TTÜ Keemia ja biotehnoloogia instituut Analüütilise keemia õppetool YKA3411 Instrumentaalanalüüs FLU Fluorestsents spektroskoopia Õpperühm: Töö teostaja: Õppejõud: Töö teostatud: Töö kaitstud: Eesmärgid/ töö osad: 1. Dest. vee ja standardainete EEM (ergastus-emissiooni maatriksi) spektrite mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine; 2. Uurimine, kas aine fluorestsents sõltub keskkonna pH-st; 3. Vitamiinivee EEM spektri mõõtmine ja iseloomustamine, interpreteerimine; 4. Fluorestsentsi kustutamine vitamiinivee ja joodi näitel; 5. Fluorestsentsi tekitamine aluselises keskkonnas tiamiini ja punase veresoola näitel; 6. Kvantitatiivne (,,sõrmejälje") analüüs EEM spektrit kasutades. Kasutatav aparatuur
spektrite mõõtmine ja iseloomustamine Töö käik: 1) Pesta küvett dest. veega. Pipeteerida küvetti ca 1 ml järgmiseid aineid: o Destilleeritud vesi o Riboflaviin o Puridoksiin 2) Asetada küvett ainega masinasse. Valida programmis „Measurements“ , anda spektrile nime ja vajutada START. Salvestada andmed. Aine Konts, Ergastus, Emissioon, Intensiivsus mg/ml nm nm (max) 1. Destilleeritud vesi - 230 250 240,5 2. Riboflaviin 0,025 370,0 525,0 2579,0 3. Puridoksiin 0,022 325,0 390,0 4422,1 Tulemuste kirjeldus ja analüüs: Vesi ei fluorestseeru, EEM spektri maksimum on tingitud Ramani hajumisest.
Kirjeldage karotinoidide molekuli üldist struktuuri Karotenoidid on terpeensed ühendid. Koosnevad viiest isopreenijäägist. Konjugeeritud resonants sidemed. Mille poolest erinevad klorofülli molekuli singletne ja tripletne ergastusseisund? Eristatakse molekulide kahte tüüpi ergastuolekut singletset ja tripletset. Singletses seisundis jääb ergastatud elektroni spinn vastupidiseks põhiorbitaalile jäänud elektroni spinnile. T- ergastusolekus on ergastus- ja põhiorbitaalil olevate elektronide spinnid ühesuunalised. See asjaolu teeb T-ergastusseisundi eluea pikemaks kuna elektroni minekuks põhiorbitaalile peab toimuma spinni pööre. Nimetage kolm võimalust neeldunud kvandi energia liikumiseks klorofülli molekulis Ergastus kasutatakse laengute lahutamiseks toimub fotokeemiline reaktsioon Ergastus kiirgub välja fluorestsentsina Ergastusenergia muutub soojuseks 1)Võib moodustuda üks ergastus üle kogu süsteemi
Kui palju?) 2. Elektromagnetilise kiirguse korpuskulaar-laineliseks dualism Elektromagnetilist kiirgust (nt nähtavat valgust) saab vaadelda nii laine kui ka osakesena. 3. Elektromagnetlainete interferents ja difraktsioon Interferents - kaks kiirgusvoogu võivad üksteist kustutada või võimendada. Difraktsioon - kiirgus ei levi sirgjooneliselt vaid “paindub nurga taha”. 4. Energiaolekud ja üleminekute tingimus Energiaolekute üleminekutega kaasneb energia neeldumine (ergastus) või emissioon (relaksatsioon). Üleminekud toimuvad ainult siis, kui neelduv või emiteeritav energiahulk vastab täpselt energianivoode vahele. E1-E0 või E2-E0 5. Elektromagnetiline spekter 6. Neeldumise ja emissiooni spektrite seos Neeldumise ja emissionni spektrid on seotud nii, et nad esinevad samadel lainepikkustel. Neeldumine esined kui me külmutame gaasi ning ta hakkab valgust absorbeerima. Emissioon toimub kui me kuumutame gaasi ja ta hakkab valgust kiirgama. 7
Kõige tugevamaks retseptorite mõjutajaks on kemikaalid. Kuulmismeele puhul siis võnkuvad õhumolekulid. Retseptoreid mõjutavad väga lärmakas keskkond, geneetiline soodumus, ja tubakatooted. Lihasmeele puhul siis stiimuliks oli lihaste venituse ja lõdvestumise signaalid, mis tulevad seestpoolt, ajust. Kompimismeele puhul siis retseptorid naha all ja reageerivad stiimulitele, mis füüsiliselt tekitatavad, nt. vajutus naha pinnale mingi esemega. Nägemismeele puhul ergastus toimub siis piisava valguse olemasolule. Tasakaalumeele puhul on otsene seos gravitatsiooniga. Peaasendi muutustest saadava info põhjal toimub suhestumine ja toimetulek keskkonnaga. Maitsemeele puhul siis stiimuliteks on erinevad maitsemolekulid.
Leek- aatomabsorbtsioonspekroskoopia instrument Instrumendi funktsioonid 1* proovi transport leeki 2* spektraalüleminekute indutseerimine 3* vajaliku spektrijoone isoleerimine 4* kiirguse kasvu/kahanemise detekteerimine 5* tulemuse esitamine Leek peab võimaldama atomiseerimist ja ei tohi aatomeid ioniseerida. Leekatomisaator koosneb udustist ja põletuskambrist. Proov juhitakse pihustatuna läbi leegi, toimub ergastus. Küttegaasid juhitakse segamiskambrisse ja imetakse läbi kapillaari segistisse ka analüüsitav lahus, kus see pihustub. Leegis kõrgel temperatuuril lahus aurustub ja atomiseerub. Kiirgusallikaks on õõneskatoodlamp, kuhu on monteeritud anood ja määratavast metallist või selle sulamist valmistatud katood. Lamp on täidetud madalal rõhul oleva inertsgaasiga ning selle kütmisel pingeallikast katoodi aine aurustub, atomiseerub ja ergastub, andes antud elemendile iseloomuliku valgusspektri
y a sin(t ) Kvandi energia, sagedus ja lainepikkus, kiirguse vôimsus: sagedus on ajühikus fikseeritud punkti labinud lainepikkuste arv hc 1 E h ; P h h 6 .62 10 34 Js c 3 .00 10 8 m / s Elektromagnetilise kiirguse spekter Ergastus Sisekihi Valentsele Võnkumised Pöörlemised Tuumade molek elektroni ktron spinnid ulis d id Nimetus gamma X-kiirgus UV-vis infrapunane mikrolained raadiolained Lainepikkus 10-13...10-11 10-11...10-8 10-8...10-6 10-6...10-4 10-4...10-1 10-1...101 [m] Aatomite energianivood Kvantarvud
Interferentsiks nimetatakse lainete liitumist, mille tulemusena mõnes kohas lained muutuvad suuremaks ehk amplituud saab suuremaks kui ühe liituva laine amplituud, teises kohas väiksemaks ehk amplituud väheneb. 3. Energiaolekud ja üleminekute tingimus Aatomid, ioonid ja molekulid eksisteerivad ainult teatud diskreetsetes energiaolekutes ja üleminek energiaolekute vahel on võimalik ainult hüppeliselt. Energiaolekute üleminekutega kaasneb energia neeldumine ehk ergastus või emissioon ehk relaksatsioon. Üleminekud toimuvad ainult siis, kui neelduv või emiteeritav energiahulk vastab täpselt energiavoode vahele. 4. Elektromagnetiline spekter Hõlmab erinevate energiatega elektromagnetlaineid alates kõige madalamatest sagedustest kuni gammakiirguseni. Spekter jaguneb sagedusaladeks ja iga sagedusala sees kitsamateks aladeks. Väga kõrgetel sagedustel käitub elektromagnetlaine footonite voona. Liigitatakse elektromagnetlaine sageduse järgi. 5
selleks, et hinnata näiteks kivimite läbilaskvust süsivesinike suhtes. MRT-s on kõik koed, ka pehmemad selgesti eristatavad. Kõigepealt tekib magnetresonantstomograafi magneti tekitatud tugevas püsimagnetväljas koe molekulide aatomituumade spinnide orintatsioonide tasakaaluolek. Siis rakendatakse püsimagnetväljaga risti olevas tasandis raadiosagedusega impulsse, mis muudavad osa vesinikutuumade spinnide orientatsiooni ja toimub nn ergastus. Siis lõpetatakse ergastusimpulsside andmine ja tuumad relakseeruvad tagasi algsesse tasakaalulisse olekusse, mille käigus kiirgavad nad aga raadiosagedusliku energiat, mida võtavad vastu patsiendi ümber mähitud poolid. Need signaalid registreeritakse ning andmeid töötleb arvuti, mis genereerib koe kujutise. Nõnda saab uuritavast koest detailse nähtava kujutise. Kliinilises praktikas kasutatakse MRT-d patoloogilise koe (näiteks ajukasvaja) eristamiseks normaalsest koest.
valus. 5. Samasusteooria(Place, Kas teadvus on ajuprotsess? Ja Smart, Aistingud ja ajuprotsessid) Materialism on valdav. Samasusteooria sai valdavaks lähenemiseks biheivorismi asemel. Väideti, et dualismi eksimus polnud mitte loogiline, vaid faktiline: juhtumisi on vaimuseisundid samad, mis ajuseisundid. Samasusteooria esitati empiirilise teesina: vaimuseisundis on identsed ajuseisunditega. Näiteks valu on c-kiudude ergastus. Smart oli seisukohal, et osalt on see empiiriline tees, aga mängivad rolli ka üldised lihtsuse kaalutlused. Erinevused teesi sõnastamisel. Place eristas: predikatsiooni „on“(tema müts on punane); definitsiooni „on“, paratamatu, tõene(punane on värvus); koostise „on“, juhtumisi tõene(tema laud on vana pakkekast) Place mõistad samasust koostise kaudu: vaimsed protsessid koosnevad ajuprotsessidest nagu vesi koosneb H2O’st
polaarsuse, lenduvuse muutmiseks või stabiliseerimiseks. Orgaanilses keemias kasutatakse sama võtet mingi rühma kaitsmiseks hilisemateks reaktsioonideks. Fluoresentsi kustutamine: Kui relaktseerumine toimub mingi teise molekuli mõju tõttu. Toimib tavaliselt näiteks O2 või raskemetallide juuresolekul. 3 Aparatuur: proov Valgusallik as Ergastus monokromaator Emisiooni monokrom detekto r Fluoresentsi inensiivsus sõltub: lahuse polaarsusest, pH-st, temperatuurist (kuumad lahused ei fluoretseeru ning liiga madalal temperatuuril väheneb fluoretsentsi intensiivsus. Parim temperatuur on enamasti toatemperatuur.), ühendist endast (kui jäik ühend on).
enamasti on kiiratava valgus pikemal lainepikkusel (madalama sagedusega, energiaga) kui neelatud valgus. Huvitav on olukord, mil neeldumine toimub UV-s ning emissioon toimub nähtava valguse piirkonnas. Erinevus fosforestsentsist seisneb selles, et kiirgusallika eemaldamisel ei kesta kiirgumine edasi. Absorptsioon on neeldumine st nähtus, kus süsteemile antavast energiast osa neeldub. Emissioon on nähtus, kus osa süsteemile antud, selles neeldunud energiast välja kiirgub. EEM – ergastus-emissiooni-maatriks Ramani hajumine on iseloomulik veele (energia neeldub vees), 250 ja 400 nm vahel. Toimub natuke madalam Stokes-i nihe. Põhjus, miks saab määrata kvantitatiivselt – intensiivsuse alusel koostatakse kalibratsiooni graafik ja sealt on võimalik määramispiiride abil saada kogus. Iseloomulik lahustele ning kasutatakse Ramani spektroskoopias, millega saab sarnaselt IR-spektroskoopiale määrata molekuli kuju.
Tülakoidide membraanis, sisaldavad 2 Chla/karotenoidi molekuli/(e) , footon põhjustab elektroni tõusmist kõrgemale energiatasemele, reaktsioonid sõltuvad valgusest. 11. Kuidas toimub fotosüsteemi antennis neeldunud kvantide energia liikumine reaktsioonitsentrisse Antennideks on pigmendid, mis koguvad valgust ja kannavad selle energia üle reaktsioonitsentrile. Kombineeruvad 2 mehhanismi: 1. LHC-s on klorofüllid lähestikku moodustub 1 ergastus üle kogu süsteemi 2. Fösteri resonantsmehhanism ühe molekuli ergastus võib kustudes üle minna teise molekuli ergastuseks lainefunktsioonide ülekattumise tõttu. 12. Kirjeldage valgust neelava kompleksi (LHC) ehitust Chl ja karotenoidid moodustavad valkudega kompleksi, mis määrab kindlaks pigmendimolekulide orientatsiooni ja vahekauguse, mis on oluline ergastusenergia efektiivseks ülekandeks. Moodustavad trimeere (on valk-pigment kompleksid). 13
ehk elektron liigub mõlemas Psis sarnase raja. Sarnasuseks on veel see, et 12 H + sünteesitakse 3 ATP molekuli. Mõlemal on tsentraalpigmendiks klorofüll a, toimub elektronide ergastamine, mõlema neelavad punast valgust. 17. Kuidas toimub fotosüsteemi antennis neeldunud kvantide energia liikumine reaktsioonitsentrisse Kokku kujuneb iga tsentri ümber umbes 200 Chl-st koosnev antennisüsteem, mis kõik neelavad valgust. Ergastus liigub suunatult madalama energiatasemega Chl suunas kui antennisüsteemis on erineva spektriga Chl-d organiseeritult asetatud. Näiteks, taimede PSII perifeerselt asetsevates valgustpüüdvates trimeerkompleksides on rohkesti lühemalainelist Chl b d , samal ajal kui tsentrit ümbritsevates CP43 ja CP47 valkudes on peamiselt pikemalaineline Chl a. Vastavalt liigubki eksiton LHCII-st kiiresti CP43-47 alasse. Tsentriklorofüll P680 on aga praktiliselt
1. Analüütilise instrumendi struktuur. Defineerige analüütilise instrumendi dünaamiline diapasoon:, detekteerimispiir ja instrumendi tundlikkus. Analüütilise instrumendi skeem: Ergastus Proov Detektor allikas energia energia Ergastusallikas genereerib energiavoo, mis astub prooviga vastasmõjusse (valgus, soojus, pinge jms). detektor teisendab proovi keemilise reaktsiooni energiavoole elektriliseks signaaliks, mille suurus on proportsionaalne aatomite/molekulide arguga ja mille kuju sõltub sageli aatomite/molekulide loomusest
· negatiivne laeng q = 1,6021892 ·10-19 C (kulonit) Prootoni ja neutroni seisumassid = 1837 m0 Liikuva osakese mass suureneb (märgatav alates potentsiaalist: elektronidel 10 kV, ioonidel 1 MV): Osakeste energia saab muutuda diskreetselt kvantide kaupa: , kus: - on kvanti iseloomustava elektromagnetiliste võnkumiste sagedus, 1/s h on Plancki konstant: h = 6,6 10-34 J s Aatomi ergastatud olek kestab 10-8 10-10 s Mitmekordne ja astmeline ergastus. Metastabiilne ergastus kestab 10-2 s. Metastabiilne orbiit suurima energiaga orbiit normaalne orbiit Ioniseerimene elektroni ja aatomituuma vahelise sideme katkemine Ionisatsioonienergia Wi Ionisatsioonipotentsiaal Ui 6. Mahuionisatsiooni liigid · põrkeionisatsioon Wi (valemis on ladina "vee") · fotoionisatsioon (valemis on kreeka "nüü") kus h on Plancki konstant: · termiline ionisatsioon (T = 3700 - 16000°C, 1 100 keV) 1
Sellel meetodil saab tulemust arvutada juhul, kui proovi konts on enamvähem teada ja on võimalik teha uuritavale proovile lähedase konts-ga stand.lahus (intensiivsused ei tohi erineda rohkem kui 2,5 korda). Vastasel juhul tuleb mõõta mitme stand.lahuse fluorestsents ja saadud tulemuste alusel arvutada välja klassikaline kalibratsioonigraafik. Saab teha ka mitme ainete sisaldava segu fluorestseerumine, isegi juhul, kui kõik ained fluorestseeruvad. On võimalik valida selline ergastus/emissioonilainepikkuse kombinatsioon või kkonna tingimused (pH), et fluorestseeruks ainult vajalk aine 1.6 AATOMABSORPTSIOONSPEKTROFOTOMEETRIA. See on meetod, kus uuritava elemendi aatomid neelavad neile spetsiifilist valguskiirgust. Antud meetod sobib elementanalüüsiks. Antud juhul ei saa me määrata molekule. Registreerib seda, kuidas aatomid kiirgust neelavad või kiirgavad. Kõige primitiivsem aatomspektrofotomeetria on näiteks Na, K määramine, kus mõõtelemendiks on oma silm
Inimese silm- 1cm-0,5mm Valgusmikroskoop- 1,2 mm-50nm (kuni viiruse ribosoom) Elektron- 1,2mm-0,1nm (kuni aatom) Valgusmikroskoobi põhilised koostisosad. Halogeen lamo,kondensor lääts, objektiivi lääts, peegeldav prisma, okulaarid Faaskontrastmikroskoobi töö põhimõte. Valguslaine faas muutub kui valgus läbib elusa raku Mikrotoomi töö põhimõte. Fluorestsentsmikroskoobi töö põhimõte. Fluorestseeruvate värvide ergastus ja emissiooni lainepikkuste erinevus. Elavhõbeda lamp ergastab kiirguse Ergastuse lainepikkus on alati kõrgem kui emissiooni lainepikkus Tsütoloogias kasutatavad värvid hematoksüliin, eosiin ja trüpaansinine. Fluorestseeruvad värvid propiidiumjodiid ja etiidiumbromiid. Hematoksüliin(happeline piirkond DNA, RNA), eosiin (aluseline- tsütoplasma), trüptaansinine- happeline värv,läbib surnud rakkude kahjustunud plasmamebranne javärvib tsütoplasma valke
vabastamise metastabiilselt nivoolt. Laseri leiutasid Nikolai Bassov, Aleksander Prohhorov ja Charles Townes 1950-te lõpus ja sais selle eest 1964.a. Nobeli füüsikapreemia. Tänapäeval on olemas nii impulsslasereid kui pidevas reziimis töötavaid lasereid. Aktiivaineks kasutatakse nii gaase, vedelikke kui tahkiseid. Kasutatakse ka 4 nivoolist süsteemi. Selle eeliseks on, et alumine laserkiirguse nivoo tühjeneb kogu aeg ja täidab põhinivood, kust toimub ergastus (ergastus ja kiirgus on selgelt eristatud) 11.6.4. Röntgenikiirgus Röntgenikiirguseks nimetatakse elektromagnetilist kiirgust, mille lainepikkus on vahemikus 10-2 nm .....10 nm. Sellise kiirguse avastas 1895.a. saksa füüsik Wilhelm Röntgen, kes sai selle eest esimesena Nobeli füüsikapreemia (1901.a.). Röntgenikiirgust saadakse röntgenitoru abil. Röntgenkiirguse kiirgusspekter koosneb pidevast foonist ja joontest.
See auk võib saada vabaks tema täitumisel elektroniga naaberaatomitelt (joon. 7.25b). Liikuv auk annab lisaenergia-nivoo keelatud tsoonis (joon. 7.26) ja võib osa võtta elektrijuhtivusest analoogselt doonorelektroniga. Ergastusel elektron valentstsoonist (naaberaatomilt) läheb sinna lisandelektronnivoole (joon. 7.26). Tulemusena tekib üks vaba laengukandja valentstsoonis - auk. Samaaegselt vaba elektroni teket juhtivustsoonis ei toimu, sest ergastus toimub valentstsooni ja üksiku nivoo vahel. Sellist tüüpi lisandit nimetatakse aktseptorlisandiks, sest ta võtab (accept - vastu võtma) elektrone valentstsoonist jättes järele augu. Energianivoo keelatud tsoonis kannab aktseptornivoo nime. Aktseptorlisandi puhul p >> n ja materjali nimetatakse p-tüüpi pooljuhiks. p-tüüpi pooljuhis on augud põhimisteks laengukandjateks ja elektronid mittepõhilisteks laengukandjateks. Elektrijuhtivus avaldub kujul = p / e / µ p (joon. 7.12)
Eeliseks on see, et kui teame mingi aine ekstensioonikoefitsienti (kirjandusest jne), siis saab laboris kasutada. Fluoromeetria exOem neelates valguskvanti ühel lainepikkuse, molekul ergastub, jõuab kõrgema energiaga nivoole, sest sai kvandienergia juurde. Kõik, mis neelavad, need ei fluorestseeru. Fluorestsents on erijuht, kus osa energiast antakse tagasi valguskvandina, osa läheb aga soojuseks (osa energiast läheb kaduma seega). ex väiksem kui em, ex on ergastus, em on emissioon. Ergastuslainepikkus on alati madalam emissioonilainepikkus. Mida väiksem lainepikkus, seda kõrgem on energia". Eeliseks on see, et me mõõdame täisnurga all fluorestsentsi fluoromeetria puhul me mõõdame väikest muutust pimedal taustal, tausta pm pole. Emissioonivalgus läheb igasse suunda, mõnel küvetil on peeglid, mis võimendavad signaali. Fluorestsents on seda tugevam, mida suurem on ekstinktsioonikoefitsient ja kvantsaagis
poolt seotud florokroomi hulgaga. Need antikehad, mis on seotud värvainega, seostuvad vastavate retseptoritega (CD-d), ja laserid aktiveerivad seda värvainet, ja selle püüab optiline osa kinni. Sellest tulebki tulemus. Florestsents signaalid filtreeritakse valgusfiltritega. Iga signaal jõuab seega oma detektori juurde. Mõned tuntumad florokloorid – sinine laser – 488 nm lainepikkus. Molekulid erinevad üksteisest nii ergastus kui emissiooni spektri poolest. Sellega peavad kasutatavad florokroomid olema ergastatavad vastava laseri valguse lainepikkuse poolt. Ühel osakesel saab määrata – suurus, granulaarsus, nelja erinevat florestsentsi. Detektor genereerib elektrilise impulsi, mis on proportsionaalne valgussignaali tugevusega. Analoogdigitaal konverter ja salvestaja. Üheks võimaluseks on näidata tulemusi sageduste jaotuse e. histogrammiga. Ühel teljel rakkude arv, teisel
Verest kaob toimeaine suhteliselt kiiresti, kuid see ladestub kudedesse, eraldudes kuni 30 päeva jooksul pärast tarbimist uriini ja väljaheitega. Sõltuvus: psüühiline. Pärast rohket aine tarbimist tekivad kainenemisel jõuetus, teotahte puudus, keskendumishäired, rahutus. Subjektiivseid sümptomeid raskendavad unehäired ja isutus. Akuutsed sümptomid Kanep süvendab selle tarbija valitsevat meeleolu. Enamasti meeleolu tõuseb. Uimastit tarbinu on lõõgastunud, tema füüsiline ergastus väheneb (passiivsus). Kommunikatiivsus küll suureneb, aga sellele vastukaaluks tekivad mõtlemishäired: vähenevad nii keskendumisvõime, tähelepanelikkus kui ka lühimälu. Tähelepanu on kergesti kõrvalejuhitav, mõte on keskendunud kõrvalistele tajudele ja assotsiatiivsetele mõttekäikudele. Vererõhk ja südame löögisagedus on kergelt tõusnud, enamasti tekivad bradükardia, silmade punetus, laienenud pupillid ja suurenenud
annaabi.ee 
