Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substaat + 2 H2O POx-i toimel oksüdeeruva kromgeense substraadina kasutatakse bensidiini derivaate. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat (III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusele 410 nm. Reaktsioon kulgeb PO x-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. 2 Fe2+ +H2O2 + 2H+ 2 Fe 3+ +2 H2O Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on olulisene koht tööreaktiivil, mis sisaldab Gox, Pox, kaaliumheksatsüanoferraati (II) ja fosfaatpuhvrit pH 6. Tööreaktiiv oli valmistatud praktikumi juhendaja poolt. Tundmatu lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Minu uuritavaks lahuseks oli mesi, mida ma kaalusin analüütilisel kaalul kaaluklaasi 0,1199 g ning viisin selle kvantitatiivselt 200 ml mahuga mõõtekolbi. Selleks kuumutasin destilleeritud
standardlahusest kindla kontsentratsiooniga (0,25mg/ml), saadud lahjendatakse kaks korda ning teist lahust veel omakorda kaks korda. Pärast lahjenduste tegemist loksutatakse lahused korralikult läbi. 3. Värvusreaktsiooni labiviimine: Statiivi asetatakse 6 puhast ja kuiva katseklaasi ning nummerdatakse need. Proovid valmistatakse järgnevalt: Katseklaa Katseklaasi sisu millega on tegu? optiline tihedus s 1 1 ml dest vesi + 3ml tööreaktiiv kontrollproov 0,0690 D 2 1ml uuritav lahus + 3ml tööreaktiiv paraleelkatse 0,1222 D 3 1 ml uuritav lahus+ 3ml tööreaktiiv paraleelkatse 0,1156 D 4 1 ml 0,25 mg/ml glükoosilahus+ 3ml standardlahuse 0,2828 D tööreaktiiv lahjendus 3.3. Glükoosisisalduse ensümaatiline määramine Kaisa Rahuoja 093421 KATB41
bensidiini derivaadid (diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, 2-tolidiin e o-tolidiin jt) - O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine, detekteeritav lainepikkusel 630 nm Glükoosisisalduse määramisel ei tohiks bioloogilises objektis lihtsustuse mõttes olla märkimisväärselt värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat (II). 3.3.2. Töö käik TÖÖREAKTIIVI ETTEVALMISTAMINE: Tööreaktiiv peab sisaldama glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaaso (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraat (II) ja vajalikku kk-a loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Tööreaktiivi valmistamine: 1. Võta 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks vastav mõõtekolb 2. Vii sellesse 2,5 mg Gox-i 3. Lisa 1,5 mg Pox-i 4. Lisa 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH=6,0 5. Lisa K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust kolvi kuni vajaliku mahuni täitmiseni. 6
kaasneb H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3(Fe(CN)6) ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas happelises keskkonnas (pH=6). Töö käik Töö ülesanne Glükoosisalduse määramine mingis bioloogilises objektis (mesi, puuviljad jm), mis töö lihtsustamise eesmärgil ei sisalda palju värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse kaaliumheksatsüanoferraat(II). Tööreaktiiv Keskses rollis glükoosisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit, mille pH on 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil oli tööreaktiiv ette valmistatud. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks lahuseks, mille glükoosisisaldust määrasin, oli apelsinimahl
Õppejõud: Priit Eek, Kaia Kukk Tallinn 2013 Sisukord Sissejuhatus........................................................................................................... 3 Teoreetiline osa................................................................................................... 4 Töö käik.................................................................................................................. 5 Tööreaktiiv........................................................................................................ 5 Meloni lahuse ettevalmistamine.......................................................................5 Glükoosilahuste valmistamine..........................................................................5 Värvusreaktsiooni läbiviimine...........................................................................6 Katse andmed............................................
Reaktsiooni põhimõtteline skeem: Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] ehk kollane veresool. POx katalüüsib Fe 2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, tekib kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Töö käik: 1)Tööreaktiiv oli valmis tehtud. Tööreaktiiv: 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. 2)Uuritavaks lahuseks oli sidruni vesilahus, mille lahjendus oli 1/100. 3) Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel kasutasinstandardlahust, mis
Meetod võimaldab määrata glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul, sest GOx on substraadispetsiifiline ,D-glükoosi suhtes. GOx kujutab endast liitvalku, mis sisaldab FAD-i. Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist. Pox-i reaktsiooni on hõlbus jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise juures on olulisel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi osüdaasi ja peroksüdaasi, , kaaliumheksatsüanoferraati(II) ning fosfaatpuhvrit (pH=6,0). Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks käesolevas töös on mee lahus, mis valmistatakse kuuma destilleritud veega, et soodustada süsivesikute lahustumist. Analüütilistel kaaludel kaalutakse 0,1 kuni 0,2 g mett ja viiakse kadudeta 100 ml mõõtekolbi. Selleks
kaaliumheksatsüanoferraati(ll) K4[Fe(CN)6]. POx katalüüsib Fe oksüdatsiooni Fe3+-ks, 2+ millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi;
lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Peroksüdaas 2Fe2+ + H2O2 + 2H+ → 2Fe3+ + 2H2O Töö eesmärgiks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, antud juhul sidrunis. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraati(ll). TÖÖ KÄIK Tööreaktiiv Antud töös on kasutusel 25 ml-ne tööreaktiiv, mis sisaldab glükoosi oksüdaasi (GOx) (2,5 mg) ja peroksüdaasi (POx) (1,5 mg), reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit (pH=6,0) (16,6 ml) ja kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) (lisatakse kuni lõppmahuni). Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Tööreaktiiv säilitatakse külmkapi temperatuuril. Uuritava lahuse ettevalmistamine
kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasneb vesinikperoksiidi redutseerumine veeks. Tekib kaaliumheksatsüanoferraat (III) (see on punane veresool), mis annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Minu konkreetne tööülesanne oli glükoosisisalduse määramine sidrunimahlas, POx substraadina kasutasime kaaliumheksatsüanoferraati (II). Töö käik Tööreaktiiv Tööreaktiiv sisaldas 2,5 mg GOx, 1,5 mg POx, 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 ning ülejäänud 0,1% kaaliumheksatsüanoferraati (II), et täita 25 ml mõõtekolb. Mina töötasin juba ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Minu uuritavaks prooviks oli sidrunimahl. Pigistasin sidrunist välja väikese koguse mahla, juhendajalt sain juhised lahuse lahjendusmäära osas: tuli võtta 1ml sidrunimahla 25 ml lahuse jaoks.
POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 reedutseerimine H2O-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6], ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH=6 juures. Peroksüdaas 2+ 2 Fe + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik: Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme GOx ja POx, kromogeenset substraadi K4[Fe(CN)6] ja fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötan ettevalmistatud reaktiiviga. Uuritava lahuse ettevalmistamine Tundmatuks prooviks on naturaalne apelsiinimahl. Pressin apelsiinist umbes 5 ml mahla, mida pärast vajalikul määral lahjendan. (1/200 ml).
kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Peroksüdaas Taandatud substraat + H2O2 Oksüdeeritud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaas 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis. Tööreaktiiv: Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi;
veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures. Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(II). Katse käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles tuli määrata glükoosi kontsentratsioon,
· Katseklaasi o Nr 1 pipeteeriti 1ml destileeritud vett o Nr 2 ja 3 pipeteeriti 1ml uuritavat lahust o Nr 4,5 ja 6 pipeteeri igasse 1ml erineva konsentratsiooniga glükoosilahust. · Igasse katseklaasi pipeteeriti 3ml eelnevalt valmistatud tööreaktiivi* ja loksutati · Katseklaase hoiti 20 minutit toatemperatuuril · Spetrofotomeertia põhimõttel mõõdeti optilised tihedused katseklaasides *Õppejõu poolt valmistatud 25ml tööreaktiiv koosnes: · 2,5mg glükoosi oksüdaasi · 1,5mg peroksüdaasi · 16,6ml 0,2M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust, millega täideti kolb kuni lõppmahuni. Optilised tihedused Korrigeeritud optilised tihedused 1. 0,048 1. 0 2. 0,059 2. 0,011 3. 0,060 3. 0,012 4
3+¿+ 2 H 2 O ¿ +¿ Peroksüdaas 2 Fe → 2+¿+ H 2 O 2+ 2 H ¿ ¿ 2 Fe Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad või muu taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös. Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on kesksel kohal tööreaktiiv, mis sisaldab ensüüme POx ja GOx, kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Töötasin ettevalmistatud tööreaktiiviga. 25 ml tööreaktiivi koosnes: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi 1,5 mg peroksüdaasi 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit pH=6
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Kasutatavad ained 3 viinamarja mahl, tööreaktiiv: Glükoosi oksüdaas(GOD), peroksüdaas(POD), K4[Fe(CN)6] 0,1 % vesilahus, 0,1 M Fosfaatpuhvrit ph 6. Kemism Glükoosi lahusele lisati tööreaktiivi, kus sisalduv GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GODis sisalduv flaviinadeniindinukleotiid abil oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja vesinikperoksiidiks. Edasi katalüüsib POD kromogeense substraadi kollase veresoola oksüdeerumist. PODi toimel oksüdeerub kollases vere soolas
Üheks võimaliseks on o-taoliin, misse helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Oma töös ma kasutasin substraadina kaaliumheksotsüanoferraati(II) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib Fe2+ Fe3+-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik Tööreaktiiv 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; 1,5 mg peroksüdaasi; 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Sidrunimahl Mul oli sidrunimahl lahjendatud 1:50 1 ml mahla + 49 ml dest.vett Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks
POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Võib kasutada ka kaaliumheksatsüanoferraati(II), mis oksüdeerudes annab lahusele kollase värvuse (Fe2+Fe3+) ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Eelnevalt valmistatakse tööreaktiiv (25 ml): · 2,5 mg glükoosi oksüdaasi · 1,5 mg peroksüdaasi · 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH 6,0 · K4[Fe(CN)6] 0,1% lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni Uuritava lahuse ettevalmistamine · Prooviks kasutatakse pressitud apelsinimahla · Lahuseks võetakse 0,5 ml mahla, pipeteeritakse see 200ml mõõtekolbi ja täidetakse jooneni destilleeritud veega (400x lahjendus). · Mahlalahusest eemaldatakse filtrimise teel viljaliha
näiteks diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, samuti 2-tolidiin jt. Antud töös kasutatakse substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) (K 4[Fe(CN)6]) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib raud(II) raud(III)-ks ja vesinikperoksiid redutseerub veeks. Kaaliumheksatsüanoferraat(III) (K3[Fe(CN)6]) ehk punane veresool anna lahusele kollase värvuse, mis on dekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Tööreaktiiv on eelnevalt juba valmis tehtud, seega alustan tööd uuritava lahuse ettevalmistamisest. Kuna minu valitud uuritav aine on õunamahl, siis juhendaja näpunäidete järgi teen sellest 100-kordse lahjenduse. Selleks võtan 1 ml mahla ja pipeteerin selle 100 ml mõõtkolbi ning kolvi destilleeritud veega kuni märgini. Segan lahuse korralikult läbi. Et glükoosi kontsentratsiooni proovis kindlaks teha, tuleb koostada kaliibrimisgraafik
2 Fe + H2O2 + 2 H 2 Fe3+ + 2 H2O Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(ll). 87 Töö käik Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga
annaabi.ee 
