reaktsiooni. Hüdrolüüsisegust võetud taandavaid suhkruid sisaldava proovi keetmisel komplekslahusega taandub kompleksis sisalduv Cu(II) Cu(I)-ks ja moodustab Cu2O. See eraldub punase sademena ja lahusesse jääb vaba triloon B. Triloon B tiitritakse 0,02M vasksulfaadi lahusega (indikaatorina mureksiidi vesilahus). Invertaasi aktiivsus määratakse mikrokatalites 1 ml ensüümilahuse kohta. Antud katses kasutatakse invertaasi asemel vedelat invertiini. Töö käik: Suurde katseklaasi (50 ml katseklaas) pipteerisin sahharoosi hüdrolüüsiks 25 ml 7%-list sahharoosi lahust, mille pH on atsetaatpuhvi abil reguleeritud väärtusele 4,8. Lahus asetasin vesitermostaati 30°C juurde soojenema umbes 5 10 minutiks. Kolme 250 ml koonilisse kolbi pipeteerisin 10 ml komplekslahust. Invertaasi asemel kasutasin vedelat invertiini. Valmistasin invertiini 20 kordse lahjenduse. Selleks pipeteerisin katseklaasi 0,5 ml
määratakse tiitrimise teel kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrides tekib uuesti Cu(II) kompleks, määratakse lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1ml ensüümilahuse kohta. Töö käik · Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine o invertiini lahust võetalse 0,4ml o invertiini lahjendatakse 25x (kokku lahust 10ml) o lahustiks kasutatakse atsetaatpuhvrit pH 4,8 · Ensüümireaktsiooni läbiviimine o 50ml katseklaasi pipeteeritakse 25ml substraati (7% sahharoos atsetaatpuhvris) o katseklaas varustatakse korgiga o katseklaas 10 minutiks vesitermostaati 30 kraadi juurde soojenema o võetakse 3 250ml koonilist kolbi, kuhu pipeteeritakse 10ml komplekslahust
pH=4,8) 6. Varustan katseklaasi korgiga ja asetan 5-10 minutiks vesitermostaati 30±1 °C juurde soojenema 1. Võtan kolm 250 ml mahuga koonilist kolbi. 2. Pipeteerin neisse 10 ml komplekslahust. 3. Kui substraat on termostaadis saavutanud temberatuuri 30 °C (umbes 5-10 minuti pärast), lisan sellele 0,5 ml invertiini töölahust. Loksutan lahuse kiirelt läbi, võtan automaatpipettiga 1 ml lahust ja viin kolbi A. Käivitan stopperi. Asetan katseklaasi kiiresti tagasi termostaati. 4. Viin kolbidesse reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et määrata neis taandavate suhkrute sisaldus. C-proov: 20 minutit
lahust (substraati), mille pH oli atsetaatpuhvri abil reguleeritud sobivale väärtusele. Lahus asetati termostaati 30oC juures soojenema kümneks minutiks. Valmistati ette kolvid taandavate suhkrute sisalduse määramiseks. Selleks pipeteeriti kolme koonilisse kolbi mahuga 250 ml ~10 ml komplekslahust. 30oC termostateeritud sahharoosi lahusele lisati 0,5 ml eelnevalt valmistatud uuritava invertaasi invertiini lahust. Loksutati ja fikseeriti ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi. Kuiva pipetiga võeti kohe pärast ensüümi lisamist 1 ml hüdrolüüsisegu ja viidi ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See oli 0-proov, mis iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel. 10 min pärast ensüümi lisamist pipeteeriti 1 ml reaktsioonisegu teise kolbi ning omakorda 10 min pärast 1 ml kolmandasse. Kolvid komplekslahusega, kuhu on lisatud hüdrolüüsisegust võetud proovid, asetati 10 min
V1 reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele T hüdrolüüsi kestus, s 180 glükoosi molekulmass V3 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml g ensüümipreparaadi kaalutis, g Invertaasi aktiivsus 10.minuti proovis 3 See tähendab, et 1 g invertiini aktiivsus on 186,7 µkatalit 1 g invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 186,7 mol taandavat suhkrut sekundis. Invertaasi aktiivsus 20. minuti proovis See tähendab, et 1 g invertiini aktiivsus on 282,5 µkatalit 1 g invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 282,5 mol taandavat suhkrut sekundis. Järeldused Määratud invertaasi aktiivsused peaksid olema enam-vähem sarnased, kuid antud juhul erinevad need üksteisest märgatavalt
V2 ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 tegur üleminekuks mikrogrammidele, T hüdrolüüsi kestus, s, 180 glükoosi molekulmass, V3 proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml, V4 ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml, G ensüümipreparaadi kaalutis, g. Invertaasi aktiivsus 10 minuti proovis: A10 = (7,8 1,3) · 10,4 · 5 · 103 / (600 · 180 · 1 · 0,4 · 0,0151) = 518,2 kat/g See tähendab ,et 1g invertiini aktiivsus on 518,2 katalit 1g invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 518,2 mol taandavat suhkrut sekundis. Invertaasi aktiivsus 20 minuti proovis: A20 = (11,1 1,3) · 10,4 · 5 · 103 / (1200 · 180 · 1 · 0,4 · 0,0151) = 390,7 kat/g See tähendab ,et 1g invertiini aktiivsus on 390,7 katalit 1g invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 390,7 mol taandavat suhkrut sekundis. Järeldus Määratud invertaasi aktiivsused peaksid olema enam-vähem sarnased
korral ja tahke ensüümipreparaadi korral. 1 mikrokatal ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekudi jooksul juures produtseeritakse 1 mikromool produkti. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. · Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisasin sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaasi lisasin 0,5 ml invertiini lahust ja 9,5 ml atsetaati, et saavutada 20 kordne lahjendus. · Katseklaasi sulgesin korgiga ja loksutasin lahust kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine. · Võtsin 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteerisin 25 ml substraati, milleks oli 7%- line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. · Katseklaasi varustasin korgiga ja asetasin umbes 5 10 minutiks vesitermostaati juurde soojenema.
mahl (ml) sisaldus (mg/ml) 0 proov 1,6 1,4 10. minuti proov 7,2 6,2 20. minuti proov 14,5 12,8 Invertaasi aktiivsus 10. minuti proovis Invertaasi aktiivsus 20. minuti proovis Aktiivsuste aritmeetiline keskmine Tulemuste erinevus Järeldus 1 ml invertiini aktiivsus on 49,56 katalit 1 ml invertiinipreparaadi toimel produtseeritakse 49,56 mol taandavat suhkrut sekundis. Määratud invertaasi aktiivsused peaksid olema enam-vähem sarnased, kuid antud juhul erinevad need üksteisest märgatavalt. Järelikult pidi töö läbiviimisel tekkima mingi viga. Kõige tõenäolisemalt tekkis suur erinevus tiitrimisel.
taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1 ml kohta (kat/ml). 2. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine (vedelast ensüümipreparaadist) Lahustina kasutatakse atsetaatpuhvrit, mille pH = 4,8. Juhendaja etteantud andmetel tuli töölahust valmistada 5 ml, ehk teha vedelast invertiinist 50-kordne lahjendus. Automaatpipeti abil võtsin 100l invertiini ning lisasin 5-ml kriipsuni atsetaatpuhvrit. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin, et kontsentratsioon ühtlustuks Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine · Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml substraati (7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris), katseklaas suletakse korgiga ja jäetakse vesitermostaati ~30 juurde soojenema. · Võetakse kolm 250 ml mahuga koonilist kolbi, kuhu pipeteeritakse 10 ml
Inveraati preparaadi aktsiivsus (A) arvutatakse: C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0 – proovis C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis V1 – reaktsioonisegu üldmaht V2 – ensüümi töölahuse üldmaht 103 - tegur üleminekuks mikrogrammidele T – hüdrolüüsi kestus 180 – glükoosi molekulmass V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks V4 – ensüümreaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht L – lahjendusmäär Tööks kasutasin vedelat invertiini ja valmistasin 40 kordse lahjeduse. Katse- ja arvutustulemused Tiitrimiseks kulunud Cu2SO4 mahud: 1. 0 – proovis: 3,6 ml 2. 10 min – proovis: 17,8 ml 3. 20 min – proovis: 30,5 ml Taandavate suhkrute sisaldused: 1. 0 – proovis: 3,2 mg/ml 2. 10 min – proovis: 18,5 mg/ml 3. 20 min - proovis: 24,03 mg/ml Aktiivsus A10 : C1 = 3,2 mg/ml C2 = 15,8 mg/ml V1 = 1 + 25 = 26 ml V2 = 10 ml T = 10 min = 600 s V3 = 1 ml V4 = 1 ml L = 40 Aktiivsus A20:
annaabi.ee 
