Leidsid 15 sarnast õppematerjali, mis on seotud failiga "Immunoloogia praktikumi protokoll". Need materjalid aitavad sul teemat sügavamalt mõista.
geel, antikeha, membraan, viirus, antigeen, paneme, mugula, elektroforees, elisa, temed, lisame, ensüüm, geelis, marker, tardunud, tween, antikehad, proovid, mahl, valgud, markeri, kamm, ootame, geelid, ülekandmine, filter, substraat, direct, antigeenid, igasse, katalüsaator, immunoloogia, praktikum, lilian, yagb, lahutav, buffer, 10mlTallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH - rühma tõttu. Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine:
Tallinna Tehnikaülikool IMMUNOLOOGIA Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD).
ta hakkab lagunema. EtBr seostub kaheahelalise DNAga ning uv-lainete all fluorestseerub oranžide viirgudena. (Suur oht! Mutageen!) Kui geel on piisavalt jahtunud, valasime geeli alusele (konstrollisime, et alus asetsetus horisontaalselt), tegime augu hammastega ning panime üleöö tarduma. 3.1 Praktikum – DNA lahutamine geelis Visualiseerime ona PCRi produkti selleks, et kontrollida, kas
300ml 1x TAE puhver lahusti 3µl EtBr DNA visualiseerimise reagent (lõppkontsentratsioon 0,05µg/ml) Arvutused: 1,5 0,05× 300 Agaroosi pulber: 300 × =4,5 g EtBr: =0,0015 ml=1,5 µ l 100 10000 , aga meie paneme EtBr 2x rohkem, kuna õppejõud ütles nii. Parem karta kui kahetseda. Töö käik: Lahustame agaroosi pulbri TAE puhvris Kuumutame seda mikrolaineahjus, et kõik pulber lahustuks Jahutame ja seejärel lisame EtBr. Kanname segu geelialusele, kuhu on eelnevalt lisatud hammaste tekkimiseks „kamm“ Jälgida, et mulle ei tekiks ja eemaldada need. Millise % geeli valasime? Miks? Vaatasime lk 32 olemat tabelit nr
pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c) Kontrollgeeli valasime selleks, et hinnata, kas puhastamine on olnud efektiivne. Kui segusse on jäänud peale soovitava produkti muid jääke, on kontrollgeeli pildil näha peale õige pikkusega lõigu ka teisi bände. Kui aga geelil õige pikkusega bänd puudub, võib arvata, et puhastamise käigus on PCR-i produkt kadunud. Minu proov asub kolmandas positsioonis. Kontrollgeelilt on näha üks õige pikkusega (um 300 bp) lõik, mis näitab, et puhastamine on õnnestunud
identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega. (9) Paiguta saadud tassid ümberpööratult 37 oC inkubaatorisse. Kolooniate värvusreaktsioon (sinine/valge) ilmneb 12-20 h pärast. Seejärel eemalda tassid inkubaatorist (teeb juhendaja). Tassid paneme ümberpööratult ,selleks et kondensaat ei tilgu agari peale. (10) Interpreteeri tulemused (ligeerimise efektiivsus, kolooniate arv, jne.) ja vali üks valge koloonia minipreparatsiooniks (vt. järgmine töö). Need kolooniad tuleb 1,5 ml LB vedelsöötmesse kasvama panna praktikumi-eelsel päeval (kontakteeru ses suhtes juhendajaga). TULEMUSTE INTERPRETEERIMINE: · Pipeteerime katseklaasidesse 1.5 ml LB vedelsöödet.
Lüüsipuhver peab sisaldama puhverdavaid aineid, mis hoiavad pH enam-vähem neutraalse (Tris-HCl, HEPES-NaOH), NaCl osmootse tasakaalu säilitamiseks (100-500 mM), detergenti membraanide lahustamiseks (SDS, Triton X-100, NP-40), lisaks veel glütserooli, vajadusel EDTA-d või muid lisandeid. Lüüsipuhvri koostis sõltub sellest, milliseid valke täpselt uurida soovitakse. 107. Saadud valgulüsaati kasutatakse edasi n. immuunosadestamiseks, Western blotiks, ELISA analüüsiks. 1. Valmistada 15 ml tuubi 5 ml lüüsipuhvrit. Segada: 250 μl 1M Tris-HCl, 150 μl 5M NaCl, 0,5 ml 10% Triton-X 100, 1 ml 50% glütserooli, 20 μl 0,5M EDTA, 3,08 ml MQ-d. Panna puhver jääle. 2. Fuugida trüpsiniseerimisel üle jäänud rakud (3 min 1000 rpm). Eemaldada supernatant. Lisada 1 ml PBSi (et eemaldada söötmejäägid), loksutada õrnalt, fuugida uuesti, eemaldada supernatant. 3
...................................................................26 6. Anaeroobsete infektsioonide mikrobioloogiline diagnostika.................................................32 7. Spiroheetide,Neisseria, Chlamydia ja Mycoplasma infektsioonide diagnostika.................. .38 8. Seennakkused, algloomnakkused,zoonoosid ja riketsioosid………………………….....48 9. Molekulaarsed meetodid mikroorganismide samastamiseks ja iseloomustamiseks.............63 10. Elektroforees. Viroloogiline diagnostika.................................................................................71 2 Mikrobioloogilise diagnostika põhiskeem 1 A. Uuritav materjal Materjali valik toimub vastavalt haiguse patogeneesile, s.o. haigustekitaja võimalikule lokalisatsioonile organismis. B. Mikrobioloogiline diagnoosimine 1
lümfotsüütide aktiivseks muutumise. Antigeenid võivad organismi tungida naha, limaskestade, hingamis- ja seedetrakti kaudu. ANTIKEHAD ehk immunoglobuliinid (ka immuunkehad, kaitsekehad) on kehavedelikes lahustuvad essentsiaalsed molekulid, mis liigitatakse glükoproteiinid hulka ja mida toodavad immuunsüsteemi B- lümfotsüüdid. Immunoglobuliinidel on omadus "ära tunda" ja seonduda antigeenidega. IMMUNOGEEN on antigeen, mis kutsub esile immunvastuse. Reeglina makromolekulid. Kõik immunogeenid on antigeenid, aga mitte alati vastupidi. Immunogeensus antigeenil sõltub molekuli suurusest, keemilistest omadustest jne. Nõrgad immunogeenid ei saa degradeerida ja esitleda T- rakkudele. Suur, lahustumatu makromolekul on parem immunogeen, kui väike. HAPTEEN on madalmolekulaarne aine, millel on epitoop e. antikeha seostumise koht, kuid mis ise ei kutsu esile immuunvastust.
omavad NK rakkudele iseloomulikke retseptoreid. N: CD 16, mis tunneb IgG molekuli Fc-d, seega anomaalse raku AG-AK kompleksi ja võivad tappa defektsed rakud. NK1-T rakkude vastus on kiire: (kiirem kui TH rakkudel); kiiresti sünteesivad tsütokiine, mis toetavad B rakke antikehade tootmisel; stimul. põletiku-vastast reaktsiooni ja T-rakkude tootmist. Lümfotsüüdid tunnevad ära antigeene ja diferentseeruvad immuunvastust teostavateks rakkudes. On väga tähtsal kohal omandatud immuunsuses. Antigeen aktiveerib ainult neid lümfotsüüte (ühesuguste lümfotsüütide kloone), mis on selle antigeeni suhtes spetsiifilised (tunnevad ta ära). Äratundmine toimub lümfotsüüdi pinnal asuvate retseptorite abil. Retseptoriteks on membraanile toodud antikehad. Immuunsüsteemis on miljoneid erisuguse antigeenispetsiifikaga lümfotsüüte, millest ainult väheseid aktiveeritakse paljunema ja seega suuri kloone moodustama. Kloon on ühe raku paljunemisel tekkinud rakupopulatsioon
Tallinna Tehnikaülikool Keemiainstituut Bioorgaanilise keemia õppetool BIOKEEMIA LABORATOORSED TÖÖD Koostajad: Malle Kreen Terje Robal Tiina Randla Tallinn 2010 SISUKORD 1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA ........................... 4 1.1 VALKUDE REAKTSIOONID ............................................................................... 4 1.1.1 Biureedireaktsioon ....................................................................................... 9 1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) ........................................... 10 1.1.3 Milloni reaktsioon ....................................................................................... 10 1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon ...................................................................
3. Biotestid 1. rakukultuur kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika. Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid. Loomakaitsjad võitlevad selle vastu. 4. Kiirmeetodid (molekulaardiagnostika) 1. nukleiinhapete määramine 2. antigeeni/antikeha määramine antigeen ja antikeha peavad omavahel väga hästi sobima (steeriliselt ja laenguliselt), kui ainult laengud sobivad, tekib palju valepositiivseid tulemusi. Seroloogilised testid taluvad suht hästi transporti. Palju võimalik osta valmisteste. Suht kiire meetod. Määratakse antigeeni olemasolu veres e organismi vastureaktsioon, aga mitte patogeeni olemasolu veres paljude haiguste puhul jäävad antikehad eluks ajaks püsima ja nii saab
Erinevate „lahtrite” koerakud ekspresseerivad vastavaid adhesioonimolekulide ligande ja toodavad vastavaid kemokiine. Lokaalsetes „lahtrites” kontrollivad lümfotsüütide liikumisi koespetsiifilise adhesiooni ja kemokiinide mõjud. Sekretoorne IgA: Kuigi osa IgA (teda on umbes 3 g/l s.h. IgA1 80% ja IgA2 80%) antikehadest tehakse süsteemses immuunsüsteemis (see tähendab, et osaliselt luuüdis), valmib enamik siiski plasmarakkude poolt toodetuna lamina proprias. See antikeha transporditakse üle epiteliaalsete rakkude trakti luumenisse ehk valendikku spetialiseerunud mehhanismi abil: IgA subepiteliaalses lamina proprias seondub IgA polü-Ig retseptoritega ja transporditakse endosoomide kaudu luumeni ehk valendiku pinnale. Mitte vähem kui 3g transporditakse päevas gastrointestinaaltrakti, millest 1/3 läheb maksa ja sapi kaudu. See kaitseb mukoosseid pindu mikrobiaalse invasiooni eest. Sekretoorset IgAd leidub pisarates,
Millise jaoks kõige suurem, see on parem substraat. Sellest lähutvalt on kõige parem florofumaraat. Kui ensüüm-substraadiga küllastatud, siis toimub florofumaraadiga reaktsioon oluliselt kiiremini kui teistel. Kui aga ütleme, et see substraat on kõige parem, mis seostub kõige tugevamini, siis on parem see substraat, millel on kõige väiksem K M. Sellisel juhul on hea substraat fumaraat, sest seostub paremini. Vastata võib seda, et parem on see, mis on parem otse konkureerides, st et paneme mõlemad substraadid ühte potti kokku ja ensüüm saab valida, millega tahab rohkem katalüüsi läbi viia. Sellisel juhul näeme, et hoopis spetsiifilisuse konstant on see, mis määrab ära otsekonkurentsis reaktsiooni kiiruse vms. Seos kehtib suvalise substraadi kontsiga, ükskõik milline on substraadi konts K M suhtes. Siis see seos sobib, kui ühes potis kaks substraadi koos, sest siis vaba ensüümi
selle protsessi jääkained tagasi koevedelikku eritama. 19 Niisiis etendavad rakud ainevahetuses juhtivat osa. Rakkude järgmine tähtis omadus seisneb selles, et peaaegu kõik nad on jagunemisvõimelised. Nõnda võtavad rakud osa inimese kasvamisest ja muutumisest ning oma aja äraelanud rakud asenduvad uutega. Põhimõtteliselt koosneb iga rakk rakukestast e membraanist, rakutuumast, rakuplasmast ja raku sisemuse mitmeks osaks jaotavast vaheseinast. Membraan ümbritseb kogu rakku ja täidab mitmesuguseid ülesandeid. Näiteks eraldab ta rakusisest ruumi rakuvälisest. Seetõttu võib näiteks rakusiseses ruumis olla mõnel ainel hoopis teistsugune kontsentratsioon kui väljaspool. See asjaolu etendab tähtsat osa raku ainevahetuses oma ümbruskonnaga. Membraan – kest, piirpind Rakukesta külge on kinnitunud retseptormolekulid. Need võimaldavad rakku teavitada teatud ainete olemasolust väljaspool, et rakk saaks vastavalt reageerida
annaabi.ee 
