tihedamaks keraks ja lahusel on minimaalne viskoossus, maksimaalne valguse hajutamine, maksimaalne osmootne rhk ja minimaalne pundumine.Isoelektrilisele punktile on ka iseloomulik, et molekul välises elektriväljas ei liigu. Isoelektrilisest punktist happelisemas keskkonnas (näiteks HCl juuresolekul) on karboksüülrühmade dissotsiatsioon tagasi trjutud ja makromolekulid sisaldavad philiselt positiivselt laetud rühmi (-RNH3+). Valgu molekulil on nüüd positiivne laeng ja elektroforeesil liigub ta katoodile. Lahuses HCl sisalduse suurenemisega kasvab amiinorühmade dissotsiatsiooniaste. Tulemusena kasvavad ( -RNH3+) rühmade vahelised tukejud ning polüamfolüüdi molekulaarne kera muutub sirgemaks. Sellega kaasneb viskoossuse kasv ja lahuse hägususe vähenemine. Krgel HCl kontsentratsioonil (suurel kloriidiooni sisaldusel) väheneb aluseliste rühmade dissotsiooniaste soola (-RNH3Cl) moodustumise tttu ja selle tagajärjel vähenevad molekuli efektiivsed mtmed
o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? Maanualne sekveneerimine seisneb selles, et igasse katseklaasi lisati didesoksünukleotiide, mille üks aatom ole radioaktiivne. Kui DNA molekulid läksid ööda geeli (vt. elektroforees meetod), siis saadud geelist tehti röntgen pildi. Ja seal oli näha neid redioaktiivseid nukleotiide.Kuna teatakse, ku sasub kindla
värvainega pannakse süvendi põhja-> DNA on negat. Laenguga ja elektri väljas liigub pluss laengu suunas->DNA on värvitu, selle nägemiseks lisatakse sageli etiidiumbromiidi, mis seostub igasuguse DNA-ga->väikesed DNA jupid liiguvad kiiremini kui suured jupid->DNA jupi pikkuse hindamiseks, lisatakse ühte hambasse redel e. kindla pikkusega DNA lõikudest koosnev kontrollsegu 22. Kas DNA on sinist värvi?-EI, värvusetu 23. Miks hakkab DNA elektroforeesil agaroosgeelis liikuma?- elektrivälja mõjul 24. Millise laenguga on DNA?- negatiivse 25. Kas agaroosgeelis liiguvad kiiremini pikad või lühikesed DNA jupid?- lühikesed 26. Milleks lisatakse agaroosgeelile etiidiumbromiidi?- DNA-le värvuse andmiseks 27. Mida teevad restriktaasid?- lõikavad DNA kindla koha pealt lõikudeks, nii, et tekivad üheahelalised otsad "kleepuvad otsad" 28. Milliseid ettevaatusabinõusid kasutab molekulaarbioloogia labor, et vältida valepositiivseid tulemusi
- Uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada - Nukleotiidid – uute DNA ahelate moodustamiseks - DNA-polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA-d - Praimerid – lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule. Geel – elektroforees: - DNA proov kantakse geeli “hambasse” koos lahust raskemaks tegeva värvainega - Elektroforeesil liiguvad eri pikkusega DNA järjestused erineva kiirusega, lühemad kiiremini - Võrdluseks liiguvad geelil ka standardsed pikkusmarkerid, mille pikkus, nukleotiidide hulk on teada - Kasutatakse ainult DNA-ahelale seonduvat fluorestseeruvat värvi, mis võimaldab neid elektroforeesijärgselt detekteerida - Eri pikkusega DNA lõikudse kogumikele vastavad kriipsukesed geelil või sellest tehtud pildid Kordamisküsimused 1
Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant- DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lohustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lohustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat loikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid varvitakse voi margistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning maaratakse nende molekulmass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili. Selle alusel on voimalik vorrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH jarjestust maaramata. Samuti saab maarata naiteks erinevate mikroobituvede geneetilist sugulust, mistottu see on ka molekulaarepidemioloogia
siit saame Dupre võrrandi Wa = tg + vg - tv 25. Elektrokineetilised nähtused. Eelnevast saime teada, et üldjuhul on kolloidosake laetud. Ta laengu määrab ära -potentsiaal. Elektrokineetilisteks nimetatakse nähtusi, millised võib jagada kahte rühma: 1) väljaspoolt rakendatud elektrivälja toimel kolloidse süsteemi faasid hakkavad liikuma või 2) kus faaside liikumisel tekib potentsiaalide vahe. Esimesse rühma kuuluvad elektroforees ja elektroosmoos - potentsiaali avaldamine elektroforeesil Välise elektrivälja (E) poolt graanulale (laenguga q) avaldatav jõud Fel = qE -potentsiaali määramine elektroforeesil v =lt /t lt - osakeste poolt läbitud teepikkus t - tee läbimiseks kulunud aeg Elektroosmoos see on peenestuskeskkonna (dispersioonikeskkonna) liikumine välise elektrivälja mõjul. Peenestatud faas (dispergeeritud faas) jääb paigale. Puu (näiteks palgi) võib selle abil kuivatada paarikümne tunniga. Elektroosmoosiga on võimalik kuivatada ka pinnast,
e) RNA suhkrujääk sisaldab täiendavat hüdroksüülrühma, mida DNA pentoos ei sisalda 12. Milline on nn. kolmanda põlvkonna sekvenerimismeetodite põhiline erinevus esimese ja teise põlvkonna meetoditest: a) Sekveneeritavat DNA-d ei amplifitseerita vaid järjestatakse otse reaal-ajas b) DNA sekveneerimiseks tekitatakse ensümaatiliselt erineva pikkusega fluorestsentsmärgisega fragmentide jadad, mis lahutatakse elektroforeesil c) DNA sekveneerimine toimub kloonide kaupa d) Kogu sekveneeritav DNA purustatakse, saadud fragmentidele liidetakse praimerid ning amplifitseeritakse sild- amplifikatsioonil kiibi pinnal 13. Restriktaas HindIII lõikab DNA-d järgmisest äratundmiskohast 5'AAGCTT3'. HindIII on seega: a) Tüüp 1 restriktaas, mis annab DNA lõikamisel 3' üleulatuva otsa b) Antud ensüüm annab DNA lõikamisel tömpotsa
aminohapete juurest; trüpsiin positsiivset laengut kandvate aminohapete juurest. Spetsiifiline aktiivsus – ensüüm katalüüsib talle spetsiifilist reaktsiooni ja spetsiifiliste molekulidega?. Nt. eksonukleaasne aktiivsus, peptidaasne aktiivsus? Geelfiltratsioon Ioonvahetuskromatograafia Afiinsuskromatograafia SDS geelelektroforees – geelelektroforees naatrium dodetsüül sulfaadiga (Sodium Dodecyl Sulfate); SDS annab valkudele tugeva negatiivse laengu, mistõttu on elektroforeesil võimalik eristada valke vaid nende massi järgi. Tavalisel geelelektroforeesil eristuvad valgu massi ja laengu järgi – mida väiksem mass ja suurem laeng, seda kiiremini liiguvad geelis. Isoelektriline fokuseerimine – elektroforeesi geeli on moodustatud pH gradient; sellel geelil liiguvad valgud seni, kuni on jõudnud sellise pH-ga geeli ossa, mis vastab nende isoelektrilisele puntkile (pI) e. kui valgu summaarne laeng muutub nulliks ja kui laeng on null
Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule endale iseloomulik laeng tähtsust enam ei oma), sellisel juhul sõltub liikumiskiirus vaid molekuli suurusest. Isoelektriliseks fokuseerimiseks (IEF) nim valkude lahutamist elektriväljas vastavalt nende isoelektrilisele punktile elektriväljas liiguvad valgud niikaua, kuni satuvad piirkonda, kus nende laeng neutraliseerub keskkonna pH mõjul. 2D-elektroforees. Kahesuunalisel elektroforeesil (2D-elektroforees) eraldatakse valgud kõigepealt vastavalt nende laengule (IEF) ja seejärel vastavalt nende molekulmassile (SDS-PAGE). Valgu sõrmejälg. Protein fingerprinting on analüütiline tehnika valgu identifitseerimiseks. Esmalt tundmatu valk lõhutakse väiksemateks peptiidideks, millede absoluutmassi saab täpselt massspektromeetriga mõõta. Neid masse võrreldakse siis andmebaasis olevate tuntud valkude järjestustega
praimerist, ja muutuvaks 3´ ots, kus asub DNA polümeraasi poolt teostataval sünteesil vajalik vaba 3´ OH. DNA- fragmendid eraldatakse ahela pikkussõltuval polüakrüülamiidelektroforeesil (PAAG). Maxami ja Gilberti meetod seisneb kemikaalidega DNA ahela nukleotiidispetsiifiliste üksikkatkestamiste osalises läbiviimises kindlatüübiliste nukleotiidide juures, DNA 5 ´ otsa radioaktiivses märgistamises ning 3´ otsaliselt eripikkuseliste DNA segmentide parve analüüsis PAAG- elektroforeesil, pärast southern- ülekannet fragmnetide visualiseerimises membraanfiltrite autoradiograafial. DNA ahel katkestatase keemiliste ainetega. Sangeri meetod põhineb in vitro DNA sünteesil radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide ja spetsiifiliste DNA ahela terminaatornukleotiidide juuresolekul. Ka siin on erinevaid reaktsioonisegusid 4, kus lisaks radioaktiivselt märgistatud nukleotiididele on ka üks terminaatornukleotiid, mis lõpetab DNA sünteesi kas A, G,
nihkepinnaks (-potentsiaal). 23. Elektrokineetilised nähtused. Üldjuhul on kolloidosake laetud. Ta laengu määrab ära -potentsiaal. Elektrokineetilisteks nimetatakse nähtusi, millised võib jagada kahte rühma: 1) väljaspoolt rakendatud elektrivälja toimel kolloidse süsteemi faasid hakkavad liikuma või 2) kus faaside liikumisel tekib potentsiaalide vahe. Esimesse rühma kuuluvad elektroforees ja elektroosmoos - potentsiaali avaldamine elektroforeesil Välise elektrivälja (E) poolt graanulale (laenguga q) avaldatav jõud Fel = qE. Eelnevast tunneme osakese liikumist takistavat keskkonna sisehõõrdejõudu F= Bv = 6rv Jõudude tasakaal mingil ajahetkel Fel = F = 1,5 v - elektrokineetiline kiirus; r - osakese raadius - keskkonna suhteline dielektriline läbitavus 0 vaakumi dielektriline läbitavus - viskoossus; q - laeng; E - elektrivälja tugevus Elektroforees osakeste liikumine dispersioonikeskkonnas.
Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende liikumist ka konformatsioon – tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt või kiiremini kui sama pikad lineaarsed molekulid. Tiheduselt sarnane vedelikele kuid füüsikalised omadused sarnanevad tahketele ainetele. Geel ujub vedeliku sees. Vannis on 2 elektroodi (+ ja -) Geeli otsas on kamm mis teeb geeli (agaroosi) sisse augud. Osakesed hakkvad agaroosis erinevatel kiirustel liikuma. Milleks tuleb valkude geel-elektroforeesil kasutada naatrium-dodetsüülsulfaati (SDS)? Sest agroosgeelis saab valke eraldada vaid laengu järgi, sest geeli poorid on valkude suuruse järgi eristamiseks liiga suured. Mass-spektromeetria. Valgu segude analüüsiks, toimub vaakumis, võimeline separeerima suuri molekule. 1. proov sisestatakse massispektromeetria aparatuuri ja aurustatakse; 2. ühendid ioniseeritakse, mille tulemusena tekivad laetud osakesed (ioonid) 3
1) Monoklonaalsed plasmarakud luuüdis 10% ja/või koe biopsial plasmatsütoom 2) Monoklonaalne valk seerumis ja/või uriinis 3) Müeloomist tingitud organi või koe düsfunktsioon: hüperkaltseemia, neerupuudu- likkus, aneemia, lüütilised luulesioonid või osteoporoos Müeloomi diagnostilised kriteeriumid (II variant) Põhikriteeriumid 1) Plasmatsütoom koe biopsial 2) Luuüdis plasmarakke > 30% 3) Monoklonaalne immuunoglobuliin seerumi ja/või uriini elektroforeesil IgG > 35 g/l IgA > 20 g/l kappa või lambda ahela ekskretsioon >1,0 g /24 tunni uriinis amüloidoosi puudumisel Lisakriteeriumid 1) Luuüdi plasmatsütoos 10-30% 2) Monoklonaalse immuunoglobuliini kontsentratsioon on väiksem, kui põhikritee- riumite punktis 3 3) Lüütilised luumuutused 4) Normaalsete immunoglobuliinide kontsentratsioon on madal IgM < 0,5 g/l IgA < 1,0 g/l IgG < 6 g/l
On vaja võtta 1ml RNaasA-d, et selle lõppkontsentratsioon oleks 5ng/µl 1 ml- s TE- s. Tuleb lahjendada RNaasi 2000 korda. 3.3) Millise laenguga on DNA? Kas geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni + või elektroodi poole. DNA on negatiivse laenguga. Geeli ,,hammastega" ots (millesse on kantud DNA) tuleb asetada foreesivanni elektroodi poole. 3.4) Milleks kasutatakse geelelektroforeesil etiidiumbromiidi (EtBr)? Kuidas EtBr toimib? EtBr on vajalik elektroforeesil, et visualiseerida meie tulemused ehk selleks, et elektroforeesi pildil oleks võimalik eristada meie inserdi erinevaid osasid. Veel EtBr aitab otsustada millal on õige aeg fooresi lõpetada. Pärast kui DNA molekul on lahti keerdunud interakteerub EtBr lämmastikaluste vahel ja pärast fluorestseerib UV-kiirgusel. 3.5) Mitu grammi agaroosi on vaja 40 ml 1,5 % geeli tegemiseks? 80 ml 0,8 % geeli tegemiseks? Et valmistada 40 ml 1
4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 43. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. vt. konspekt (05.11) 44. Mille poolest erineb automaatsekveneerimine klassikalisest manuaalsest sekveneerimisest? Maanualne sekveneerimine seisneb selles, et igasse katseklaasi lisati didesoksünukleotiide, mille üks aatom ole radioaktiivne. Kui DNA molekulid läksid ööda geeli (vt. elektroforees meetod), siis saadud geelist tehti röntgen pildi. Ja seal oli näha neid redioaktiivseid nukleotiide
positiivsed liiguvad läbi puhvri elektroodi poole ja me kaotame nad. Seepärast valkude analüüsimisel kasutatakse sellist nippi: kõik valgumolekulid, mida me tahame analüüsida segatakse kokku sellise ainega, mille ingliskeelne lühend on SDS, sellel ainel on endal negatiivne laeng ja on võimeline katma suvalisi valgu molekule. Valgu pinnale tekib tugev negatiivse laenguga kate. SDS molekule on kattes nii palju, et valgule endale iseloomulik laeng tähtsust enam ei oma. Elektroforeesil hakkab kogu kupatus liikuma positiivse elektroodi poole. Kuidas me valgumolekule ikkagi näeme skeemil? Me võime in vitro nukleiinhappeid sünteesida radioaktiivsetena ja siis saame neid geelis visualiseeirda. Lisaks sellele, et võim visualiseerimiseks teha molekule radioaktiivseks, võime neid segada kokku ainetega (näiteks fluoritseeruvate), mis spetiifiliselt seonduvad nende molekulidega. Veel valkude nähtavaks tegemisest. Antikehad on valgud, mis
o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 41. DNA sekventeerimine DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 42. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust.
eemaldasin jälle sademe pealt etanooli. 9. Asetasin sadet kuivatada, et vabaneda etanooli jääkidest. Pärast suspendeerisin 20 μl MQ-s. 58. Nüüd DNA on puhas kontrolliks. 59. 60. 61.Kontroll-restriktsioon 62. Eesmärgiks on kontrollida kas soovitud DNA järjestus on sisestunud vektorisse nii nagu plaanitud oli. Restriktsiooni analüüsi käigus lõigatakse saadud DNA-d restriktaasiga ja vaadatakse elektroforeesil tekkinud DNA fragmentide suuruste järgi, kas soovitud DNA järjestus on plasmiidi sisestunud. Valitakse selliseid restriktaase, mis lõikavad nii inserdi kui vektori enda seest ning seejuures veel niimodi, et tekuksud erineva pikkusega jupid, mille suurust oleks hea võimalikult täpselt kasutatava DNA Ladderiga võrreldes kontrollida. 1. Kontroll-restriktsiooni teostamiseks esmalt pipeteerisin kokku 5,5 μl vett, 3 μl puhastatud
• 1 minut 72ºC 70 Elektroforees. Viroloogiline diagnostika 10 Mitmed DNA/RNA määramisel põhinevad meetodid (ensümaatiline restriktsioon, PCR) vajavad elektroforeesi. Elektroforees DNA ja RNA on negatiivse laenguga ja seetõttu liiguvad elektriväljas negatiivse elektroodi katoodi poolt positiivse elektroodi anoodi suunas. Nukleiinhapete elektroforeesil lahutatakse erineva suurusega DNA fragmentide segu vastavalt fragmentide suurustele ja võrreldakse neid mingi standardiga e. markeriga. Elektroforeesil liiguvad nukleiinhapped elektrivälja mõjul spetsiaalses keskkonnas geelis. Kaks tüüpilist foreesikeskkonda on: 1. Polüakrüülamiid 2. Agaroos Polüakrüülamiid on sünteetiline polümeer, mis moodustab poorse struktuuriga erineva läbimõõduga tunnelite labürindi. Kasutatakse lühikeste DNA/RNA fragmentide (5-500 bp) lahutamiseks
isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. 39. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust.
4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. DNA sekveneerimine. DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. Polümeraasi ahelreaktsioon. PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lôigu otste nukleotiidset järjestust.
isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus. 39. Polümeraasi ahelreaktsioon PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes. Reaktsiooni läbiviimiseks on vajalik teada uuritava DNA lõigu otste nukleotiidset järjestust.
5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise – selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 43. Polümeraasi ahelreaktsioon See oli revolutsioon molekulaarbioloogias, sest võimaldab eksponentsiaalselt DNA-d paljundada. PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes.
5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi blokeerimist kindla nukleotiidi kohal. Tulemuseks on erineva pikkusega fragmendid, mille elektroforeesil joonistub välja DNA molekuli NH järjestus, need saab siis tuvastada. 43. Polümeraasi ahelreaktsioon See oli revolutsioon molekulaarbioloogias, sest võimaldab eksponentsiaalselt DNA-d paljundada. PCR viiakse läbi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks. Reaktsioon pôhineb ensüümi- DNA-polümeraas kasutamisel, mis katalüüsib DNA komplementaarse ahela sünteesi. PCR on DNA-molekuli paljundamine kunstlikes tingimustes.
Elektroforees Elektroforees on protsess, kus (kolloid)osakesed liiguvad välise elektrivälja mõjul. Graanulale avaldub jõud. Elektroforeesi liikmeid on mitmeid. Ühel variandil jaotatakse laengu järgi. Teistel juhtudel võib jaotada aga molekulmassi järgi (poorne geel, ühtne laeng SDS) Elektroforeesi kaudu tseeta-potentsiaali mõõtmine Laeng avaldub järgmiselt Aga Selle modifitseerimisel (asenduse tegemisel) saame ka valemi potentsiaali leidmiseks. Seega saab elektroforeesil potentsiaal määrata Elektroosmoos Elektroosomoos on protsess, kus dispersioonikeskkond liigub, dispergeeritud faas ei liigu. See võimaldab kuivatada esemeid n. palke. Teise rühma el. kin nähtused Voolamispotentsiaal Kui suruda kolloidlahus läbi membraani, tekib potentsiaal membraani eri külgede vahel. See on voolamispotentsiaal. Vt. ETTE BENSIIN PLAHVATAB. ÄRA PANE PLASTIKPUDELISSE Sadenemispotentsiaal
Lahust inkubeeritakse, mille jooksul mõlemad antigeenid konkureerivad võrdselt pinnale seotud piiratud antikeha sidumiskohtade pärast. 3. Seostumata antigeen pestakse minema ja lisatakse substraat. 4. Resultaat: mida tugevam värvuse intensiivsus, seda vähem oli uuritavat antigeeni proovis. Immunoblotting - valguliste antigeenide analüüsimiseks/identifitseerimiseks. Valgud lahutatakse elektroforeesil polüakrüülamiid geelis, kantakse siis nitrotselluloosmembraanile. Membraani inkubeeritakse esmalt uuritava antigeeni vastase antikeha lahusega, siis antiimmunoglobuliini antikehadega või proteiin-Aga, mis on märgistatud fluoresentse värviga või ensüümiga. SDS-PAGE elektroforees - võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulmassi järgi. SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) on anioonne detergent, mis on vajalik valkude denatureerimiseks. SDS seostub
Fosfatidüülseriin eksponeerub ka membraani tsütoplasmaatilises pooles. Apoptootilises rakus fosfatidüülseriin eksponeerub ka memrbaani ekstratsellulaarsel poolel. On olemas valk (anneksiin V), mis seostub fosfatidüülseriiniga. Kasutades märgistatud anneksiini, võib apoptootilise raku nähtavaks muuta. 3. Kuna apoptootilises rakus DNA fragmenteerub, siis rakust eraldatud DNA analüüsimisel geel- elektroforeesil annab spetsiifilie redelitaolise mustri, mis on tingitud paljudest erineva pikkusega fragmentidest. 4. Mitokondrite sisemembraani membraanipotentsiaal muutub positiivsemaks. Seetõttu teatud negatiivse laenguga fluorestseeruvad värvid, mis kogunevad mitokondrites muudavad need mikroskoobis nähtavaks. Mõõdeti suure hulga rakkude DNA sisaldus. See kõikus vahemikus 3-6 pikogrammi tuuma kohta. Ühe konkreetse raku tuumas oli DNA sisaldus 5 pikogrammi
Uuritav proov, mis sisaldab antigeeni segatakse kindla hulga ensüüm-märgistatud antigeeniga. Lahust inkubeeritakse, mille jooksul mõlemad antigeenid konkureerivad võrdselt pinnale seotud piiratud antikeha sidumiskohtade pärast. 3. Seostumata antigeen pestakse minema ja lisatakse substraat. Resultaat: mida tugevam värvuse intensiivsus, seda vähem oli uuritavat antigeeni proovis. Immunoblotting- Tehnika valguliste antigeenide analüüsimiseks ja identifitseerimiseks. Valgud lahutatakse elektroforeesil polüakrüülamiid geelis, kantakse siis nitrotselluloosmembraanile. Membraani ikubeeritakse esmalt uuritava antigeeni vastase antikeha lahusega, siis antiimmunoglobuliini antikehadega või proteiin-Aga, mis on märgistatud radioisotoobi või fluoresentse värviga või ensüümiga. SDS-PAGE elektroforees- SDS-PAAG (polüakrüülamiidgeel) võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulmassi järgi. SDS (naatriumdodetsüülsulfaat) on anioonne detergent, mis on vajalik
Fosfatidüülseriin eksponeerub ka membraani tsütoplasmaatilises pooles. Apoptootilises rakus fosfatidüülseriin eksponeerub ka memrbaani ekstratsellulaarsel poolel. On olemas valk (anneksiin V), mis seostub fosfatidüülseriiniga. Kasutades märgistatud anneksiini, võib apoptootilise raku nähtavaks muuta. 3. Kuna apoptootilises rakus DNA fragmenteerub, siis rakust eraldatud DNA analüüsimisel geel- elektroforeesil annab spetsiifilie redelitaolise mustri, mis on tingitud paljudest erineva pikkusega fragmentidest. 4. Mitokondrite sisemembraani membraanipotentsiaal muutub positiivsemaks. Seetõttu teatud negatiivse laenguga fluorestseeruvad värvid, mis kogunevad mitokondrites muudavad need mikrosk nähtavaks. Mõõdeti suure hulga rakkude DNA sisaldus. See kõikus vahemikus 3-6 pikogrammi tuuma kohta. Ühe konkreetse raku tuumas oli DNA sisaldus 5 pikogrammi
ebasümmeetriline fosfolipiidide suhtes. Fosfatidüülseriin paikneb membraani tsütoplasmaatilises pooles. Apoptootilises rakus fosfatidüülseriin eksponeerub ka membraani ekstratsellulaarsele poolele. On olemas valk (anneksiin V), mis seostub fosfatidüülseriiniga. Kasutades märgistatud anneksiini, võib apoptootilisi rakke nähtavaks muuta.3. Kuna apoptootilises rakus DNA fragmenteerub, siis rakust eraldatud DNA analüüsimisel geel- elektroforeesil annab spetsiifilise redelitaolise mustri, mis on tingitud paljudest erineva pikkusega fragmentidest. 4. Mitokondrite sisemembraani membraanipotentsiaal muutub positiivsemaks. Seetõttu teatud negatiivse laenguga fluorestseeruvad värvid , mis kogunevad mitokondrites ja muudavad need mikroskoobis nähtavaks, enam ei liigu mitokondritesse. !!!!!!15.)Mõõdeti suure hulga rakkude DNA sisaldus. See kõikus vahemikus............ pikogrammi tuuma kohta. Ühe konkreetse raku tuumas oli DNA sisaldus ..
Selliseid DNA molekule, mis on eeltoodud moel moodustatud nimetataksegi rekombinant-DNA molekulideks, millest ka nimi kogu tehnoloogiale. Lisaks eeltoodule saab restriktaasi abil lõhustatud DNA molekuli uurida elektroforeetiliselt. Nimelt moodustub restriktaasi toimel DNA molekulist erineva pikkusega fragmente (restriktsiooni fragmendid), millel on ka erinev molekulmass. DNA lõhustub nii mitmeks fragmendiks kui mitu vastavat lõikepiirkonda temas on. Elektroforeesil agaroosgeelis liiguvad need fragmendid erineva kiirusega asetudes ritta vastavalt molekulmassile. Need fragmendid värvitakse või märgistatakse radioaktiivsete isotoopidega ning määratakse nende molekul- mass. Sel teel saame DNA restriktsioonikaardi e profiili. Selle alusel on võimalik võrrelda erinevate isendite geneetilisi koode ilma NH järjestust määramata. Samuti saab määrata nt erinevate mikroobitüvede geneetilist sugulust. Rekombinant DNA ja DNA kloonimine
koostises. Igal inimesel võib arvestuslikult olla kuni ca. 100 miljonit erinevat immunoglobuliini molekuli, mis on määratletud Ig-de geeni-blokkide rekombineerumise kaudu. Kõrgematel imetajatel esineb 5 klassi immunoglobuliine: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, mille erinevus seisneb molekulide suuruses, laengus, aminohappelises ja valgulises koostises. Erinevused esinevad mitte ainult klasside vahel, vaid ka iga klassi piiris. Normaalse vereseerumi elektroforeesil esinevad immunoglobuliinid kõikides fraktsioonides α-st γ- Ig-de strukturaalsed komponendid. (IgG näitel) Peamine neljaahelaline Ig-de srtuktuurne ühik (monomeer) koosneb kahest kergest ja kahest raskest polüpeptiidsest ahelast. Kerged (L-) ahelad koosnevad 212 aminohappejäägist, nende molekulaarmass on 25 kDa. Nad on identsed kõikidel Ig klassidel. Rasked (H-) ahelad koosnevad 450 aminohappejäägist, nende molekulaarmas on 50-77 kDa
annaabi.ee 
