DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva
(polüploidsus) tekitamine lähtematerjali mutageenidega mõjustades. Ristamine võib olla a.) Liigisisene (sortide- või vormidevaheline) b.) Kaugristamine (eri liikidesse või perekondadesse kuuluvate taimede vaheline) Vajaduse korral võib ristata ka korduvalt, st. ristlusjärglasi omavahel või lähtevormidega. Ühe risttolmleva taime järglasi nimetatakse sordiaretuses pereks, ühe isetolmleva taime järglasi liiniks, ühe vegatatiivselt paljundatava taime (nt. kartuli) järglasi klooniks (kloonaretus). Risttolmlevate taimeliikide sordid on alati paljude lähedaste vormide kogumid populatsioonid; nende omadusi peab aretusvõtetega pidevalt parandama. Eestis tegelevad sordiaretusega Jõgeva Sordiaretuse Insituut ning Polli Aiandusuuringute Keskus. Eesti on 1961. aastal asustatud Rahvusvahelise Uute Taimesortide Kaitsmise Liidu (UPOV) liikmesriik. Sellel ühendusel on üle maailma praegu umbes 60 liikmesriiki ja igal aastal liitub uusi
vahel on tarvis kirjalikke tekste. Ka kommunikatsiooni erinevate põlvkondade vahel on vajalik, et eelmiste põlvede kogemused säiliksid, et ühiskonnal oleks kollektiivne mälu. · Paberile trükitud ajalehe loomise au kuulub hiinlastele. 725. aasta paiku hakkas seal ilmuma ajaleht ,,Di-bao" ja see ilmus muudetud pealkirjaga kuni 1911.aastani. · 593. aastast kasutati Hiinas trükkimisel puutahvleid, millesse oli lõigatud paljundatava lehekülje tekst. · 1040. aastal leiutas Hiinas sepp Pi-Sheng trükkimiseks savist hieroglüüfid. · 1392.aastal valati Koreas esimesed vasksed hieroglüüfid. Euroopaski tunti tahveltrükki. Renessansiajastul tuli kasutusele eriti võimas teabelevivahend: Johann Guttenberg leiutas 1440. aastal trükikunsti (lahtiste tähetüüpide abil trükkimise) ja see muutis sõnumite edastamise kiiremaks ja paljudele kättesaadavaks.
uute ahelate tootmisele järgnevates etappides (ahelreaktsioon) - Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2, 4, 8, 16…, pärast kolmekümnendat tsüklit oleme ühest molekulitst saanud juba 1 073 741 824 DNA lõiku. PCR-l vajalikud komponendid: - Uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada - Nukleotiidid – uute DNA ahelate moodustamiseks - DNA-polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA-d - Praimerid – lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule. Geel – elektroforees: - DNA proov kantakse geeli “hambasse” koos lahust raskemaks tegeva värvainega - Elektroforeesil liiguvad eri pikkusega DNA järjestused erineva kiirusega, lühemad kiiremini - Võrdluseks liiguvad geelil ka standardsed pikkusmarkerid, mille pikkus, nukleotiidide hulk on teada
Mitmeetapiline DNA süntees, kus eelnevates etappides sünteesitud ahelad on aluseks uute ahelate tootmisele järgnevates etappides. ● Paljundamine toimub eksponentsiaalselt: 2,4,8,16,32,64,128 PCR-i VAJALIKUD KOMPONENDID: ● uuritav DNA, mille piirkonda soovitakse paljundada ● nukleotiidid (kõik 4 erinevat)- uute DNA ahelate moodustamiseks ● praimerid (vasak- ja parempoolne)- lühikesed DNA lõigud, mis piiritlevad paljundatava piirkonna kogu DNA-st, märgistavad sünteesi alguskoha Erinevaid praimereid saab sünteesida vastavalt soovitavale DNA lõigule 6. Isiku molekulaarbioloogiline tuvastamine, DNA sõrmejälgede metoodika. Polümorfsed markerid; Tandem(kordus)järjestus (STR) ja SNP (ühenukleotiidne erisus/varieeruvus). Konspekt + Õp lk 50 - 56. Tuvastamine: vt vihikust STR, SNP jms. DNA sõrmejälgede metoodika- põhineb nähtusel, et iga inimese sõrmejärljed on kordumatud
Lehed 3- või 5-hõlmased, harva alumine pind karvane. Õied väikesed, rohekad või rohekaskollased, lookjalt rippuvates, 8-10 cm pikkustes kobarates. Tupplehed laiad, nende laius ületab pikkuse. Tolmukad tupplehtedest lühemad. Emakakael lühike, pooleni või vähem lõhestunud. Viljad ümarad, punased (kultuursortidel ka valged) hapukad. Üheks tähtsamaks lähteliigiks enamikule kultuursortidele ning hübriidliikidele. Must sõstar Ribes nigrum Tegu on varaviljuva kergesti paljundatava marjakultuuriga, mille vilju (marju) hinnatakse kõrge C-vitamiini sisalduse poolest. Eestis tavaline aiataim ka ravimtaim. Sõstar on maapinnalähedases mullas harunenud varrega mitmeaastane, kuni 1,5 m lai ja kuni 2 m kõrge põõsastaim. Maapealse osa moodustab erineva vanusega oksad mis on tekkinud basaal- ehk juurmistest pungadest. Olenevalt okste asetusest eristatakse püstise, laiuva ja lamanduva kasvulaadiga põõsaid. Kasvukohtadeks on peamiselt niiskemad segametsad, kaldavõsastikud,
alumisel jämedamal osal on vähe hästiarenenud pungi. 27.04.2016 Marje Kask 74 Pistokste emaistandik 27.04.2016 Marje Kask 75 Pistoks 27.04.2016 Marje Kask 76 Pistokstega paljundamine 3 · Pistoksad lõigatakse kas noa või kääridega. · Pistiku ülemine lõige tehakse risti oksaga, 0,5 cm ülemisest pungast kõrgemalt. · Alumine lõige tehakse: vahetult alumise punga alt 45° nurga all, kui paljundatava taimeliigi oksal asetsevad pungad vaheldumisi; vahetult alumise punga alt, kui paljundatava taimeliigi oksal asetsevad pungad vastakuti. 27.04.2016 Marje Kask 77 Pistokstega paljundamine 4 · Pistoksad seotakse ühtepidi kimpu ja etiketitakse. · Pistoksi istutatakse üldjuhul kevadel. · Ületalve hoitakse pistoksi kas spetsiaalses hoiuruumis liivas (temp 0 ºC) või avamaal
PCR olemus ja rakendused. PCR ehk polymerase chain reaction on katsutis läbiviidav menetlus. Ta võimaldab paljundada huvipakkuvat fragmenti DNA-st analüüsimiseks piisavas hulgas (miljonites koopiates) mõne tunniga. PCR tüüptsüklis võib eristada järgmisi etappe: DNA ahelade lahutamine lühiajalise denatureeriva kuumutamisega. Praimerite hübridisatsioon lahutatud ahelatele. Komplementaarsete praimerite lisamine. PCR puhul pole vaja teada paljundatava DNA-lõigu järjestust. Peab teadma lühikesi järjestusi mõlemal pool paljundatavat lõiku, sest nende järjestuste vastu on loodud komplementaarsed oligonukelotiidid (praimerid). Denatureeritud DNA jahutamisel hübridiseeruvad lisatud oligonukleotiidipraimerid ahelatega, piiritledes paljundatava fragmendi. DNA süntees kuumakindla DNA polümeraasiga. Järgneb uus tsükkel. PCR on DNA-diagnostikas igapäevaselt kasutatav vahend. 1
PCR olemus ja rakendused. PCR ehk polymerase chain reaction on katsutis läbiviidav menetlus. Ta võimaldab paljundada huvipakkuvat fragmenti DNA-st analüüsimiseks piisavas hulgas (miljonites koopiates) mõne tunniga. PCR tüüptsüklis võib eristada järgmisi etappe: 1. DNA ahelade lahutamine lühiajalise denatureeriva kuumutamisega. 2. Praimerite hübridisatsioon lahutatud ahelatele. Komplementaarsete praimerite lisamine. PCR puhul pole vaja teada paljundatava DNA-lõigu järjestust. Peab teadma lühikesi järjestusi mõlemal pool paljundatavat lõiku, sest nende järjestuste vastu on loodud komplementaarsed oligonukelotiidid (praimerid). Denatureeritud DNA jahutamisel hübridiseeruvad lisatud oligonukleotiidipraimerid ahelatega, piiritledes paljundatava fragmendi. 3. DNA süntees kuumakindla DNA polümeraasiga. Järgneb uus tsükkel. PCR on DNA-diagnostikas igapäevaselt kasutatav vahend. 1
restriktaaside loikamiskohti (esinevad plasmiidis ainult uks kord). Vajalik DNA-loik uhendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes luhikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. Plasmiidide abil geeni paljundamise pohietapid on jargmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "loikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni voi DNA-loigu "valjaloikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille kaigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. Teiseks DNA kloonimise voimaluseks on polumeraas-ahelreaktsiooni (PCR-polymerase chain reaction) kasutamine. PCR viiakse labi biokeemilise reaktsioonina ja selle puhul ei vajata elusorganisme DNA kopeerimiseks
vananedes enam Pookimisviisid võib jaotada kahte rühma: 1) silmastamine, mille puhul alusele poogitakse vaid üksainus pung koos kooretükikesega ja väikse puiduosaga (või ka ilma puiduosata); 2) oksastamine, mille puhul alusele poogitakse (1) 2 … 4 pungaga võrseosa. Järgnevalt tutvustatakse erinevaid pookimisviise: 5.1. Silmastamine Silmastamist teostatakse ajal, mil pookealuse koor on lahti ning paljundatava sordi emataime sama aasta võrsetele on arenenud uued pungad. Meie oludes on see juuli teine pool kuni augusti lõpuni. Siiski võib ka sellel perioodil esineda olukordi, kus koor on kinni - see on enamasti tingitud põuast või madalast temperatuurist. Silmastamiseks lõigatakse vegetatiivpung, mis alustab kasvu järgmisel aastal; õiepungad silmastamiseks ei sobi. Silmastamiseks varutakse oksad varahommikul, sama aasta võrselt.
5. Mis on plasmiid? Plasmiid on kaksikspiraalne DNA rõngasmolekul, mille molekulmass varieerub küllaltki 125 suurtes piirides. Plasmiidid asuvad vabalt tsütoplasmas või on liitunud kromosoomiga. 6. DNA kloonimise põhietapid isepaljunevas süsteemis. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasigas.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid?
denatureeruks, see peab olema võimalikult lühike. Kolmanda etapi (annealingu) pikkus sõltub kasutatud praimerite järjestusest mida suurem on G-de ja C-de arv, seda rohkem on vaja aega annealinguks. Kuna me kasutasime erinevaid praimereid, kuid sama programmi, ei pruugi annealingu aeg olla täiesti optimaalne, kuid siiski piisavalt täpne. Sünteesi pikkus sõltub nii kasutatavast ensüümist kui ka paljundatava järjestuse pikkusest, kuna me kasutasime kõik sama programmi, siis on valitud pigem pikem aeg (valitud on 3 minutit, lühemate järjestuste puhul piisaks ka 1 minutist). Korduste arv sõltub sellest, kui palju on vaja DNA-d saada, samas liiga palju tsükleid suurendab vigade tõenäosust. c) Geelipildilt on näha, et PCR on tõenäoliselt ebaõnnestunud, kuna bändi pole näha (peaks olema noolega märgitud kohas). Põhjuseks võib olla ebatäpsus. Edasiseks tööks sain L-Envo pEGFP-C2
Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. (vt. ka fail) 42. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. 43. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
resistentsusmarkergeen (et oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 40. DNA kloneerimine DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 41. DNA sekventeerimine DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi
ühenukleotiidse täpsusega. Mida ühem onfragment, seda kiiremini liigub ta geelis. See võimaldab DNA fragmentide mustrist lugeda välja DNA lõigu nukleotiidset järjestust. 46. Polümeraasi ahelreaktsioon. PRC meetod võimaldab spetsiifiliselt amplifitseerida(saada DNA paljundamisel koopiaid) suvalist DNA järjestust. PRC rakendamiseks on vaja teada amplifitseeritavast DNAst primaarjärjestust paljundatava DNA piirkonna mõlemast otsast.PRC toimub kolmeetapiliselt: 1. Amlifitseeritava DNA denatureerimine emperatuuri toimel (92-95 kraadi juures) 2. DNA renatureerimine temperatuuri langetamisel ülehulgas lisatud sünteetiliste oligonukleotiidsete praimerite juuresolekul, millest üks on komplementaarne amplifitseeritava DNA ühele ahelale, teine selle vastasahelale.Selle toimel hübridiseeruvad praimerid amplifitseeritava DNA ahelatega. 3
59. Molekulaardiagnostilised meetodid. PCR olemus ja rakendused. PCR ehk polümeraasi ahelreaktsioon, võimaldab paljundada huvipakkuvat fragmenti DNA-st analüüsimiseks piisavas hulgas (miljonites koopiates) mõne tunniga. PCR tüüptsüklis võib eristada järgmisi etappe: DNA ahelade lahutamine lühiajalise denatureeriva kuumutamisega. Praimerite hübridisatsioon lahutatud ahelatele. Komplementaarsete praimerite lisamine. PCR puhul pole vaja teada paljundatava DNA-lõigu järjestust. Peab teadma lühikesi järjestusi mõlemal pool paljundatavat lõiku, sest nende järjestuste vastu on loodud komplementaarsed oligonukelotiidid (praimerid). DNA süntees kuumakindla DNA polümeraasiga. Järgneb uus tsükkel. PCR on DNA-diagnostikas igapäevaselt kasutatav vahend. 1. Võimaldab detekteerida väga vähese DNA materjali olemasolu. 2
Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. 37. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi
Nii näiteks sisaldavad plasmiidid geene, mille põhjal sünteesitud valgud võimaldavad bakteritel elada antibiootikumide keskkonnas. DNA kloneerimise etapid. DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bekteri paljundamise tulemusena. Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. DNA sekveneerimine. DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela
Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. 37. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 38. DNA sekveneerimise põhimõte DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ensümaatilise meetodi puhul kasutatakse DNA-polümeraasi abil toimuva topeltahela sünteesi
oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise – selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
oleks antibiootikumi suhtes resistentne) ja kloneerimise võimaldamiseks restiktaasi lõikamiskoht (et saaks plasmiidi lahti lõigata) 41. DNA kloneerimise etapid DNA kloneerimine- ühesuguste plasmiidide koopiate tegemine bakteri paljunemise tulemusena. Geeni paljundamise põhietapid plasmiide abiga on järgmised: 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lõikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalõikamine" kromosoomist sama restriktaasiga- s.o. geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest 42. DNA sekveneerimise selle kohta Pata slaidides DNA sekveneerimine- DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine.
sünteesitakse 200 bp lõikudena (Okazaki fragmendid) 4. Võib olla mitu alguspunkti – kromosoomide piirkonnad, kust DNA repl. algab; prokarüootide DNA-l on üks alguspunkt, eukarüootides igal kromosoomil mitu (arv sõltub liigist, rakutüübist ja arengustaadiumist), neil algab mitmest kohtadest, kuna muidu kestaks protsess liiga kaua 5. Väga kontrollitud protsess – vastutusrikas, et ei oleks rohkem kui 1 paljunemine 6. Semikonservatiivne – repl. käigus lahutatakse paljundatava DNA ahelad ning mõlemale sünteesitakse juurde uus komplementaarne ahel (uus ja vana ahel) 14. DNA replikatsioonikahvli struktuur: põhikomponendid Juhtivat ahelat sünteesitakse ühe pideva lõiguna Mahajääva e viivisahela süntees toimub 200bp lõikudena (okazaki fragmendid) Repl. Algab replikatsiooni alguspunktidest (eukarüootides mitu, pro’des üksainus) 1) Helikaas liigub piki liiderahelat ja keerab II ahela katki 2) Primaas sünteesib praimeri
Vajalik DNA-lôik ühendatakse vektoriga ja moodustunud rekombinant-DNA viiakse bakteri rakku, kus vektor asub paljunema tootes lühikese ajaga miljoneid koopiaid meid huvitavast DNA-fragmendist. 50 Plasmiidide abil geeni paljundamise pôhietapid on järgmised 1) plasmiidi isoleerimine bakterirakust (tavaliselt kasutatakse E. coli plasmiide); 2) plasmiidi "lôikamine" spetsiifilise restriktaasiga; 3) paljundatava geeni vôi DNA-lôigu "väljalôikamine" kromosoomist sama restriktaasiga s.o geeni isoleerimine; 4) isoleeritud geeni "istutamine" plasmiidi 5) plasmiidi viimine bakterirakku ja bakteri kasvatamine, mille käigus paljuneb ka vastav plasmiid. 6) paljundatud geeni isoleerimine plasmiididest. Joonis. Kloonimine plasmiidi abil Teiseks DNA kloonimise vôimaluseks on polümeraas-ahelreaktsiooni (PCR- poly- merase chain reaction) kasutamine.
annaabi.ee 
