, st reaktsiooni käigus värviliseks muutuvat substraati kaalium-heksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks ka fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötamine toimub ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil, selle x-teljel on glükoosi kontsentratsioon lahuses (C, mg/ml) ja y- teljel peale reaktsiooni läbiviimist mõõdetud lahuse optiline tihedus ehk absorptsioon ( tähis D või ABS). Tööreaktiivi koostis: Tavaliselt valmistatakse tööreaktiivi 25 ml vastava mahuga mõõtkolvis ja see sisaldab: · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH= 6,0 · K-heksatsüanoferraat(II) K4(Fe(CN)6) 0,1%-list lahust sellises koguses, mis on
Võrdluslahusena kasutasin destilleeritud vett. Katsetulemused: Optiline tihedus D Glükoos mg/ml 0- proov 0 0 Proov 2 0,144 Teadmata Proov 3 0,083 Teadmata Proov 4 0,100 0,25 Proov 5 0,051 0,125 Proov 6 0,026 0,062 Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Kaliibriisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide absorbtsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentartsiooni (C, mg/ml) ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust (A). Kui kasutatakse niinimetatud korrigeeritud absorptsiooni väärtusi ja eksperiment on korrektselt
Pärast korrigeerimist loeme selle näidu 0-ks. Katseklaas nr 2 (I paralleelproov) 0,121 - 0,004 = 0,117 Katseklaas nr 3 (II paralleelproov) 0,120 - 0,004 = 0,116 Katseklaas nr 4 (C4 = 0,25 mg/mL) 0,157 - 0,004 = 0,153 Katseklaas nr 5 (C5 = 0,125 mg/mL) 0,087 - 0,004 = 0,083 Katseklaas nr 6 (C6 = 0,062 mg/mL) 0,036 -0,004 = 0,032 Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine Kaliibrimisgraafiku koostasin standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosikontsentratsiooniga proovide absorptisooni väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust. Kaliibrimisgraafik Proovi absorptsiooni väärtus (A) 0.03 0.08 0.13 0.18 0.23 0.28
· Nr3 viinamarjamahl 0,153 ABS 0,052 ABS = 0,101 ABS · Nr4 esimene lahjendus 0,169 ABS 0,052 ABS = 0,117 ABS · Nr5 teine lahjendus 0,110 ABS 0,052 ABS = 0,058 ABS · Nr6 kolmas lahjendus 0,083 ABS 0,052 ABS = 0,031 ABS Nr4 konsentratsioon on 2,5/10 = 0,25 mg/ml Nr5 konsentartsioon on 1,25/10 = 0,125 mg/ml Nr6 konsentratsioon on 0,625/10 = 0,0625 mg/ml Paralleelproovide keskmine optiline tihedus on (0,1+0,101) / 2 = 0,1005 ABS. Kaliibrimisgraafiku järgi on viinamarjamahla lahuse kontsentratsioon 0,215 mg/ml. Lahjendustegur on (1+249)/1=250. Algmahla kontsentratsiooni on 0,215 mg/ml x 250ml = 53,75 mg/ml. mg glükoos =1,54 ml 53,75 mg ainet sisaldub 1ml mahlas. Kui glükoosi tihedus on 1,54 g/ml, mis teeb 1540 mg/ml, siis sisaldub 53,75 mg :1540 mg/ml = 0,03 ml glükoosi 1ml mahlas. Järelikult on 1 ml mahlas 3% glükoosi. Järeldused
Sel ajal pannakse valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustatakse need sobivate lehtrite ning filterpaberitega. Proovid filtritakse kuivadesse katseklaasidesse. Filtrile jäänud sade pole vajalik. Filtraadid peavad aga olema täiesti selged. Seejärel määratalse spektrofotomeetril nende optiliste tiheduse väärtused (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga kvartskvürette. Katseandmed ja nende töötlus: D0 = 0,733 A D1 = 0,569 A D2 = 0,587 A D3 = 0,644 A Õppejõult saadud kaliibrimisgraafiku alusel saan türosiini kontsentratsiooniks: C0 = ei määranud, kuna mõõtmis tulemus ei sobinud, st 0-proovi optiline tihedus oleks pidanud väiksem olema kui I proovi oma. C1 = 0,091 mg/ml C2 = 0,094 mg/ml C3 = 0,12 mg/ml Saadud andmete alusel koostan graafiku: türosiini kontsentratsioon (C) aeg (t). Arvutan preparaadi proteolüütilise aktiivsuse vastavalt järgmisele valemile: A = C * V1 * 2 * 103 * V2
5. Lasin proovidel seista ja seejärel filtrisin kõik neli proovi puhastesse katseklaasidesse. 6. Määrasin spektromeetril nende optilised tihedused. Proovide optilised tihedused: D0 = 0,386 A D1 = 0,561 A D 2 = 0,853 A D3 = 1,156 A Aromaatset tuuma sisaldavad aminohaooed on tänu 280nm piirkonnas paiknevate neeldumismaksimumide spektrofotomeetriliselt detekteeritavad. Hüdrolüüsi produktide sisaldus avaldatakse türosiini mikromoolidena. Õppejõult saadud kaliibrimisgraafiku alusel sain türosiini kontsentratsiooniks: C 0 =0,06 mg/ml 0s C1 =0,09 mg/ml 300s C 2 =0,1370mg/ml 600s C 3 =0,1840mg/ml 900s Arvutan preparaadi proteolüütilise aktiivsuse vastavalt järgmisele valemile: C 10 3 V1 2 V 2 A= t 181 V3 g Kus: C - türosiini kontsentratsiooni muutus mg/ml: 0,1840-0,098=0,086mg/ml t - hüdrolüüsi kestvus s: 900-300=600s
· Formeerub punane Cu2O sade. · Kolvid asetatakse elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema. · Pärast keetmist lisatakse igasse kolbi 150 ml detilleeritud vett püstjahuti kaudu ning jahutatakse kraanivee all. · Kõikidesse kolbidesse lisatakse 6 tilka indikaatorit mureksiini. · Viiakse läbi tiitrimine CuSO4 , 0,02 M lahusega kuni violetne lahus asendub püsiva rohelisega. · Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus mg/ml. . Mõõtmistulemused: Katse Aeg (min) Kulunud Cu2SO4 Glükoos (mg/ml) 1 0 3,2 2,8 2 10 11,6 10,3 3 20 19,8 17,5 C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, = 2
minutiks seisma. Oli näha väga õrna kollakat värust. Seejärel määrasin spektrofotomeetr abil kõikide lahuste optilised tihedused. OPTILISED TIHEDUSED: KATSEKLAAS nr.1: 0,043 ABS KATSEKLAAS nr.2: 0,081-0,043= 0,038 ABS KATSEKLAAS nr.3: 0,083-0,043=0,04 ABS KATSEKLAAS nr.4: 0,131-0,043=0,088 ABS KATSEKLAAS nr.5: 0,089-0,043=0,046 ABS KATSEKLAAS nr.6: O,O67-0,043=0,024 ABS Kaliibrimisgraafik Paralleelproovide optiliste tiheduste keskmine on 0,038+0,04/2=0,039. Kaliibrimisgraafiku järgi on viinamarjamahla lahuse kontsentratsioon 0,15mg/ml. Lahjendustegur on 400. Algmahla kontsentratsioon on siis 400*0,15= 60 mg/ml Naturaalses mahlas on 60mg/ml glükoosi. 1 ml mahla on 1g mahla, ehk 1000mg mahla. Järelikult: 1000mg 100% = 60*100/1000=6% 60mg x% Kokkuvõte: Tegelikult peaksid viinamarjad sisaldama umbes 7% glükoosi, mis on ligilähedane selle, mis mina sain. Glükoosisisaldus oleneb viinamarjade
o proovidega kolvid asetatakse elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema o aega arvestatakse keemise algusest o 10min pärast lõpetatakse reaktsioon 150ml destilleeritud vee valamisega kolbi o kolb jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini o kolbidesse lisatakse 5-6 tilka 0,3% mureksiidi, mis annab violetse värvuse o tiitritakse 0,02M CuSO4 lahusega roheka värvuseni o tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku abil taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s proovis. o Arvutatakse invertaasi aktiivsus mikrokatalites 1ml kohta 0-prooviga katseklaas kolb kahjuks purunes, mistõttu läks tulemus kaduma, seega arvutan aktiivsuse ülejäänud katsete tulemuste põhjal. Tulemused aeg Vasksulfaadi maht Suhkrute kontsentratsioon 10 min 11,20 mL 9,9 mg/mL
Uuritav proov. Kaalusin analuutilisel kaaludel kaaluklaasi 0,1019 g mett, viin teda kvantitatiivselt 25 ml mootekolbi. Tegin seda kuuma dest. Veega, mida lisasin vaikeste portsionitega 3 korda kaaluklaasi, klaasi sisu segasin vaikese klaaspulgaga ja tekkinud lahus valasin lahtri abil mootekolbi. Taidsin ca 1/3 kolvi mahust kuuma dest. veega ja kolbi hoidsin veevannis veel20 min, aeg-ajalt loksutasin. Parast jahutasin toatemperatuurini. Glukoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. Glukoosi standartlahust valmistasin 1,0 mg/ml glukoosi konts. Lahusest. Valmistasin kolm lahjendust, mille glukoosi konts. On vastavalt 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. Lahjenduste valmistamiseks votsin kolm puhast katseklaasi, kuhu pipeti abil mootsin eelnevalt valjaarvutatud kogus glukoosi standartlahust ja lisasin dest. vett margini. Katseklaasi sulasin korgiga ja hoolikalt loksutasin. Reaktsiooni labiviimine. Katseklaas nr.1: Pipeteerisin 1 ml distileeritud vett
Tundmatu lahuse ettevalmistamine. Tindmatuks lahuseks on mee lahus. Kaaluklaasis kaalusin 0.11 g mett. Seda viiakse kadudeta 200 ml mahuga mõõtekolbi. Seda tehakse kuuma veega (70-80ºC), klaasi sisu segatakse klaaspulkaga ja valatakse mõõtekolbi lehtri abil. Seejärel 2/3 kolbi täidetakse kuuma veega ja soojendatakse veel 15- 20 min veevannis. Pärast jahutatakse ja kontrollitakse lahuse pH (pH 7) ja siis täideyakse kolv kriipsuni külma dest. veega. Glükoosilahuse valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. Selleks kasutatakse sandartlahuse, millel on kindel kontsentratsioon (C = 1 mg/ml). Sellest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 15 ml-ga dest. veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.25 mg/ml.Viimasest lahusest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 5 ml dest veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.125 mg/ml. Viimasest lahusest võetakse 5 ml ja lahjendatakse 5 ml dest veega, saades lahuse, mille kontsentratsioon on 0.062 mg/ml. Reaktsiooni läbiviimine.
10 minutit. Kolvidesse tekib punane vask (1) oksiidi sade. 7. 10 minuti pärast lõpetan keetmist, lisades igasse kolbi 150 ml destilleeritud vett. Jahutan kolvid kraanivee all toatemperatuurini. 8. Lisan igasse kolbi 0,6 ml mureksiidi. Proovid omandavad violeetset tooni. 9. Tiitrin 0,02 M lahusega kuni roheka värvuse ilmumiseni. Esimesele proovile kuulus 4,5 ml lahust, teisele 17 ml lahust, kolmandale 29,5 ml lahust. 10. Leian taandavate suhkrute sisaldust kaliibrimisgraafiku järgi: · 1 proov, C=4 mg/ml · 2 proov, C=15 mg/ml · 3 proov, C=26 mg/ml 11.Arvutan aktiivsusi ja : taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml reaktsioonisegu üldmaht, ml ensüümi töölahuse üldmaht, ml proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml hüdrolüüsi kestus, s =26ml, =5ml, =1 ml; 10 min =600 s.
veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: · 2,5 mg glükoosi oksüdaas · 1,5 mg peroksüdaas · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhver, pH 6,0; · K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahus Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles glükoosi kontsentratsiooni tuleb kindlaks määrata, võib olla Glükoosi vesilahus Mee lahus Hele puuvlija mahl( viinamarja, õuna, sidruni, greibi vm) Mõni füsioloogiline lahus(vereseerum, uriin jne )
· 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritava lahuse ettevalmistamine · Prooviks kasutatakse pressitud apelsinimahla · Lahuseks võetakse 0,5 ml mahla, pipeteeritakse see 200ml mõõtekolbi ja täidetakse jooneni destilleeritud veega (400x lahjendus). · Mahlalahusest eemaldatakse filtrimise teel viljaliha. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks. Koostatakse kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga ehk optilise tihedusega 410 nm juures. · Võetakse 1,0 mg/ml glükoosi lahus · Valmistatakse sellest 3 eri kontsentratsiooniga lahust destilleeritud vees: 0,25; 0,125 ja 0,0062 mg/ml Värvusreaktsiooni läbiviimine · Reaktsioon viiakse läbi toatemperatuuril · Võetakse 6 kuiva katseklaasi, nummerdatakse · Katseklaasi 1 pipeteeritakse 1 ml dest
· 10 minuti pärast lõpetada keetmine, valades 150 ml destilleeritud vett läbi püstjahuti kolbi. Kolb võtta pliidilt ja jahutada kraanivee all toatemperatuurini. · Indikaatoriks lisada igasse kolbi 6 tilka mureksiidi vesilahust (annab lahusele violetse tooni). · Tiitrida lahused 0,02 M CuSO4 lahusega, kuni violetne värvus asendub roheka värvusega. Tiitrimise käigus kolvi sisu pidevalt loksutada! Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Kui palju kulus 0,02M vasksulfaadi lahust 0, 10 minuti ja 20 minuti proovide tiitrimiseks? Tiitrisin 0,02 M vasksulfaadi lahusega kõiki kolme lahust ning tulemused on järgnevad: 0 min proov - 3,0 ml 10 min proov- 14,9 ml 20 min proov 25,0 ml Invertaasi aktiivuse leidmiseks kasutasin valemit: A= (C2-C1) * V1 * V2 * 103 /( T * 180 * V3 * V4 * g )
väikeste portsionitena 3 korda kaaluklaasi, segasin klaasi sisu väikese metallpulgaga ja valasin tekkinud lahuse lehtri abil mõõtekolbi. Ca 2/3 kolvi mahust täitsin kuuma destilleeritud veega ja hoidsin kolbi veel ~20 minutit kuumas vesivannis. Seejärel jahutasin lahuse toatemperatuurini ning täitsin kolbi külma destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, sulesin korgiga ja ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks loksutasin läbi. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtusin glükoosi standardlahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistasin kolm lahjemat glükoosilahust. Selleks kasutasin samm-sammult lahjendamist: Nagu skeemilt näha, toimisin järgnevalt: võtsin 2,5 ml standardlahust ning lisasin 7,5 ml destilleeritud vett ja loksutasin hoolikalt läbi. Sain lahuse kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml.
K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Töö käik 1. Uuritava lahuse ettevalmistus Pressisin mahla viinamarjast ja tegin 200 kordne lahjendus. Selleks võtsin 0,5 ml mahla ja 100 ml vett. Filtreerisin lahust ja kasutasin edasi filtraadi. 2. Glükoosilahuse valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks Võetakse kolm 15 ml tuubi ja kasutatakse skeemi: I. Võetakse 1 ml standardlahust (konts. 1 mg/ml) viiakse 15 ml tuubi ja lisatakse 3 ml dest.vett, saadakse lahus nr 1 kontsentratsiooniga 0.25 mg/ml II. Võetakse 2 ml lahust 1 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 2 kontsentratsiooniga 0.125 mg/ml. III. Võetakse 2 ml lahust 2 ja lisatakse 2 ml dest.vett, saadakse lahus nr 3 kontsentratsiooniga 0.062 mg/ml.
POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb happelises keskkonnas. Töö käik Töötadakse ettevalmistatud tööreaktiiviga. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses tehakse kindlaks töö käigus koostatava kaliibrimisgraafiku abil. Tööreaktiivi koostis 25 ml mõõtkolvis: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0; K-heksatsüanoferraat (II) K4[Fe(CN)6] 0,1 %-list lahust sellises koguses, mis on vajalik kolvi vaba mahu täitmiseks kuni kaelal oleva märgini. Uuritav proov on mee lahus. Mee lahus valmistatakse kuuma destilleeritud veega, et soodustada suhkrute ja mees sisalduvate kõrgmolekulaarsete süsivesikute lahustumist.
Mureksiid annab lahustele violetse värvuse. Kolbides olevate lahuste tiitrimine toimub 0,02 M Cu 2SO4 lahusega, kuni violetne värvus muutub püsivaks rohekaks värvuseks. Titrandi kulu fikseeritakse kohe kui värvus natukenegi muutub. Kui roheline värv kaob lisatakse titranti veel ettevaatlikult tilk haaval ja kui värvus jääb püsima fikseeritakse lõplik kulu. Tiitrimiseks kulunud 0,02M Cu2SO4 lahuse mahu järgi leitakse kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisaldus proovides. Inveraati preparaadi aktsiivsus (A) arvutatakse: C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0 – proovis C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis V1 – reaktsioonisegu üldmaht V2 – ensüümi töölahuse üldmaht 103 - tegur üleminekuks mikrogrammidele T – hüdrolüüsi kestus 180 – glükoosi molekulmass V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks V4 – ensüümreaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht
· Kõikidesse kolbidesse lisasin indikaatorina 0,3 ml ehk 5 tilka mureksiidi vesilahust. Kolvis olevad lahused muutusid rohkemal või vähemal määral violetseks. · Kolbides olevad lahused tiitrisin 0,02 M lahusega kuni violetne värvus asendus selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Tiitrimise käigus loksutasin kolvi sisu pidevalt. · Tiitrimiseks kulunud 0,02 M lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku (sirge) järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Tiitrimisel kulunud 0,02 M lahuse hulgad: Taandavate suhkrute sisaldused kaliibrimisgraafikult: Tulemused ja nende interpreteerimine: Invertaasi preparaadi aktiivsus (A) arvutatakse valemi järgi: Kus: taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht,
10 minuti pärast lõpetan keetmise 150 ml destilleeritud vee valamisega läbi kolvi püstjahuti ning jahutan kolvid kraanivee all. Sean büretid töökorda, valades vajadusel 0,02 M CuSO 4 lahust büretis 0-ni. Lisan kolvis olevatele lahustele 0,3 ml ehk 6 tilka mureksiidi vesilahust, mille tagajärjel värvuvad lahused tumesiniseks/violetseks. Tiitrin kõik kolm kolbi ning saan tulemuseks (alustades 0-proovist ja lõpetades termostaadis kõige kauem seisnud lahusega): 1. 2,61 ml – kaliibrimisgraafiku järgi on suhkrute sisaldus C 1=2,33 mg/mL 2. 4,60 ml – C2=4,05 mg/mL 3. 6,55 ml – C3=5,75 mg/mL P.S. Kolmanda proovi titrandi hulk oleks pidanud tulema suurem, kuid juhendaja nõuandel peaksin saama sellegipoolest edasisi arvutusi läbi viia. Siit saan edasi arvutada invertaasi aktiivsuse A10, kus on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsioonil 10. minutil ja A 20, kus on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsioonil 20. minutil. Nende kahe tulemusel arvutan
mis andis kolvis olenevale lahusele violetse tooni. Tiitrisn kolbides olevate lahused läbi 0,02M CuSO4 lahuse kuni violetne värvus asendus selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Loksutasin tiitrimise käigus kolvi sisu pidevalt. Fikseerisin neid väärtusi, millised kutsusid välja esimest värvuse muutust. Panin kirja titrandi maht, mis kulus rohelise värvuse saavutamiseks. Leidsin tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi kaliibrimisgraafiku taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 mL-s reaktsiooni võetud proovis. Tiitrimise tulemused: proov kulunud CuSO4 maht, ml Glyc mg/ml 0 2,2 2,0 1 6,7 6,0 2 12,5 11,0 Invertaasi preparaadi aktiivsus(A) kat/g arvutatakse valemi järgi: Kus: C1-taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, 2,0 mg/mL
teiste lahuste optiliste tiheduste väärtustest kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse. Proovi number Optiline tihedus 1.0-proov 0,0611 2.Õunamahl 1 0,0845-0,0611=0,0234 3.Õunamahl 2 0,0840-0,0611=0,0229 4.Glükoosilahus 0,25 0,1205-0,0611=0,0594 mg/ml 5.Glükoosilahus 0,125 0,0748-0,0611=0,0137 mg/ml 6.Glükoosilahuse 0,062 0,0617-0,0611=0,0006 mg/ml Koostan kaliibrimisgraafiku Kuna kaliibrimisgraafik peaks olema linearne ning minu katseandmetega polnud seda kuidagi võimalik saavutada, siis jätan antud koha peal graafiku selliseks, nagu ta on, ning teen arvutused selle graafiku kohaselt, võttes arvesse, et saadud tulemus on suure tõenäosusega ebakorrektne. Selgitused täpsustan järeldustes. Arvutan siinkohal ära ka uuritava proovi keskmise optilise tiheduse = 0,0234+0,0229 2 = 0,02315
0.25 0.2 f(x) = 0.58x + 0.05 0.15 Absoptsioon λ=410 nm 0.1 0.05 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Glükoosi kontsentratsioon mg/ml Arvutused Kaliibrimisgraafiku võrrandi järgi leian glükoosi kontsentratsiooni: Paralleelproovide keskmine A = 0,0935 = y y = 0,5756x + 0,0541 0,0935 = 0,5756x + 0,0541 0,5756x = 0,0394 x = 0,0685 Võrrandi lahendamisel sain teada, et glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses oli 0,0685 mg/ml. Nüüd leian glükoosisisalduse massiprotsentides (X, %). Kasutan järgmist valemit: 3 100 C L 10 X d , kus
värvuse muutust tiitrimisel paremini näha. Võtsin kolvi pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini. 3. Kõikidesse kolbidesse lisasin indikaatorina 0,3 ml ehk 6 tilka mureksiidi vesilahust, mis annab kolvis olevale lahusele violetse tooni. 4. Kolbides olevate lahuste tiitrimise viisin läbi 0,02 M CuSO 4 lahusega kuni violetne värvus asendus roheka värvusega. Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafiku järgi taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Vedela invertaasi preparaadi aktiivsuse arvutamiseks kasutatakse järgnevat valemit: Kus : C1 taandavate suhkrute sisaldus 0 proovis, mg/ml C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml T hüdrolüüsi kestus, s 180 glükoosi molekulmass
L mahla lahjendustegur d mahla tihedus (g /cm3) d = 1,026 g/cm3 (internetist) Seega: 3.3.3 Kokkuvõte Katse tulemusena leidsin, et sidrun sisaldas 2,2 mg glükoosi 100 g kohta, mis teeb protsentides 0,22% (100-kordse lahjenduse puhul). Interneti andmetel sisaldub 100 g sidrunimahlas 0,5 g glükoosi ehk glükoosisisaldus on 0,5%. Võib järelda, et minu sidrun oli tavalisest sidrunist poole hapum. Hapusus võib aga oleneda päikesevalguse hulgast suvel, sordist vms. Kaliibrimisgraafiku punktid ei asetsevad lineaarsel sirgel. Katse on õigesti sooritatud.
märgatavaks. Kolvi võtsin pliidilt ja jahutasin kraanivee all toatemperatuurini. Kõikidesse kolbidesse lisasin indikaatorina 0,15 ml mureksiidi vesilahust, mis andis kolvis olevale lahusele violetse tooni. Kolbides olevate lahuste tiitrimise viisin läbi 0,02 M CuSO4 lahusega kuni violetne värvus asendus selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Tiitrimise käigus loksutasin kolvi sisu pidevalt. Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimisgraafiku (sirge) järgi taandavate suhkrute sisalduse mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Seejärel arvutasin valemi järgi invertaasi aktiivsuse (A) µkat/g. o Tulemuste analüüs ja kokkuvõte või järeldus tööst Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 hulkade järgi kaliibrimisgraafikult leitud taandavate suhkrute sisaldused reaktsioonisegus. V (CuSO4) Glükoosi sisaldus mg/ml 3,8 3,4 9,3 8,2 14,5 12,4
lainepikkusel 410 nm. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt 8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati? fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada? Kaliibrimisgraafiku koostamine on vaja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks 29 Kaliibrimisgraafik koostatakse standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide (katseklaasid 4, 5, 6) absorbtsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg /ml) ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust (A).
analüüsiobjektist, mida kasutatakse analüüsil. 87. Analüüt- aine, mille sisaldust me analüüsiobjektis määrata soovime. ja maatriks- proovi osa, mis ei ole analüüt. 88. Kromatograafia põhimõte- meetodite grupp segude komponentide eraldamiseks üksteisest. Lisaks eraldamisele ka detekteerivad eraldatud ained ja mõõdavad nende sisalduse proovis, 89. Ainete hulkade määramine kromatogrammilt: Kasutada võib: Piigi pindala, Piigi kõrgust. Kvantitatiivne analüüs käib üldiselt kaliibrimisgraafiku meetodil. 90. Analüüsimeetod- põhimõtteline menetlus teatud liiki objektides teatud analüüdi sisalduse määramiseks ja –metoodika- detailne eeskiri analüüsi läbiviimiseks. 91. Analüüsi etapid: 1.Meetodi/metoodika valimine; 2. Metoodika valideerimine; 3. Proovi võtmine; 4. Proovi jagamine identseteks alamproovideks; 5. Proovi ettevalmistamine(mineraliseerimine või ekstraheerimine) ja lahuse valmistamine; 6. Segajate mõju elimineerimine; 7
värvus asendub selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Tiitrimise käigus loksutatakse kolvi sisu pidevalt. Et mitte üle tiitrida, tuleb fikseerida titrandi kulu kohe, kui märkate esimest värvuse muutust! Kui roheline toon kaob, siis lisatakse veel ettevaatlikult titranti ja alles seejärel fikseeritakse titrandi lõplik kulu. Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku (sirge) või vastava tabeli (küsida praktikumi juhendajalt !) järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Invertaasi preparaadi aktiivsus (A) kat/g arvutatakse valemi järgi: A = (C2 C1) · V1 V2 · 103 / T · 180 · V3 · V4 · g kus: C1 taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, C2 taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml,
annaabi.ee 
