Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramise protokoll 2020 (0)

Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine 193719LAAB



Proteolüütilise ensüümi aktiivsuse määramine (3.2) Protokoll


Sissejuhatus Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete
hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides. Protsessi tulemusena tekivad madalama
molekulmassiga peptiidid ja vabad aminohapped. Proteolüüs jaguneb piiratud ja piiramatuks
proteolüüsiks, sest mõned proteaasid lõhustavad vaid teatud aminohapetega külgnevaid
peptiidsidemeid. Proteaasid jagunevad endo- ja eksopeptidaasideks vastavalt sellele, kas proteaas toimib
polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiidsidemetele. Ensüümi toimimiseks
optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse ka hapusid, neutraalseid ja
leelisproteaase. Ensüümi toimemehhanism tuleneb proteaasi aktiivtsentri ehitusest. Antud töös kasutati substraadina kaseiini, mida kasutatakse neutraalsete ja aluseliste
proteaaside aktiivsuse määramisel. Kaseiin on piima põhivalk, mis on koostiselt fosfoproteiin
ja esineb molekulide kõrge hüdrofoobsuse tõttu piimas mitsellidena. Proteaasi aktiivsuse
objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini hüdrolüüsi algstaadiumit, mil katkenud on vaid
üksikud peptiidsidemed. Hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav ja proteaaside aktiivsus
avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanenud vabade aminohapete ja peptiidide hulga kaudu.
Antud töös proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava
proteaasi toimel ja trikloroäädikhappega mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse
määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid
sadestuvad lahusest välja TKÄ toimel, mis samas inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise
hüdrolüüsi. Peale sademe eraldamist jäävad lahusesse vabad aminohapped ja
madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset
tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad 78 neeldumismaksimume UV-
piirkonnas lainepikkustel 270–280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti
detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetakse kindlal lainepikkusel
uuritava lahuse optilist tihedust. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse
türosiini kontsentratsioonina. Ensümaatilistes töödes tuleb kasutada konkreetse ensüümi jaoks optimaalse pH-ga
reaktsioonikeskkondi. Selleks kasutatakse puhverlahuseid, mis koosnevad kas nõrgast
alusest ja selle tugeva happega moodustunud soolast või nõrgast happest ja selle soolast
tugeva alusega. Proteaasi aktiivsuse määramise töös kasutatavate ensüümide puhul on pH
vahemikus 8,4-8,6 ning puhverkeskkonnaks sobib boorhappest ja booraksist koosnev
boraatpuhver.


Töö käik 1. Puhvri valmistamine Proteaasi aktiivsuse määramiseks oli esiteks tarvis valmistada puhverlahus, mille pH jääks
vahemikku 8,4-8,6.
Selleks valmistasin 10ml boorhappe lahust, kaaludes 0,12g boorhapet 15ml tuubi ja lisasin
sellele destilleeritud vett 10ml mahuni. Seejärel valmistasin 10ml booraksi lahust, kaaludes
0,19g booraksit 15ml tuubi ja viisin mahu 10ml-ni.
Pipeteerisin keeduklaasi 5,5ml boorhappe lahust ja 4,5ml booraksi lahust ning kontrollisin
lahuse pH-d pH-meetriga. Sain esialgu tulemuseks 8,63, mis oli natuke liiga kõrge ja peale
boorhappe lisamist viisin pH 8,59 peale. 2. Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Minu uuritavaks ensüümipreparaadiks oli alkalaas, mis on bakteriaalne proteaas ja lagundab
valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid. Antud ensüümi kontsentratsioon oli 2mg/ml,
töölahuse valmistamiseks kaalusin 15ml tuubi 10,6mg ensüümipreparaati ja lisasin 5ml
eelnevalt valmistatud puhverlahust. Segasin vortexil ensüümi lahustumiseni. Tekkis hägune
lahus, kuna preparaat sisaldas täiteainet, mis ei lahustu. 3. Kaseiini hüdrolüüsi läbiviimine Pipeteerisin 15ml tuubi 12ml 2% kaseiini lahust ja panin selle termostaati 30°C juurde ~7
minutiks soojenema. Nummerdasin neli kuiva 15ml tuubi ja pipeteerisin neisse 2ml 5%-list
trikloroäädikhappe lahust.
Peale kaseiini soojendamist termostaadil ~10 minutit võis alustada kaseiini hüdrolüüsi.
Selleks pipeteerisin kaseiinile juurde 0,5ml valmistatud proteaasi (alkalaasi) töölahust,
loksutasin ja käivitasin stopperi.
Peale ensüümi lisamist võtsin pipetiga 2ml reaktsioonisegu ja viisin selle esimesse
trikloroäädikhapet sisaldavasse tuubi (0-proov). Seejärel asetasin reaktsioonisegu tagasi
termostaati. 5, 10 ja 15 minuti möödudes pipeteerisin 2ml reaktsioonisegu vastavalt
tuubidesse nr 2, 3 ja 4. Trikloroäädikhapet sisaldavates tuubides tekkis reaktsioonisegu
lisamisel valge sade, lisasin ka foto. Sade tekkis, sest TKÄ toimel sadenesid kaseiinist välja
tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid. Proteaasi aktiivsus avaldatakse vabade
aminohapete kontsentratsiooni kaudu, mis TKÄ toimel välja ei sadene. Sademe täielikuks
formeerumiseks jätsin tuubid ~15 minutiks seisma.


Tuubid, kus on trikloroäädikhappele lisatud reaktsioonisegu (12ml 2% kaseiini + 0,5ml alkalaasi töölahust). Reaktsiooni kestvus 0, 5, 10 ja 15min. 4. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine Peale sademe põhja settimist tuli proove sademe paremaks eraldamiseks tsentrifuugida 5
minutit 3500rpm juures. Kuna tsentrifuugimisel on oluline katseklaaside tasakaalustamine,
kaalusin ära kõik neli proovi sisaldavat tuubi. Kõik neli tuubi olid sarnase kaaluga ning
sobisid tsentrifuugimiseks paaridesse. Seejärel panin valmis 4 puhast ja kuiva 15ml tuubi koos plastlehtri ja paberfiltriga. Filtrisin
tsentrifuugitud proovid kuivadesse tuubidesse, proovi kandsin filtrile dekanteerides. Selleks,
et olla kindel, et supernatant on täiesti selge pipeteerisin 1ml igat proovi 1,5 ml tuubidesse ja
proove tsentrifuugiti 5 minutit 12600rpm juures.


Tuubid proovidega peale esimest tsentrifuugimist. Määrasin spektrofotomeetril lahuste optilise tiheduse lainepikkusel 280nm. Selleks kasutasin
1cm läbimõõduga plasküvetti. Esimesena mõõtsin spektrofotomeetris destilleeritud vee
optilise tiheduse ja seejärel kõigi nelja proovi optilise tiheduse. Leidsin kaliibrimisgraafikult
vastavate proovide optilise tiheduse väärtustele neis sisalduva türosiini kontsentratsiooni
(mg/ml). Tulemused on esitatud allolevas tabelis. Absorptsioon Vastav Tyr kontsentratsioon (mg/ml) 0,3337~0,33 0,052mg/ml 0,4376~0,44 0,069mg/ml 0,5634~0,56 0,088mg/ml 0,7335~0,73 0,114mg/ml


Arvutan ensüümipreparaadi proteolüütilise aktiivsuse A (μkat/g) vastavalt valemile: A = ΔCTyr • 10^3 • V1 • V2 • 2 / (Δt • 181 • V3 • g) ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml)
Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s)
V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml)
V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml)
2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (1 ml 2 ml, seega L = 2)
V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml)
g – proteaasi preparaadi kaalutis (g)
181 – türosiini molekulmass Lineaarfunktsiooni y=0,0041x+0,05 järgi:
C1=0,0041*5+0,05=0,0705mg/ml
C2=0,0041*15+0,05=0,1115mg/ml
ΔC(Tyr)=0,1115-0,041=0,041mg/ml
Valisin ajavahemikuks 5-15 minut ehk Δt=10min=600s
V1=12ml+0,5ml=12,5ml
V2=5ml
V3=0,5ml
g=10,6mg=0,0106g A=0,041mg/ml * 10^3 * 12,5ml * 5ml * 2/(600s * 181 * 0,5ml * 0,0106g)=8,9041μkat/g Arvutusest selgub, et alkalaas hüdrolüüsis 30°C juures 1s jooksul kaseiinis
8,9041μmol peptiidsidemeid 1g kohta.


Kokkuvõte Antud laboratoorse töö käigus sain teada, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu
hüdrolüüsil vabanenud vabade aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Õppisin kasutama
pH-meetrit, tsentrifuugima ja sain iseseisvalt kasutada ka spektrofotomeetrit. Spektrofotomeetriga saadud tulemused asusid enam-vähem lineaarsel sirgel, nagu ette
nähtud. Töö käigus uuritud ensüümipreparaat oli alkalaas ja minu katse tulemusena selgus,
et alkalaasi aktiivsus A=8,9041μkat/g.