TTÜ keemiainstituut Analüütilise keemia õppetool YKA0040 Lahutusmeetodid keemias Laboratoorne töö: Kapillaarelektroforees CE Õpperühm: Teostaja: Ilona Juhanson YASM11 Õppejõud: Tiina Teostati: 30.10.15 Aid Teooria Kapillaarelektroforees on lahutusmeetod, kus uuritavad ained lahutatakse elektroforeetiliselt kapillaarkolonnis. Elektroforeetiline lahutamine saavutatakse seetõttu, et lahustunud ained liiguvad elektriväljas erineva kiirusega, sõltuvalt nende massi-laengu suhtest ning rakendatavast pingest. Suurema laenguga ja väiksema läbimõõduga osakesed liiguvad kiiremini kui suurema läbimõõdu ja/või väiksema laenguga osakesed. Aparatuur
Valgusallik as Ergastus monokromaator Emisiooni monokrom detekto r Fluoresentsi inensiivsus sõltub: lahuse polaarsusest, pH-st, temperatuurist (kuumad lahused ei fluoretseeru ning liiga madalal temperatuuril väheneb fluoretsentsi intensiivsus. Parim temperatuur on enamasti toatemperatuur.), ühendist endast (kui jäik ühend on). Kapillaarelektroforees: on elektriliselt laetud (ioonsete) osakeste lahutamise meetod. KE printsiip: kapillaari seinad on negatiivse laenguga tänu silanoolrühmade dissotsiooni tõttu. Dissotseerunud prootonid moodustavad kapillaari sisepinnale difuuse kihi. Elektrivälja mõjul hakkavad anioonid liikuma katoodi poole, mistõttu hakkab liikuma kogu elektrolüüdi lahus- seda nimetatakse elektroosmootseks vooks (EOF). EOFi tingimus on, et pH oleks suurem kolmest.
A Research Journal of Toxins ebscohost 2009 to present B Environmental Science and springer.com 116 issues, 2661 Pollution Research articles, 1994 to present C The Open Environmental Directory of Open 2009 to present Pollution & Toxicology Journal Access Journals 1.4 Artikkel märksõnaga kapillaarelektroforees Eestikeelseid artikleid leidsin nii palju (4 kirjet): Ilona Juhanson, 123964YASB
fluorestsentsdetektoreid proovide puhul, mis kas ise fluorestseeruvad või sisaldavad fluorestsentseid markereid (valkude ja DNA puhul, nt), mis puhul mõõdetakse neelduvuse asemel kiirgumist. Massispektromeetried kasutatakse samuti, mispuhul kapillaarist väljuvad ained juhitakse ioonisatsiooniallikasse, mis kasutab ESI-ionisatsiooni. SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy). - - - Töövahendid: Hitachi spektrofluorimeeter F-7000 Kapillaarelektroforees LED-detektoriga Eri sorti kanepitaimede leotised Analüüdid ekstraktides: THC, CBD, klorofüll jm taimsed polüfenoolid THC standard – 10 ppm CBD standard – 10 ppm MilliQ vesi Etanool - - Töökäik: - Lülitada sisse arvuti, spektrofluorimeeter ja termostaat (tehti eelnevalt) - Käivitada proprgamm FL Solutions 2.1 for F-7000 arvutis (tehti eelnevalt) - Valida FL meetodis vastavad parameetrid (eelnevalt tehtud)
aine koguse elueerimiseks kolonnist Kromatograafia tüübid: Ioonvahetus kromatograafia: *Komponendid liiguvad piki kolonni, rohkem kinni peetud komponent asendab vähema. *Näiteks vee pehmendamine, ioonvahetuskolonniga; *ei saa komponente täielikult lahutada; *kolonni pikendamine ei mõju -Gaaskromatograafia: -Vedelikkromatograafia (LC): A on väga väike, B ja C on väikesed, sest vedelikes on difusioon palju väiksem kui gaasides. -Elektroforees:Meetodid: Paber-, geel-, kapillaarelektroforees Põhimõte: elektrivoolu toimel liiguvad ioonid, aminohapped või valgud läbi keskkonna (statsionaarse faasi) või läbi kapillaari. Selle protsessi käigus liiguvad ioonid erinevate kiirustega ja on eraldatavad. Kasutamine: DNA, RNA, ioonsed ühendid Põhimõisted kromatograafia: VR-retentsiooniruumala - liikuva faasi ruumala, mis on vajalik poole aine elueerimiseks kolonnist
elueerimiseks kolonnist Kromatograafia tüübid- Ioonvahetus kromatograafia: Komponendid liiguvad piki kolonni, rohkem kinni peetud komponent asendab vähema. Näiteks vee pehmendamine, ioonvahetuskolonniga; ei saa komponente täielikult lahutada; kolonni pikendamine ei mõju Gaaskromatograafia: Vedelikkromatograafia (LC): A on väga väike, B ja C on väikesed, sest vedelikes on difusioon palju väiksem kui gaasides. Elektroforees: Meetodid: Paber-, geel-, kapillaarelektroforees Põhimõte: elektrivoolu toimel liiguvad ioonid, aminohapped või valgud läbi keskkonna (statsionaarse faasi) või läbi kapillaari. Selle protsessi käigus liiguvad ioonid erinevate kiirustega ja on eraldatavad. Kasutamine: DNA, RNA, ioonsed ühendid Põhimõisted kromatograafias- VR-retentsiooniruumala - liikuva faasi ruumala, mis on vajalik poole aine elueerimiseks kolonnist
modulaatori (mehhaanilised klapid, sorptsioon/desorptsioon via temperatuur). Saadakse pikk ühemõõtmeline kromatogramm, organiseeritakse 2D pildiks. Kasutatakse keeruliste seguse analüüsiks. Esimese kolonni aeglahutus võrdub teise kolonni lahutusajaga. Rõhu ühikud Briti ja meetrilistes süsteemides 1 atm 760 mm Hg 1 at - 1 kg/cm^2 Pa=N/m^2 1 bar=0,987 atm=1,02 at=10^5 Pa=14,5 psi 1 pound=0,453 kg 1000 psi = 70 bar, 100 bar=1450 psi atm=psi/14,5 Elektroforeesi nähtus ja kapillaarelektroforees Laetud osakeste liikumine elektrivälja mõjul. Lahutumine põhineb erinevast massist ja laengust tingitud erinva kiirusega liikumisel, samuti ka rakendatavast pingest. Gaasides - ioonmobiilsus Ioone sisaldavale lahusele pinget rakendades hakkavad ioonid liikuma, katioonid (+) katoodile (-), anioonid (-) anoodile (+). Kapillaarelektroforeesil toimub ainete elektroforeetiline lahutamine kapillaarkolonnis. Elektroosmoosse voo tekkimine elektroforeesis
spontaanne mutatsioon ka geeni teises alleelis ning sellest rakust, milles on mutatsiooni tagajärjel geeni mõlemad alleelid defektsed, arenebki tuumor. 28. Alleelispetsiifiline PCR – kuidas kasutada mutatsiooni analüüsil? Praimeri 3’ ots on disainitud nii, et see seostuks täpselt mutatsiooni kohta. Kui ei seondu, ei ole mutatsiooni. 29. Kolm erinevat meetodit genoomis SNPde või mutatsioonide uurimiseks. Sekveneerimine, mikrokiipanalüüs, kapillaarelektroforees 30. Millest sõltub ravimi toime organismis? Tooge näiteid? Ravimi toime organismile sõltub ravimi omadustest, aga ka organismi seisundist, individuaalsest tundlikkusest, indiviidi vanusest, metabolismist ja imendumisest. Nt vanuritele puhul on organismi kui terviku reaktsioon ravimite toimele on tõusnud, taluvus on langenud ning ravimite kõrvaltoime avaldub sagedamini ja intensiivsemalt. Osadel inimestel on ravimi metabolism kiirem ning see elimineerub kiiresti. 31
dispersioonikeskkonna vahel ning jälgitakse selle piirpinna liikumist elektriväljas. Nende kahe meetoditega saab määrata tseeta-potentsiaali väärtust. 3) Tsoonelektroforees - sarnane liikuva pinna elektroforeesiga, kuid kasutatakse inertset tahket kandjat või geeli. Selle meetodiga ei saa määrata osakeste elektroforeetilist liikuvust, kuid on võimalik segusid hästi komponentideks lahutada. 4) Kapillaarelektroforees - samuti kasutusel analüütilistel eesmärkidel. Tzeeta-potentsiaal ehk elektrokineetiline potentsiaal - potentsiaal liikuva ja seisva kihi vahelisel piirpinnal. Tseeta-potentsiaal määrab elektrokineetiliste nähtuste intensiivsuse ning on oluline näiataja ka kolloidlahuste püsivuse määramisel. Lisaks osakese laengule, sõltub ka difuusse kihi paksusest, seega elektrolüütide kontsentratsioonist ja temperatuurist.
-Alleelide numbrid võimaldavad andmete digitaalset säilitamist -Alleelsed redelid lihtsustavad interpreteerimist -PCR võimaldab kasutada väga väikeseid STR and SNP markerite võrdlus: Esinemine inimgenoomis: -STR: ~1 iga 15 kb kohta -SNP: ~1 iga 1 kb kohta Markeri tüüp: -STR: di-, tri-, tetranukleotiid kordusmarkerid -SNP: bialleelsed markerid Alleelide arv markeri kohta: -STR: tüüpiliselt >5 -SNP: tüüpiliselt 2 Detekteerimismeetod: -STR: geel/kapillaarelektroforees -SNP: sekveneerimine; mikrokiipanalüüs Multipleksi võimalus : -STR: >10 markerit mitme fluores. värviga -SNP: Potentsiaalselt 1000 SNPs kiibil 3.STR markerite iseloomustus (korduste tüübid, alleelide tähistamine, alleelide eristamine). Lühikesed kordusjärjestused (Short Tandem Repeats - STR) Proovides varieerub korduste arv (korduspiirkond), kordustega külgnev ala (PCR praimerite seondumise ala) on konstantne Homosügoot = mõlemad alleelid on sama pikkusega
polymorphisms) Esinemine inimgenoomis ~1 iga 15kb kohta ~1 iga 1kb kohta Üldine informatiivsus Kõrge Madal Markeri tüüp di-, tri-, tetranukleotiid, Bialleelsed markerid kordusmarkerid Alleelide arv markeri kohta Tüüpiliselt >5 Tüüpiliselt 2 Detekteerimismeetod geel/kapillaarelektroforees Sekveneerimine, mikrokiip Multipleksi võimalus >10 markerit mitme Potentsiaalselt 1000 SNPd fluorestseeruva värviga kiibil 3. STR markerite iseloomustus (korduste tüübid, alleelide tähistamine, alleelide eristamine). · Dinukleotiid · Trinukleotiid · Tetranukleotiid · Pentanukleotiid · Heksanukleotiid Alleele eristatakse pikkuse alusel ehk mõõdetakse DNA juppide pikkusi
annaabi.ee 
