Vx - V x Kromatogramm on eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vaheline graafiline sõltuvus. Töö käik Kolonni iseloomustramine ja ettevalmistamine: · Kontrollin kolonni vertikalsust. On vertikaalne. · Märgin üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex'i mark ja seda iseloomustav tegur k , mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. Sephadex G-75, pundumistegur k= 0,1. · Mõõden geelisamba (täidise) kõrgus L ja diameeter d, kasutades sobiva joonlauda. L=32,5 cm. d=1,9 cm. · Arvutan täidise kogumaht Vt . · Arvutan geelimaatriksi maht Vg . · Arvutan kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismaht Vxmax. · Arvutan fraktsioonide üldarv n, arvestades, et ühe fraktsiooni mahuks on 2 ml. n= Vxmax/2 =82,89/2=41,445=~42 · Katseklaasistatiivi asetan fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml)
Täidise kõrgus on tavaliselt 25- 30 cm, täidise kohal umbes 3-4 cm kõrgune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine ja fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. 2. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine: · kontrollitakse ja vajadusel korrigeeritakse kolonni asendit · märgitakse üles Sephadex täidise mark ja pundumistegur k · mõõdetakse geelsamba kõrgus L ja diameeter d · arvutatakse täidise kogumaht Vt · arvutatakse geelmaatriksi maht Vg = k*Vt ja maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg · arvutatakse fraktsioonide arv n, kui ühe fraktsiooni mahuks võetakse 2 ml, n = Vxmax / 2 · võetakse vastav hulk 2 ml-ga märgistatud ja nummerdatud katseklaase · läheduses hoitakse voolutuslahuse pudel koos sobiva pipetiga, märgitakse
jõudnud kolonni põhja lähedale, hakati eluaati koguma nummerdatud katseklaasidesse 2 ml kaupa. Fraktsioonide kogumine lõpetati, kui eluaat oli muutunud värvituks. Ainete kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendati lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse kaudu, mida mõõdeti aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel spektrofotomeetriga. Tulemused Kolonni iseloomustavad parameetrid täidise mark ja materjal: dekstraan, Sephadex G-75 täidist iseloomustav pundumistegur: k=0,1 täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L=17,5 cm ; d=2,6 cm arvutatud täidise kogumaht: arvutatud maksimaalne elueerimismaht: arvutuslik fraktsioonide üldarv: Uuritava segu koostis: dekstraansinine, müoglobiin, DNP-aspartaat Voolutuslahus: 7,5 pH; Tris/HCl 0,1 M NaCl 2 Mõõtmistulemuste tabel Fraktsiooni number Elueerumismaht V (ml) Optiline tihedus (A)
18 53,5 0,2847 19 55,5 0,7203 20 57,5 1,0875 21 59,5 0,9052 22 61,5 0,4464 23 63,5 0,1631 24 65,5 0,0533 25 67,5 0 Tulemused Kolonni parameetrid · Täidis: Sephadex G-75 · Pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus: L = 32cm ja diameeter: d = 1,7cm · Täidise kogumaht: Vt = 72,63cm3 · Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 65,357cm3 · Fraktsioonide arv n = 25 Kromatogramm · Teades, et komponentideks olid: 1. Dekstraansinisest 3mg/ml, Mr = 2 · 106 2. Müoglobiinist 6mg/ml, Mr = 1,7 · 104 3. DNP aspartaadist 0,3mg/ml
Kui esimene värviline riba hakkab jõudma kolonni alaserva tuleb hakata koguma selle mahtu 2 ml fraktsioonide kaupa. Kolonni täidise kohal peab olema koguaeg piisavalt eluneti, et õhk ei pääseks kolonni. Lõpuks kui kõik värvilisi fraktsioone enam ei tule võib võib prooide kogumise lõpetada. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Täidise mark ja materjal=> Sephadex, 675 Täidist iseloomustav pundumistegur=> 0,1 Täidise kõrgus=> 12,5 cm Täidise sisediameeter=> 2,7 cm Täidise kogumaht=> 71.53 cm3 Maksimaalne elueerimismaht=> 64,38 cm3 Fraktsioonide üldarv=> 32,19 B. Kromatogramm A- Müoglobiin B- D-aspartaat C- dekstraansinine V A B C 15,45 0 0 0 17,45 -0,0251 -0,0313 -0,0139 19,45 -0,0271 -0,033 -0,0164 21,45 -0,0168 -0,0225 -0,0055
Kogutud eelfraktsiooni mahu mõõtsin mõõtsilindri abil. 5. Edasi kogusin fraktsiooni katseklaasidesse, mis olid kalibreeritud 2ml peale. Nii tegin kuni kolonnis polnud enam lahutatavaid aineid. 6. Kui sininse, pruuni ja kollase värvusega fraktsioonid olid kogutud, mõõtsin ära nende optilised tihedused kindlal lainepikkusel spektrofotomeetriga. Arvutused: Geelisamba kõrgus: 17,8cm Diameeter: 2,4cm, raadius=1,2cm, seega kolonni maht: Vt=3,14x1,22x17,8=80,53 ml pundumistegur k=0,1 geelimaatriksi maht Vg= 0,1x80,53=8,053 ml Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax= Vt-Vg=80,53-8,053=72,477 ml Fraktsioonide(2ml) üldarv n= Vxmax/2 =72,477/2=36,24 ~36 Kokku võtsin 34 fraktsiooni, igaühes 2ml proovi, mõõtekolvis oleva eeljooksu maht: 24 ml, seega teeb kokku 34x2= 68+24=92 ml Fraktsiooni number Lainepikkus Elueerimismaht V, ml Optiline tihedus, A Ühendatud fraktsioon 670 24 0
Vx max = Vt Maksimaalse elueerimismahu saab arvutada, kui geelimaatriks on teada: Vx max = Vt - Vg Liikuvustegurit Rf kasutatakse nende ainete iseloomustamiseks, mis suudavad geeli pooridesse difundeeruda ja mille elueerimismaht on kindlaks määratud. Rf = Vx - Vx min / Vx max - Vx min Kromatogramm graafiline sõltuvus aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahel Töö käik Esmalt märkida üles vajalikud andmed ning teha arvutused Täidise mark: Sephadex G75 Täidist iseloomustav pundumistegur k= 0,1 Geelisamba kõrgus L= 25,5 cm Kolonni sisediameeter d= 1,6 cm r= 0,8 cm Voolutuslahuse koostis: 0,15M NaCl Proovi koostis: Dextrane blue 6mg/ml, Müoglobiin 6mg/ml, DNP-aspartaat 0,3mg/ml Arvutasin välja: Vt = r2 * L= 3,14 * 0,64 * 25,5 = 51,27 cm3 Vg= k*Vt = 0,1 * 51,27 = 5,127 ml Vx max = Vt Vg = 51,27 5,127 = 46,143 ml N= Vx max /2 = 46,143 /2 = 23,1 tk Pärast ettevalmistuste tegemist avada ettevaatlikult kolonni voolutusava ning kui vedeliku tase
elueerimismaht Vx vaadeldavas keskkonnason kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf Rf = Kromotogramm-kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Kolonn nr.1.Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Joonlauda abiga mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 17,4 cm ja diameetri D = 2,8 cm. Arvutasin täidise kogumahu Vt = = 76,49 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k Vt = 7,65 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt Vg = 68,84 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n = Vxmax / 2 = 34,42. Nummerdasin kaliibritud katseklaase (35t)
Ühendatud fraktsiooni mahu mõõtsin pärast. Alustasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Elueerimise lõpetasin, kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsisin spektrofotomeetri abil. Igal ainel oli oma neeldumismaksimum. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrdusid 0-ga ja neid polnud vaja mõõta. Tulemused: · Kolonni täidiseks on Sephadex'i G-75, iseloomustav pundumistegur k on 0,1 · Geelisamba kõrgus L=33 cm ja diameeter d=1,6 cm · Täidise kogumaht Vt=L** =33* * =66,35 ml · Geelimaatriksi maht Vg = k · Vt=0,1*66,35=6,635 ml maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt Vg= 66,35-6,635=59,715 ml · Fraktsioonide üldarv n, ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vxmax/2=59,715/2=30 · Elueerimislahus 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl pH 7,4 Optiline Elueerumismaht
liikuvusteguriga Rf V x −V min x Rf = V max−V min x x Kromotogramm - kromotograafia protsessi visuaalne väljund, see on graafiline sõltuvust eluaadi fraktsioonides sisuldava aine kontsentratsioon ja eluaadi mahu vahe. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine Tööd teostasin kolonni juures nr 2. Kontrollisin kolonni vertikaalsust ja märkisin üles täidise margi: Sephadex G-75. Pundumistegur k=0,1. Mõõtsin geelisamba (täidis) kõrguse L = 23,3 cm ja diameetri D = 1,6 cm. Arvutasin 2 täidise kogumahu Vt = π ∙ r ∙ L = 0,82*23,3* π =46,85 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k ∙ Vt = 0,1*46,85= 4,685 cm ja kolonni iseloomustav maksimaalne elueerimismahu Vxmax = Vt – Vg = 42,162 cm. Arvutasin fraktsioonide üldarvu n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml ehk n =
Elueerimine lõpeteti kui väljus viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektromeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Täiesti värvusetute fraktsioonide optilise tiheduse väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone polnud vaja mõõta. Tulemused esitati kromatogrammina. TULEMUSED JA NENDE INTERPRETATSIOON Täidise mark SEFADEX G-75 Pundumistegur k 0,1 Täidise kõrgus L 31,5 cm Kolonni sisediameeter d 1,8 Täidise kogumaht ( ) Geelmaatriksi maht Maksimaalne elueerimismaht Fraktsioonide üldarv Dekstraansinine Uuritav segu Müoglobiin DNP-aspartaat
· Spektrofotomeetris mõõdetakse segude optilist tihedust järgmistel lainepikkustel: sinised segud 670 nm, kollased segud 410 nm ja pruunikad segud 370 nm. · Täiesti värvusetute fraktsioonide optilised tihedused võrduvad 0-ga ja neid pole vaja mõõta. · Saadud tulemustest koostatakse katseandmete tabel ja selle alusel kromatogramm. Kolonni iseloomustavad parameetrid · Geel: Sephadex G 75 , fraktsioneermispiirkond 3000 80000 Daltonit · Geeli pundumistegur: k = 0,1 · Täidise kõrgus L = 31.5 cm · Kolonni sisediameeter: d = 2,1 cm Proovi komponendid · Dekstraalsinine (6mg/ml) · Müoglobiin (6mg/ml) · DNP aspartaat (0,6 mg/ml) Mõõtmis- ja arvutamistulemused 1. Kolonni täidise maht Vt 2. Geelmaatriksi maht Vg 3. Kolonni maksimaalne elueerimismaht Vx,max 4. Fraktsioonide üldarv n. 5. Mõõtmistulemuste tabel Optiline
vastavalt vajadusele lisada ning vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektrofotomeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1 Täidise kõrgus L = 32,5 cm Kolonni diameeter d = 2,1 cm r =1,05 Täidise kogumaht: Vt= ·r2·L = 3,14 · 1.052 · 32,5 = 112,5 cm3 Geelmaatriksi maht: Vg= 0,1 · 112,5 = 11,25 cm3 Maksimaalne elueerimismaht: Vxmax = 112,5 11,25 = 101,26 cm3 Fraktsioonide üldarv: n=101,26 : 2 = 50, 63 51 Uuritav segu: Dekstraansinine 3mg/ml Müoglobiin: 5mg/mol DNP-aspartaat: 0,3 mg/mol Elueerimislahus: pH= 7,4 20 mM Tris/HCl 0,15 M NaCl
molekulid, mis on võimelised graanulitesse täielikult sisenema Kui aine molekulid mahuvad geeli pooridesse, siis iseloomustatakse nende liikumist kolonnis liikuvus-teguriga Rf, mille väärtus jääb vahemikku 0...1. Rf= (Vx-Vxmin)/(Vxmax-Vxmin) Aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nim. kromatogrammiks. Töö käik Kolonni iseloomustavad suurused Kasutatav geel Sefadex G-75 Pundumistegur k=0,1 Geelisamba kõrgus L= 29,5 cm Kolonni sisediameeter 2,1 cm ( r= 1,05 cm) Vajalikud arvutused tööks Kogumaht Vt= Sp * L Sp= r2 Vt= 3,14 * (1,05)2 * 29,5 = 102 cm3 Geelimaatriksi maht Vg= k* Vt Vg= 0,1* 102 = 10,2 cm³ Maksimaalne elueerimismaht Vxmax= Vt-Vg Vxmax= 102-10,2= 91,8 cm3 Fraktsioonide üldarv n= Vxmax/ 2 n= 91,8/246 katseklaasi Elueerimispuhver: 0,15 M NaCl; 20 mM Tris/HCl; pH= 7,5
36 101,0 0,451 37 103,0 0,303 38 105,0 0,184 39 107,0 0,096 Tulemused ja nende interpreteerimine: Kolonni iseloomustavad parameetrid. Täidise mark ja materjal: Sephadeks G-75 Pundumistegur k: k=0,1 Täidise kõrgus: 32,7 cm Kolonni sisediameeter: 2,2 cm Täidise kogumaht : 124, 26 Maksimaalne elueerimismaht : 111,834 Fraktsioonide üldarv: 55,917 56 Uuritav lahus oli D. Kromatogramm. Kõige esimesena väljus kolonnist dekstraansinine , selle osakesed olid väga suured ja ei mahtunud geeli pooridesse
Aine kontsentratsiooni väljendatakse igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine toimus, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest. Absorbtsiooni mõõtsin spektrofotomeetritel. 1.7 Tulemused ja nende interpreteerimine A. Kolonni iseloomustavad parameetrid Täidise mark: Sephadex'i mark: G-75 Täidist iseloomustav pundumistegur: k = 0,1 Täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter: L = 17,6 cm d = 3 cm mõõtmisviga d = 2,5 cm Arvutatud täidise kogumaht Vt. Vt = L * r2 * = 17,6 * 1,52 * = 124,4 cm3 Vt = L * r2 * = 17,6 * 1,252 * = 86,4 cm3 Arvutasin geelimaatriksi mahu Vg = k · Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustava maksimaalse elueelirimismahu Vxmax = Vt - Vg Vg = 0,1 · 124,4 cm3 = 12,44 cm3 Vg = 0,1 · 86,4 cm3 = 8,64 cm3
Optilist tihedust mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, spektrofotomeeriga elektromagnetilise kiirguse visuaalses piirkonnas. Siniseid fraktsioone mõõtsin lainepikkusel 670 nm, pruune lainepikkusel 410 nm ja kollaseid lainepikkusel 360 nm. Tulemused ja nende interpreteerimine A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: ·Täidise materjal: Dekstraan ·Täidise mark: Sephadex G75 ·Täidist iseloomustav pundumistegur k=0.1 ·Täidise kõrgus: 28cm ·Kolonni sisediameeter:2.2 cm ·Arvutatud täidise kogumaht Vt=106 ·Arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx;max=106-0.1*106=95.4 ·Arvutuslik fraktsioonide üldarv n=Vx;max/2= 95.4/2=47.7 B. Mõõtmistulemuste tabel ja kromatogramm. Fraktsiooni nr. Elueerimismaht V;ml Optiline tihedus,A 0 26 ml 0.000 1 2 0.002 2 2 0.065
23 64 0,136 24 66 0,036 25 68 0,013 · Tulemuste analüüs ja kokkuvõte või järeldus tööst A. Kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: täidise materjal - dekstraangeel ja mark Sephadex G-75, k = 0,1 - täidist iseloomustav pundumistegur, täidise kõrgus l = 32 cm ja kolonni sisediameeter d = 1,6 cm, arvutatud täidise kogumaht Vt = 64 cm2, arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vxmax = 57,6 cm2, arvutuslik fraktsioonide üldarv n = 29. B. Mõõtmistulemuste tabel ja selle alusel koostatud kromatogramm, st graafiline sõltuvus. Mõõtmistulemuste tabel: Fraktsiooni nr. Elueerimismaht Optiline tihedus, A V, mL
32 85,5 0,1124 33 87,5 0,0431 34 89,5 0,0308 35 91,5 0,0145 TULEMUSED JA JÄRELDUSED TÄIDISE MARK Sephadex G-75 TÄIDIST ISELOOMUSTAV K= 0,1 PUNDUMISTEGUR (k) TÄIDISE KÕRGUS (L) JA KOLONNI L = 17,8 SISEDIAMEETER (d) d = 2,7 ARVUTATUD TÄIDISE KOGUMAHT (Vt) Vt = 101,9 cm3 ARVUTATUD MAKSIMAALNE Vxmax = 91,7 cm3 ELUEERIMISMAHT (Vxmax) ARVUTUSLIK FRAKTSIOONIDE n = 45,85 ÜLDARV (n) Katse tulemuste põhjal saadud kromatogramm: 1
Fraktsiooni nr Elueerumismaht Optiline tihedus, A V, ml Ühendatud fraktsioon 0 1 2 3 ... Tulemused ja nende interpreteerimine A. Esitatakse kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid: ¾ täidise materjal ja mark, ¾ täidist iseloomustav pundumistegur k, ¾ täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter, ¾ arvutatud täidise kogumaht Vt , ¾ arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vxmax, ¾ arvutuslik fraktsioonide üldarv n. B. Tuuakse ära mõõtmistulemuste tabel ja selle alusel koostatakse kromatogramm, st graafiline sõltuvus, mille x-teljel on eluaadi maht (V, ml) ja y-teljel aine kontsentratsioon, väljendatuna eluaadi vastava fraktsiooni absorptsiooni (optilise tiheduse) väärtusena (tähis A või D). C
annaabi.ee 
