Glükoosisisalduse määramise protokoll 2020 (0)

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  Glükoosi sisalduse määramine (3.3)  Protokoll   
 
 
 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


Sissejuhatus 
 
Glükoosisidalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides kasutatakse             laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide  ​glükoosi oksüdaasi (GOx)​ ja   peroksüdaasi (POx) kasutamisel. GOx on substraadispetsiifiline ​β​,D-glükoosi suhtes ja                   tänu sellele on võimalik antud meetodiga määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute                       juuresolekul. GOx katalüüsib ​β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel ning                   reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis hüdrolüüsudes               moodustab D-glükoonhappe.  
 
GOx kujutab endast liit- ehk konjugeeritud valku ehk flavoproteiini, mis sisaldab                       mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina.               GOx-i molekul on dimeerne valk. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad. FAD                     seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need                       molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni               tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi. 
 
Antud meetodi järmises etapis kasutatakse POx-i, mis on koostiselt liitvalk ning sisaldab                         mittevalgulise komponendina heemi ehk POx on hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib                       spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib                   värviline produkt, siis saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. ​Värvilise ühendi                     kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest.  
 
Antud töö käigus kasutati substraadina ​kaaliumheksatsüanoferraati(II) K4[Fe(CN)6]. POx                 katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasneb H2O2 redutseerumine veeks.                   Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III) K3[Fe(CN)6] annab lahusele ​kollase värvuse ja on                   detekteeritav lainepikkusel ​410nm​. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt                 happelises keskkonnas  ​pH 6​ juures.    
Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis ​tööreaktiiv​,                   mis sisaldab glükoosi oksüdaasi GOx ja peroksüdaasi POx, kromogeenset substraati                     kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit, mille pH=6.                 Tööreaktiiv oli ensüümide kokkuhoiu eesmärgil laboratoorse töö jaoks juba ette valmistatud.   
 
Töö käik 
  1. Uuritava lahuse ettevalmistamine  Antud töös kasutatud tundmatuks prooviks oli apelsinimahl. Uuritava lahuse                   ettevalmistamiseks oli apelsinist välja pressitud väike kogus mahla ja sellest 200x                       lahjenduse tegemiseks pipeteerisin 0,5ml apelsinimahla 100ml mõõtkolbi ja lisasin märgini                     destilleeritud vett. 
 


2. Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks  Glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks tundmatus proovis tuleb valmistada               kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga.               Kaliibrimisgraafik koostatakse standardlahuse lahjendamisel saadud kindla             kontsentratsiooniga proovide absorptsiooni väärtuste alusel. Kindlakontsentratsiooniliste             glükoosilahuste valmistamiseks kasutasin glükoosi standardlahust, mis sisaldas glükoosi                 1mg/ml.   
 
Lahuste valmistamiseks võtsin kolm kuiva 15ml tuubi ja kasutasin järgmist samm-sammult 
lahjendamise skeemi:  1. Pipeteerisin 1ml standardlahust 15ml tuubi ja lisasin 3ml destilleeritud vett. Sain  lahuse nr 1 kontsentratsiooniga 0,25mg/ml.   2. Võtsin 2ml lahust 1 ja lisasin 2ml destilleeritud vett. Sain lahuse nr 2  kontsentratsiooniga 0,125mg/ml.  3. Võtsin 2ml lahust 2 ja lisasin 2ml destilleeritud vett. Sain lahuse nr 3  kontsentratsiooniga 0,062mg/ml.    3. Reaktsiooni läbiviimine  Reaktsioon tööreaktiiviga viidi läbi toatemperatuuril spektrofotomeetri küvettides. Selleks                 võtsin kuus kuiva küvetti ja nummerdasin need. Pipeteerisin igasse küvetti 750 ​μ​l tööreaktiivi                         ja lisasin vastavasse küvetti alltoodud lahuse ja segasin pipetiga suspendeerides läbi:  ● Küvett 1: nullproov, 250 ​μl destilleeritud vett  ● Küvett 2: 250 ​μl uuritavat proovi  ● Küvett 3: 250 ​μl uuritava proovi paralleel  ● Küvett 4: 250 ​μl glükoosilahust 1 (C=0,25mg/ml)  ● Küvett 5: 250 ​μl glükoosilahust 2 (C=0,125mg/ml)  ● Küvett 6: 250 ​μl glükoosilahust 3 (C=0,062mg/ml)   
Peale reaktsiooni algusaja fikseerimist hoidsin reaktsioonisegusid 20min toatemperatuuril.                 Glükoosi sisaldavad lahused hakkasid tekkiva kaaliumheksatsüanoferraat(III) toimel               kollaseks värvuma. 20min möödudes mõõtsin lainepikkusel 410nm lahuste optilise tiheduse                     väärtused.  Tulemused spektrofotomeetrilt on esitatud järgmises tabelis: 
    Küvett  1(nullproov)  2  3  4  5  6  Absorptsioon  0,1686  0,0600  0,0607  0,0928  0,0519  0,0292 


4. Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni  kindlakstegemine  Kaliibrimisgraafik on koostatud standardlahuse lahjendamisel saadud kindla               kontsentratsiooniga poovide (küvetid 4,5,6) absorptsiooni väärtuste alusel. Glükoosi                 kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide (küvetid                 2,3) keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi. Kuna tundmatut proovi lahjendati enne                       värvusreaktsiooni läbiviimist, leitakse graafikult kontsentratsioon uuritava proovi lahjendatud                 lahuses.  
      Tundmatuks prooviks oli mahl, mille kuivainesisaldust pole kindlaks määratud ja                     glükoosisisaldus massiprotsentides (X,%) avaldatakse naturaalse mahla suhtes. Sellisel                 juhul piirdub arvutus valemiga: 
 
X = C*L*10 ​^​-3*100/d​ , kus   C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg/ml) 
L – mahla lahjendustegur 
d – mahla tihedus (g/cm ​^​3)   
Paralleelproovide (küvetid 2,3) keskmine optilise tiheduse väärtus: 
y=(0,0600+0,0606)/2=0,06035 
 
Leian glükoosisisalduse uuritava proovi lahjendatud lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikult                 saadud lineaarvõrrandile y=0,3652x+0,0036, kui y=0,06035: 
0,06035=0,36527x+0,0036 
x=(0,06035-0,0036)/0,3652= ​0,1554  ​→  ​C=0,1554mg/ml   
Glükoosi kontsentratsioon lahjendamata lahuses: 
C*L=0,1554mg/ml*200= ​31,08mg/ml 


 
 
 
X=31,08mg/ml*10 ​^-3*100/1g/cm^3=3,11%   
Kokkuvõte 
 
Antud laboratoorse töö käigus määrasin glükoosi sisaldust apelsinimahlas. Selleks kasutasin                     apelsinist pressitud mahla ja tööreaktiivi, mis koosnes ​glükoosi oksüdaasist ja                     peroksüdaasist, kromogeensest substraadist kaaliumheksatsüanoferraadist(II) ja           fosfaatpuhvrist, mille pH=6. Kaliibrimisgraafiku koostamiseks valmistasin glükoosi               standardlahusest lahjendatud lahused ja ise koostatud kaliibrimisgraafiku alusel leidsin                   uuritava proovi glükoosisisalduse. Arvutuste tulemusena selgus, et glükoosisisaldus uuritud                   apelsinimahlas oli 3,11%.  
Oma tulemuse võrdlemiseks leidsin kaks teadusartiklit, kus mõõdetud glükoosisisaldus                   värskes apelsinimahlas oli ​2,3% ja ​2,7%​. Sellest võib järeldada, et minu tulemus jääb                           samasse suurusjärku, aga glükoosisisaldus võib näiteks erinevate apelsinisortide ja                   küpsusastmete piires erineda. Lisaks ei ole välistatud, et katse käigus esines ebatäpsuseid                         näiteks pipeteerimisel või lahuse lahjendamisel.