Mükobakterite suhtes on võimalik uurida kõiki kehavedelikke, eritisi ning organite kudesid Röga Bronhiaalsekreeti Maoloputusvedelik Sekreedid, uriin, kõik erinevad punktaadid (näiteks pleuravedelik jne.) DIAGNOSTIKA Mikroskopeerimine: ZiehlNeelsen’i meetod; Akridiinoranž värvingud (fluorestsentsmeetod) Mükobakterite isoleerimine, kasutusel on nii LöwensteinJensen, Middlebrook tahked söötmed, kui ka MGITvedelsööde (tundlikum) Mükobakterite isoleerimiseks verest on spetsiaalsed Myco/F Lytic vedelsöötmed (BACTEC pudel) HAIN Lifescience GenoType’i molekulaarset meetodit (samastamiseks) HAIN GenoType MTBDR plus test tuvastatakse isoniasiidi ja rifampitsiini resistentsust põhjustavad enamlevinud mutatsioonid DIAGNOSTIKA MTBDRsl test tuvastada aminoglükosiidide,
pandud. Katseklaas nr. 2 ja 4 seguga ei toimunud mitte mingeid reaktsioone. 6 4. ARUTELU Söötmes kasutati suhkrut, kuna see reageerib pärmiga segunedes hästi. Pooled klaasid asetati külmikusse, kuna on teada, et külmas keskkonnas ei toimu head reaktsiooni ainete vahel. Soojaallika lähedal aga hoopis toimub reaktsioon hästi. Pooltes katseklaasides kaeti söötmed toiduõliga, kuna toiduõli tagab hapniku mittesattumist söötmetesse, sest hapnik reageerib söötmega hästi. 7 KOKKUVÕTE Uurimise lõpptulemusena selgus, et pärmi ja suhkru kiireks reageerimiseks on vaja piisavalt sooja temperatuuri ja hapnikku. Uurimistöö algul püstitatud hüpotees oli õige. Pärm reageerib soojas suhkruga paremini. 8 KASUTATUD KIRJANDUS: · http://et
Töö eesmärk: erinevate söötmetega tutvumine, värvimine Grami järgi ja mikroskopeeromine, mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvuse uurimine temperatuurist, keskkonna pH-st ning keedusoola, suhkru, ksenobiootikumide sisaldusest keskkonnas Kasutatavad materjalid: 3 tardsöötmel ettekasvatatud mikroobikultuuri (Baccillus, Rhodococcus, veinipärm); glükoosi (0%, 20%, 40%), vesinikioonide (pH 5, 7, 9) ja soola NaCl (0%, 10%, 20%) erinevate kontsentratsioonidega katseklaasid; PCA ja MALT söötmed Petri tassidel ilma ja koos ksenobiootikumidega Töövahendid: katseklaasid, vahendid värvimiseks ja mikroskopeerimiseks Töö käik: Etapp1. Mikroskopeerimine: (uurimine vastavalt Biotehnoloogia laboratoorsete tööde juhendile ehk lisa 2 või Mikrobioloogia juhendile lk 36, lühiskeem toodud antud juhendi lisas) · uuritavatest mikroorganismidest valmistatakse preparaadid, kusjuures kuumfikseeritud - bakterite jaoks ja märgpreparaat pärmi jaoks
1. Millised elemendid on vajalikud raku kasvuks? Mikro (CuZnMnMoVWSeSiNa)-ja makroelemendid (CHNOPSKMgCaFe) 2. Miks on vajalik kasvufaktorite lisamine mikroobi kasvukeskkonda? Looduslikud orgaanilised ained, mida organism ise ei sünteesi. Puriinid, pürimidiinid, AH, vitamiinid. 3. Kuidas on võimalik hinnata mikroobide kasvu mingil söötmel? Lisatakse söötmele indikaatorvärve. Indikaatorvärvi muutuse järgi saab tuvastada mikroobi kasvu, kuna söötme pH muutub. 4. Kuidas jaotatakse söötmed koostise järgi? Looduslikud söötmed, sünteetilised söötmed ja komplekssöötmed. 5. Mis eristab sünteetilist söödet komplekssöötmest? Sünteetiline sööde on defineeritud koostisega, komplekssööde ei ole. Komplekssöötmel lisaks pärmi/liha/taimeekstrakte lisaks mineraalainetele. 6. Kuidas jaotatakse söötmed funktsionaalsuse põhjal? Minimaalsööde, diferentsiaalsööde, selektiivsööde, rikastussööde 7
iseloomulik kuju ja suurus ning kindlad füüsikalis-keemilised omadused sarnaset teiste keemiliste ühenditega. Viiruste avastamine 19.sajandi teisel poolel võeti kasutusele valgusmikroskoop ja spetsiifilised mikroorganismide (bakterid, protistid, seened) identifitseerimiseks. Sel moel suudeti näidata, et teatud kindlate omadustega bakterid on nakkushaiguste tekitajad. Järgnevalt võeti kasutusele bakterioloogilised söötmed, milles kasvatati ja iseleeriti terve rida haigusi tekitavaid iseloomulike geneetiliste omadustega baktereid. Kolm teadlast, Adolf Mayer (1843-1942), Dmitri Ivanovski (1864-1920) ja Martinus Beijerinck (1851-1931) uurisid tubaka mosaiikhaigust ja leidsid , et selle taimehaiguse tekitajad on oluliselt erinev kõigist senituntud bakteritest. -5- Esiteks oli tubaka mosaiikhaiguse tekitaja oluliselt väiksem kui bakter, sest te ei olnud
Efektiivsus sõltub lainepikkusest, intensiivsusest ning toime ajast. 10. Mille poolest erineb ioniseeriva kiirguse toime mitteioniseeriva kiirguse toimest? Ioniseeriv kiirgus( - ja x- kiired -> lainepikkus alla 100nm) omab suurt läbitungimisvõimet ning steriliseerib sügavuti. Mitteioniseerivkiirgus või UV- kiirgus (lainepikkus üle 100 nm ) ei oma nii suurt läbitungimisvõimet ning seetõttu steriliseerib õhku, materjalide pindu ja pindmisi kihte. 11. Kuidas söötmed jaotatakse nende keemilise koostise järgi ? 12. Mille poolest erineb keemiliselt defineerimata koostisega sööde keemiliselt defineeritud koostisega söötmest? SAMA VASTUS Keemilise koostise järgi jaotatakse: a) keemiliselt defineerimata koostisega (söötme täpne keemiline koostis ei ole teada) b) Keemiliselt defineeritud koostisega ( on teada söötme iga komponent ning selle täpne sisaldus) 13. Kuidas jaotatakse söötmeid nende kasutamise järgi? Transportsöötmed
Mitteiooniseerivad kiired – lõhub mikroobide DNA ( UV-kiired ). 6. Erinevad külviviisid ja söötmete tüübid. Sööde on selline keskkond, kus mikroobid saavad kasvada, elada ja paljuneda. Kuus tähtsamat makroelementi: C, H, O, N, P, S. Mikroelemendid: Zn, Mn, Ni, Na, Si, Se. Kasvufunktsioonid – orgaanilisedühendid, mida mikroobid ise toota ei suuda ( aminohapped ). Söötmeid on võimalik liigitada koostise järgi: 1)Looduslikud söötmed: ( piim, puljong, marja- ja puuviljamahlad ) kasutatakse mitmete mikroobi kultuuride säilitamiseks. 2) Sünteetilised söötmed: kindla koostisega, valmistamisel kasutatakse destilleeritudvett ja puhtaid kemikaale. Kasutatakse mikroobide toitumisnõudluste ja rakust välja erituvate õhendite uurimiseks. 3) Komplekssöötmed: sisaldavad pärmi, liha ja taimeekstrakte, kasutatakse peptooni. Töö ülessannete järgi:
Keemiline steriliseerimine- plastiku ja aparaatide steriliseerimisel. Mehaaniline steriliseerimine- on lahuste või gaaside mikroobidest vabastamine läbi peenepooriliste filtrite. Steriliseerimine ioniseeriva kiirgusega- toime avaldub lühemate lainepikkustega kiirtel alla 100 nm. Steriliseerimine mitteioniseeriva kiirgusega. - on suurema lainepikkusega lõhub mikroobide DNA. 7. Erinevad külviviisid ja söötmete tüübid Söötmed jaotatakse koostise järgi 3 rühma: looduslikud )piim, puljong, mahlad) . Kasut kultuuride säilitamiseks. Sünt. Söötmed on teat kindla koostisega. valmist kasut dest. Vett ja puhtaid kemikaale. Kasut mikroobide toitumisnõudluse ja rakust väljaerituvate ühendite uurimiseks. Komplekssöötmed puudub täpne keemiline koostis: sis ka pärmi, liha ja taimeekstrakte, võidakse kasutada tööülessannetest lähtuvalt. Liigitatakse: 1
aktiivseid komponente, nagu glütserool ja naatriumkloriid. Näited söötmetest, mis nimetatud komponente sisaldavad, on toodud tabelis 3.1. Hallitusseente välista- miseks ning aeglasemalt arenevate seente kasvu soodustamiseks kasutatakse dikloraani (dichloran). Selektiivsöötmed, mis toetuvad üksnes inhibiitoritele, on väga harva piisaval määral efektiivsed, tagamaks konkurentsmikrofloora pärssi- mist. Sihtmärk-organismide nähtavaks muutmiseks sisaldavad mitmed söötmed 35 indikaatorsüsteeme. Näitena võiks tuua VRBL-agari, kus laktoos fermenteeritakse coli-laadsete bakterite poolt, millega kaasneb happe produktsioon. See muudetakse nähtavaks pH-indikaatori fenoolpunase poolt, mis muudab kolooniad punaseks. Alternatiivseks indikaatorsüsteemiks on rauasoola ja naatriummetabisulfiti kombi- natsiooni kasutamine söötmetes, mis tänu sadestunud raudsulfitile muudab
2. Mikroorganismide kasvukiiruse sõltuvust · temperatuurist, · keskkonna pH-st, · keedusoola, · suhkru, · ksenobiootikumide sisaldusest keskkonnas; 3. Termilise töötluse mõju erinevatele mikroorganismidele. Kasutatavad materjalid: 3 tardsöötmel ettekasvatatud mikroobikultuuri (Baccillus sp Ps 42, Pseudomonas sp 105, Saccharomyces cerevisae); glükoosi (0%, 20%, 40%), vesinikioonide (pH 5, 7, 9) ja soola NaCl (0%, 10%, 20%) erinevate kontsentratsioonidega katseklaasid; PCA ja MALT söötmed Petri tassidel ilma ja koos ksenobiootikumidega Töövahendid: katseklaasid, vahendid värvimiseks ja mikroskopeerimiseks TÖÖ KÄIK Etapp1. Mikroskopeerimine Valmistasime uuritavatest mikroorganismidest preparaadid (vastavalt juhendi lisades 4.2 ja 4.3 toodud õpetusele), kusjuures kuumfikseeritud preparaadi bakterist jaoks ja märgpreparaadi pärmi uurimise jaoks. Värvisime Grami järgi, kasutades võrdluskultuuridena Sarcina (G+) ja E. coli (G-). Vaatlustulemused tabelis 1.
Ta väitis, et bakterid kuuluvad taimeriiki ja on lähedased vetikatele (tsüanobakterid). 20 aasta jooksul kirjeldas ta paljusid erinevaid baktereid. Esimesena kirjeldas bakteriaalsed endospoorid (Bacillus subtilis'el). Gram - bakterite värvumine erinevati. Tänu erinevustele rakukesta ehituses värvuvad eritüüpi bakterid (grampositiivsed ja gramnegatiivsed) selle metoodika järgi erinevalt. Vinogradski - ökoloogilise bioloogia rajaja Selektiivsöötmed - valikulised söötmed,; vedelad ja tahked, lisatakse toiteaineid, mis valikuliselt soodustavad ühe või teise mikroobirühma arengut Söötmed kus pole lämmastikku, lisati mulda, anaeroobne bakter. N2 molekulaarlämmastik, õhus 70% - kõrgemad bakterid ei saa seda sünteesida. Kemolitoautotroofne toitumistüüp - oksüdeeritakse keemilisi anorgaanilisi aineid, süsihappegaasist ehitatakse üles keha. Vinogradski esimest korda kirjeldas. Iseloomulik ainult prokarüootidele. Beijerinck - rajas Delfti koolkonna
Külmsteriliseerimine- . Keemiline steriliseerimine- plastiku ja aparaatide steriliseerimisel. Mehaaniline steriliseerimine- on lahuste või gaaside mikroobidest vabastamine läbi peenepooriliste filtrite. Steriliseerimine ioniseeriva kiirgusega- toime avaldub lühemate lainepikkustega kiirtel alla 100 nm. Steriliseerimine mitteioniseeriva kiirgusega. - on suurema lainepikkusega lõhub mikroobide DNA. 7. Erinevad külviviisid ja söötmete tüübid Söötmed jaotatakse koostise järgi 3 rühma: looduslikud )piim, puljong, mahlad) . Kasut kultuuride säilitamiseks. Sünt. Söötmed on teat kindla koostisega. valmist kasut dest. Vett ja puhtaid kemikaale. Kasut mikroobide toitumisnõudluse ja rakust väljaerituvate ühendite uurimiseks. Komplekssöötmed puudub täpne keemiline koostis: sis ka pärmi, liha ja taimeekstrakte, võidakse kasutada tööülessannetest lähtuvalt. Liigitatakse: 1
Mitteiooniseerivad kiired lõhub mikroobide DNA ( UV-kiired ). 7. Erinevad külviviisid ja söötmete tüübid Sööde on selline keskkond, kus mikroobid saavad kasvada, elada ja paljuneda. Kuus tähtsamat makroelementi: C, H, O, N, P, S. Mikroelemendid: Zn, Mn, Ni, Na, Si, Se. Kasvufunktsioonid orgaanilisedühendid, mida mikroobid ise toota ei suuda ( aminohapped ). Söötmeid on võimalik liigitada koostise järgi: 1)Looduslikud söötmed: ( piim, puljong, marja- ja puuviljamahlad ) kasutatakse mitmete mikroobi kultuuride säilitamiseks. 2) Sünteetilised söötmed: kindla koostisega, valmistamisel kasutatakse destilleeritudvett ja puhtaid kemikaale. Kasutatakse mikroobide toitumisnõudluste ja rakust välja erituvate õhendite uurimiseks. 3) Komplekssöötmed: sisaldavad pärmi, liha ja taimeekstrakte, kasutatakse peptooni. Töö ülessannete järgi:
Mitteiooniseerivad kiired lõhub mikroobide DNA ( UV-kiired ). 7. Erinevad külviviisid ja söötmete tüübid Sööde on selline keskkond, kus mikroobid saavad kasvada, elada ja paljuneda. Kuus tähtsamat makroelementi: C, H, O, N, P, S. Mikroelemendid: Zn, Mn, Ni, Na, Si, Se. Kasvufunktsioonid orgaanilisedühendid, mida mikroobid ise toota ei suuda ( aminohapped ). Söötmeid on võimalik liigitada koostise järgi: 1)Looduslikud söötmed: ( piim, puljong, marja- ja puuviljamahlad ) kasutatakse mitmete mikroobi kultuuride säilitamiseks. 2) Sünteetilised söötmed: kindla koostisega, valmistamisel kasutatakse destilleeritudvett ja puhtaid kemikaale. Kasutatakse mikroobide toitumisnõudluste ja rakust välja erituvate õhendite uurimiseks. 3) Komplekssöötmed: sisaldavad pärmi, liha ja taimeekstrakte, kasutatakse peptooni. Töö ülessannete järgi:
5 Joseph Lister Inglise kirurg. Võttis omaks Pasteuri vaated (haavanakkused). Desinfitseeriv lahus: fenoolilahus. Operatsioonijärgne suremus vähenes kiiresti. Robert Koch Meditsiinilise mikrobioloogia rajaja. Huviobjekt oli siberi katk. Seni arvati, et mitte bakterid ei põhjusta koekahjustusi peremeesorganismis, vaid et kahjustunud koes leitavad bakterid on kudede haigusprotsesside (lagunemise) tagajärg. Võttis kasutusele esimesed söötmed mikroobide kasvatamiseks (keedetud kartulilõigud, zelatiin, agar) KOCHI-HENLE POSTULAADID Tingimused, mis peavad olema täidetud, et tõestada, et just mingi konkreetne haigusetekitaja põhjustab just seda konkreetset haigust. Töötati välja siberi katku tekitajat uurides. 1. Mingi haiguse tekitajaks peetav mikroob peab vastavat haigust põdevas organismis pidevalt esinema. 2. See mikroob tuleb isoleerida puhaskultuuri. 3
kompleksdiagnostikat - nn suguhaiguste diagnostilised paneelid (Eestis Quattromed HTI), kuhu on koondatud enamlevinud tekitajad: N.gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium. HAIGUSETEKITAJA ISOLEERIMINE. Patogeeni isoleerimine nakkuskoldest igal N.gonorrhoeae PCR-postiivsel patsiendil tekitaja ravimtundlikkuse määramiseks. Uuritav materjal külvatakse selektiivsele šokolaadiagarile (Thayer-Martin’i, Martin-Lewis või New York City). Söötmed sisaldavad antibiootikume ja pärsivad seetõttu paljude normaalsesse mikrobiootasse kuuluvate mikroobide kasvu. Külve inkubeeritakse 35°–37°C juures kuni 72 tundi 5–7% CO2 atmosfääris. Vajadusel on võimalik isolaatide samastamine MALDI-TOF analüsaatori abil. ANTIBIOOTIKUMTUNDLIKKUSE MÄÄRAMINE. Arvestades globaalset situatsiooni gonokokkide antibiootikumresistentsuse levikuga, on vajalik N.gonorrhoeae isoleerimine ja AB tundlikkuse määramine. Määratakse MIKi E- testi abil. NB
4Mikroobifüsioloogia LOMR.03.022 Riho Teras Sisukord 1. Bakterite kasv ja toitumine................................................................................ 4 1.1. Bakterite kasvatamine laboritingimustes.....................................................4 1.2. Elutegevuseks vajalikud elemendid.............................................................7 1.3. Söötmed bakterite kasvatamiseks laboris....................................................9 1.4. Füüsikalis-keemilised tegurid, mis mõjutavad bakterite kasvu...................10 2. Bakterite ehitus ja rakustruktuuride funktisoonid.............................................15 2.1. Tsütoplasma komponendid.........................................................................16 2.1.1. Nukleoid..............................................................................................
5 a vanustel, aga ka täiskasvanutel. Diagnostika. Mikroskoopia võib olla kasulik (värvuvad küll korrapäratult ja kehvasti, aga pleomorfsed G- pulgad on informatiivsed). Kultuuri tuleb kultiveerida hapnikuvabalt ja niiskelt, külvata spetsiaalsetele anaeroobide söödetele. Materjal ei tohi normaalse mikroflooraga kontamineeruda. Bacteroides kasvab kiiresti (kuni 2 päeva), teised aeglasemalt. Selektiivsed söötmed, näiteks sapiga rikastatud. Biokeemiliselt: kommertskitid on olemas. Metaboolsete produktide hindamiseks gaaskromatograafia. Ravi ja profülaktika. Antibiootikumravi ja kirurgiline sekkumine tõsiste anaeroobsete infektsioonide ravis. B. fragilis grupi, paljud Prevotella ja Porphyromonase liigid, mõned Fusobacteriumid toodavad β-laktamaase. Parima aktiivsusega G- anaeroobsete pulkade vastu on metronidasool, karbapeneemid (imipenem), β-laktaam+inhibiitor. Plasmiidvahendatud resistentsus
efektiivsust: suhkru aeroobne lagunemine annab rohkem energiat kui anaeroobne. Pasteur arvas, et haigusi põhjustavad mikroorganismid. Ta töötas välja vaktsiinid kanakoolera, siberi katku ja marutõve vastu. 30. Robert Koch.Kochi postulaadid Koch tõestas siberi katku tekitaja näitel, et haiguse põhjustajaks on Bacillus anthracis, kelle puhaskultuuri süstimisel tervetele loomadele areneb välja siberi katk. Võttis kasutusele esimesed söötmed mikroobide kasvatamiseks. Esimene tardsööde keedetud kartuli lõigud! Siis zhelatiin ja siis agar. Bakterite värvimine mikroskoopimisel. Ripptilga meetod mikroskopeerimisel, bakterite pildistamine mikroskoobis. Kochi postulaadid 1 Haigest organismist peab olema võimalik isoleerida mikroob, mida terves loomas pole. 2 Mikroobi tuleb kasvatada puhaskultuuris. 3 Kui tervet organismi antud mikroobiga nakatada, peavad ilmnema sümptomid, mis kaasnevad
E. coli detekteerimine ja isoleerimine. Kuna E. coli esineb pidevalt soolestikus ja arvati olevat mittepatogeenne ja väliskeskkonnas küllalt hästi vastupidav organism, hakati teda kasutama sanitaarse indikaatorina. Seetõttu tuli välja töötada lihtsad meetodid tema detekteerimiseks vees, toiduainetes jm., et ennustada potentsiaalset fekaalset reostust. Võeti arvesse, et E. coli kääritab laktoosi, Salmonella ja Shigella aga mitte, töötati välja selektiivsed diagnostilised söötmed. Et eristada E. colit teistest laktoosi fermenteerivatest bakteritest töötati välja indooli-, metüülpunase, Voges-Proskaueri ja tsitraadi testid. Tüvi loeti E. coli'ks, kui ta oli indool- ja metüülpunase testi järgi positiivne ja V-P ja tsitraattesti järgi negatiivne. Praktiliselt kõik tüved eritavad beeta-glükuronidaasi ja selle järgi on neid ka hea testida. E. coli K12 ja mõned teised tüved on ka täielikult sekveneeritud. Kasv EMB (eosine methylene blue) söötmel. E
on säilitanud jagunemisvõime ja neist võivad tekkida kõigi püsikudede rakud. Kasvuhormoo nid Meristeem Istutusvalmis rakud Erinevates taim kasvujärkudes erinevad söötmed 1.Meristeempaljunduseks eraldatakse varre kasvukuhikust (või muust meristeemi sisaldavast organist) väike koelõik. 2. Koelõik kantakse steriilselt suletavasse anumasse toitesegule ehk söötmele. Agar-agariga (wtf?) tahkestatud sööde sisaldab mineraalsooli, suhkrut, vitamiine ja kasvufaktoreid 3. Kui kultuuron kasvama läinud ja võrsuma hakanud, eraldatakse mikrovõrseid ja kantakse uuele söötmele. Ühest meristeemlõigust võib saada väga palju võrseid. 4
seenekujuliste struktuuride teket biofilmis, veekanalite püsimist avatuna biofilmi maatriksi küpsemise käigus, kui ka P. aeruginosa irdumist biofilmist. 5. Biofilmist irdumine Arvatakse, et tegemist on reguleeritud levimisstrateegiaga, mis võimaldab uute nisside koloniseerimist alustada varem kui toitained biofilmis limiteerivaks muutuvad. Näiteks on täheldatud, et mikroobide kasvamise käigus ärakasutatud söötmed indutseerivad rakkude irdumist samaliigilisest biofilmist (näidatud nii P. flurescensi kui P. aeruginosa puhul). Perioodiline biofilmist irdumine võib olla: 1) aktiivne protsess, mille käigus rakud vabanevad biofilmist üksikute planktonrakkudena ümbritsevasse keskkonda. Osadel bakteriliikidel (P. aeruginosa, Staphylococcus epidermidis jne.) on täheldatud biofilmi keskse osa muutumist vedelaks ja liikuvate planktonrakkude lahkumist sealt, jättes endast maha haigutava augu biofilmis
annaabi.ee 
