Klass Alfaproteobakterid · Siia kuulub 6 seltsi: 1) Rhodospirillales 2) Rickettsiales 3) Rhodobacterales 4) Sphingomonadales 5) Caulobacterales 6) Rhizobiales · Alfaproteobakterite hulgas on rohkesti neid baktereid, kes elavad koos eukarüootsete rakkudega Rhizobium on liblikõieliste taimede juuremügarate sümbiont, Azospirillum on taimede risosfääri bakter. Agrobacterium põhjustab taimedel mitmesuguseid kasvajaid, riketsiad on loomade rakusisesed parasiidid. Kõik need eukarüootidega mingis seoses olevad liigid klasterduvad selles alamhõimkonnas kokku ja on ilmselt ühise evolutsioonilise päritoluga. Nende eellasel võis seega olla mingeid omadusi, mis soodustasid nende kooselu eukarüootsete rakkudega. · Arvatakse, et alfaproteobakter võiks olla ka eukarüootse raku mitokondri eellane.
radiodurans + + Treponema pallidum + + Chlamydia + + ? Tsüanobakter + + + + + mõned Rikketsia + + + Acetobacter ? + ? Agrobacterium + + + ? Nitrobacter + + Rhodospirillum + + + Neisseria + + Thiobacillus mõned + + mõned Zymomonas + + Pseudomonas 1 liik - aeruginosa
Geenitehnoloogia Rakendamine taimedel ja loomadel, sellega kaasnevad riskid Marc van Montagu Molekulaarbioloog, kes avastas geenide ülekandumise agrobakteri (Agrobacterium tumefaciens) ja taime vahel. Esimene GMtaim umbrohutõrjet taluv tubakas (1983a) Esimene lubatud GMpõllukultuur pika säilivusajaga tomat (Ameerika Ühendriigid 1994a) GMpõllukultuure jagatakse kolmeks GMtaimed põllumajanduses ja toiduainetööstuses Herbitsiidiresidentsed taimed Suurim grupp kasvatatavatest GMpõllukultuuridest (6372% GM põllukultuuride kasvupindadest)
Häirijad-valgud võivad olla aktiivsed igas faasis. Transgeenide vaigistamine Taime viidud transgeenid on sageli siRNA poolt vaigistatud Vaigistamise lülitab sisse: Väga kõrge ekspressiooni tase dsRNA, mis tekib transgeenilt Hälvik RNA-d, mida transgeen kodeerib Transgeene vaigistatakse post-transkriptsionaalselt ja ka transkriptsiooni ajal. 1980-tel lõid teadlased meetodi, et viia geene taime genoomi, kasutades taime patogeeni Agrobacterium tumefaciens (bakter). Sisestatud geene kutsutakse transgeenideks. Kalkooni süntaas on ensüüm, mis on oluline antotsüaanide biosünteetilise raja alguses. Fenomen, kus mõlemad geenid (transgeen ja oma geen) on vaigistatud, nimetatakse `koos- allasurumiseks. Translatsioon- RNA ahelast saadakse geneetilise koodi kaudu valgu aminohappeline järjestus. Toimub ribosoomidel. mRNA- RNA molekul, kus toimub translatsioon geneetiline kood- 1 koodon (3 nukleotiidi) kodeerib 1 hapet
aromaatseid ühendeid mikroobse degradatsiooni käigus? Sealt edasi järgneb juba nende oksüdatiivne lagundamine atsetüülCoA-ks, suktsinaadiks, püruvaadiks ja atseetaldehüüdiks, mida enamus mikroorganisme suudab metaboliseerida. a) Protokatehuaadiks b) Bensoaadiks c) Fenooliks d) Katehooliks e) Tolueeniks 4. Valige järgnevast loetelust kaks põhilist meetodit võõr DNA sisestamiseks taimerakku transgeensete taimede saamiseks? a) Agroinfektsioon Agrobacterium tumefaciens-i abil b) Laser vahendatud geeniülekanne c) Liposoom vahendatud geeniülekanne d) DNA mikroinjektsioon taimerakkudesse e) Biolistika (geenipüss) 5. Kui võrrelda taimekasvatuses kasutatavaid putukatõrjevahendeid, siis milliste insektitsiidide toimespekter on kitsam võimaldades rakendada täpselt suunatud kahjuritõrjet teatud kindlate putukaröövikute vastu? a) Bioloogilisi insektitsiide b) Keemilisi insektitsiide 6
53. Geenide otsese ülekande meetodid: *süstlaga rakku süstimine-mikroinjektsioon *biolistika-raku "tulistamine" raskmetallidega *elektroporatsioon 54.Geenide ülekanne vektorite abil: Vektorid on vahendajad. Nende abil saab organisme geneetiliselt muundada.(Uus geen või selle product võib muuta org.ainevahetust, mille tulemusena võib tekkida kahjulikke aineid). nt bakterite plasmiidid- need võtavad võõrast DNAd keskkonnast kergesti sisse. Sellised plastiidid on agrobacteriumites. 55. Agrobacterium`i liigid kui vektorid geenide ülekandel taimedel: *agrobacterium tunefacieusTi plasmid * agrobacterium rhizogenesRi plasmid * agrobacterium rubi Maailmas geneetiliselt muundatud organisme; juhtivriigid on USA(mais, sojauba, puuvillapõõsas) Hiina, Lõuna-Aafrika Vabariik(puuvillapõõsas). 56.Polüploidsus- indiviidi (raku) kromosoomikomplektide paljukordsus; gameetides on kromosoomikomplekte rohkem kui üks (n > x) ja diplofaasis (sügootides) rohkem kui kaks (2n > 2x).
53. Geenide otsese ülekande meetodid: *süstlaga rakku süstimine-mikroinjektsioon *biolistika-raku "tulistamine" raskmetallidega *elektroporatsioon 54.Geenide ülekanne vektorite abil: Vektorid on vahendajad. Nende abil saab organisme geneetiliselt muundada.(Uus geen või selle product võib muuta org.ainevahetust, mille tulemusena võib tekkida kahjulikke aineid). nt bakterite plasmiidid- need võtavad võõrast DNAd keskkonnast kergesti sisse. Sellised plastiidid on agrobacteriumites. 55. Agrobacterium`i liigid kui vektorid geenide ülekandel taimedel: *agrobacterium tunefacieusTi plasmid * agrobacterium rhizogenesRi plasmid * agrobacterium rubi Maailmas geneetiliselt muundatud organisme; juhtivriigid on USA(mais, sojauba, puuvillapõõsas) Hiina, Lõuna-Aafrika Vabariik(puuvillapõõsas). 56.Polüploidsus- indiviidi (raku) kromosoomikomplektide paljukordsus; gameetides on kromosoomikomplekte rohkem kui üks (n > x) ja diplofaasis (sügootides) rohkem kui kaks (2n > 2x).
Tsütokroom C hingamisahela ensüüm (mitokondri sisemembraan). Apoptoos -> läbi mitokondri. Kordamisküsimused 5. prax: 1. Millised taimeraku iseärasused takistavad taimerakke transformeerimast samamoodi kui loomarakke. Milliste tehnoloogiate abil sellest üle saadakse? Erinevalt loomarakust ümbritseb taimerakku paks tsellulooskest, mis on märksa tõsisemaks takistuseks kui lihtsalt membraan. Perhaps the most successful method involves the pathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens, which has the innate ability to transfer DNA to plant cells. In nature, this transfer results in formation of plant tumors (crown galls) at the infection site. Molecular biologists, however, have disarmed this bacterium and constructed domesticated strains that no longer cause tumors but transfer any DNA of interest to plant cells. The major disadvantage of the highly efficient Agrobacterium system is that it does not work with all plant species, most notably the cereals.
CO2 fix N2 fix Liik Acetobacter - + + + + Agrobacterium - + ? + + + Aquifex aeolicus + + +
their systems. Before 1971, the term, biotechnology, was primarily used in the food processing and agriculture industries. Since the 1970s, it began to be used by the Western scientific establishment to refer to laboratory-based techniques being developed in biological research, such as recombinant DNA or tissue culture-based processes, or horizontal gene transfer in living plants, using vectors such as the Agrobacterium bacteria to transfer DNA into a host organism. In fact, the term should be used in a much broader sense to describe the whole range of methods, both ancient and modern, used to manipulate organic materials to reach the demands of food production. So the term could be defined as, "The application of indigenous and/or scientific knowledge to the management of (parts of) microorganisms, or of cells and tissues of higher organisms, so that these supply goods
2) GMO-de ja neid või nende komponente sisaldavate toiduainete turustamise reguleerimine; Turustamist reguleerivad nt Codex Alimentarius (toidualane) ja Cartagena protokoll (keskk.). Nõutav on GM toidu märgistamine. EL'is on toidus sisalduva lubatud GM ainete määraks võetud 0.9 % (ilma märgistuseta). 3) GM põllukultuurides kasutatavad kodeerivaid järjestused - nimetada ja iseloomustada vähemalt kolme neist. 2-5A süntetaas: CP4EPSPS: pärit Agrobacterium tumefaciens'st, soodustab taimes kasvuks vajaliku ensüümi EPSPS sellise vormi sünteesi, mis on vastupidav herbitsiidi RoundUp suhtes e annab taimele herbitsiiditaluvuse. Cry1 Ab: pärineb bakterist Bacillus thuringiensis (Bt), kasutatakse Bt-maisi tegemiseks, annab taimele insektitsiidsed omadused (Bt toksiin). Pat: Bt-maisis, annab herbitsiiditaluvuse, pärinev mullabakterist. Geenidest cry, gox, bla, nptII Promootorjärjestus enamlevinud CaMV 35 s P-nos
5 http://www.eko.org.ee/gmo/index.php 6 http://www.gmo-free-regions.org/ 8 GMO'de tootmine GMO'de saamiseks lõikab restriktaas (,,ensüümkäärid") DNA-d spetsiifilistest kohtadest, plasmiidist (rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul) eraldatakse mittevajalikud geenid ja DNA ligaas (ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad) ühendab fragmendid. Doonororganismist eraldub uus geen, mis viiakse Agrobacterium tumefaciens'i. Uus plasmiid siseneb taime rakkudesse lehe lõikepinnal ja neid lehe lõike töödeldakse Agrobacterium'i (Gram-negatiivsesse perekonda kuuluv bakter, mis kasutab horisontaalset geenisiiret kasvajate põhjustamiseks taimedel) rakkude lahuses. Peale seda lehe lõige kultiveeritakse selektiivsöötmel, kus ellu jäävad ainult transformeeritud rakud, ning nendest kasvavad uut geeni sisaldavad taimed. 9
huvitava st DNA-frgmendist. Vektorina talitlev mikroob paljuneb organismis ja tema genoomis on ekspresseritud ka geenid, mis produtseerivad mõne patogeeni antigeene. Lisaks patogeenide antigeene produtseerivatele geenidele pn uuritud võimalusi kasutada vektoritena ka defektsete geenide asendamiseks normaalsete geenidega. Vektoriga liidetakse normaalne geen, mis viiakse organismi ja kompenseeritakse sellega vastava geeni defekt. 55. Agrobacterium` liigid kui vektorid geenide ülekandel taimedel. Agrobakter- spetsiifilise rõngaskromosoomiga bakter, mis suudab siseneda taimerakku ja «süstida» jupikesi oma DNAst taime DNAsse. Agrobakterid on teinud sellist geenikannet aegade algusest alates, nüüd on teadlased õppinud saatma agrobakteriga taimedesse neile meelepäraseid geene. Geen liigub rakutuuma tavalist tuumatransporti kasutades. Kromosoomi siseneb DNA tänu igas rakus toimuvale DNA- rekombinatsioonile.
molekulaarsed tšaperonid (ingl. Molecular chaperones)- Valgud, mis on abiks rakusiseste makromolekulaarsete struktuuride mittekovalentsel assambleerimisel/deassambleerimisel ja voltumisel/mittevoltumisel, kuid mida ei ole enam normaalse bioloogilise funktsiooniga struktuurides, kus voltumine või assambleerumine on juba toimunud. 8. Ti-plasmiidid, geenide ülekanne taimedel Ti-plasmiid (ingl. Ti plasmid)- Agrobacterium tumefaciens´i ja A. rhizogenes´i suur rõngasplasmiid, mis põhjustab taimedel kalluskasvajate (haiguste) induktsiooni ning mis on tähtsaks vektoriks geenide ülekandel (eriti kahekojalistesse) taimedesse. Plasmiidse DNA Agrobacterium’i vahendatud ülekanne vigastatud taime. Ti-plasmiidi kandev Agrobacterium meelitatakse atsetosüringooni abil (toodetakse vigastatud taime poolt) vigastuskohta.
Polüsahharidi pneumoniae uroonhapped G(-) Acetobacter xylinum Polüsahhariid Glükoos (tselluloos) Escherichia coli Polüsahhariid Glükoos, galaktoos, fukoos Pseudomonas Polüsahhariid Manuroonhape aeruginosa Azotobacter Polüsahhariid Glukuroonhape vinelandii Agrobacterium Polüsahhariid Glükoos tumefaciens Biofilmi moodustamiseks on kapsel hädavajalik. Kapsli abil bakter kinnitub pinnale ning moodustab enda ümber kaitsva limakihi, mis on suhteliselt kemoresistentne, hoiab vett ning kaitseb vaenlaste eest. Streptococcus pneumoniae'l kaitseb kapsel bakterit makrofaagide fagotsütoosi eest. Bacillus anthracis'el (katkutekitaja) kaitseb kapsel bakterit lüsosoomis lüsotsüümide eest. 2.2.5
53. Mille poolest erineb transgeense looma ja transgeense taime konstrueerimine? Taime rakkudel on teatud kemikaalide mõjul võime dedifferentseeruda. Mistõttu võib ükskõik millisest taime osast saada uue organismi. Loomade puhul nii teha (veel) ei saa. Rekombinantse DNA sisseviimiseks taimerakku on erinevaid meetodeid. DNA kas "tulistatakse" volframi või kullapartiklite koosseisus taimerakku, sisestatakse elektrivoolu abil (elektroporatsioon) või siis transformeeritakse taimerakke Agrobacterium tumefaciens Ti plasmiidide põhjal konstrueeritud rekombinantsete plasmiididega. Taimede geneetilisel manipuleerimisel on suureks abiks taimerakkude totipotentsus iga üksiku taimeraku võime dediferentseeruda embrüonaalseks rakuks, mis seejärel võib saada aluseks uue taime kasvatamisel. Kui diferentseeerunud taimekude viia kunstlikesse kasvutingimustesse, steriilsesse koekultuuri ja
suurte liigeste, nagu põlveliigeste põletik, (reumatoidartriit). Ilmneb ka väsimus, peavalud, võib ilmneda ka närvihalvatusi. Order (Selts) Ricketsiales (riketsiad) Riketsiad on Gram- negatiivsed obligaatsed intratsellulaarsed parasiitsed bakterid, mis kanduvad inimesele üle puukide ja teiste putukate vahendusel. Nad paljunevad ainult elusrakus. 16SrRNA järjestustelt kuuluvad alfa-proteobakterite hulka. Sellest rühmast on riketsiad kõige lähedasemad perekonnaga *Agrobacterium, kes tekitab taimedel kasvajaid. Nende 16SrRNA järjestused on ca 95% sarnased. Seega arvatakse, et riketsiad võivad olla evolutsioneerunud taimepatogeenidest. Riketsiad paljunevad pooldumisega, generatsiooni aeg ca 8 t. Parasiteerivad selgroogsete loomade erütrotsüütides, retikuloendoteelirakkudes ja veresoonte endoteelirakkudes. Neid leidub ka verd imevates putukates (puugid, täid, kirbud), kes võivad olla nii vahe- kui ka lõpp-peremeheks
saadakse erineva pikkusega DNA fragmendid - Isaduse tõestamine - kohtumeditsiinis 2. Kaasaegse geneetika rakendusalad põllumajanduses. Transgeensed organismid. Organismi kloonimine. 1 Tänapäeval on paljud taimesordid geneetiliselt modifitseeritud, ehk need sordid sisaldavad lisageene. GMO – transgeenselt modifitseeritud organismid Sordiaretus: Üks võõraste geenide ülekande põhimeetodeid seisneb bakteri Agrobacterium tumefaciens’i Ti-plasmiidi vahendatud geenide ülekandes taimedesse. GMO-de kasutamine on tänapäeval rahvusvaheliselt ja riigiti küllalti rangelt kontrollitud. Põhjuseks potentsiaalne biooht: GMOde kontrollimatu levik looduses, mitteteadaolevate allergiliste või toksiliste ainete süntees või ravimiresidentsusgeenide horisontaalne looduslik ülekanne. Tootmiseks soovitatud taimedel neid kahjulikke mõjusid siiani veel kindlalt tõestatuna pole avastatud. Transgeensed taimed:
Levaani sünteesitakse rakukestaga seotud ensüümi levaansukraasi abil. Ka levaan võib osaleda kaariese tekkel. Ka paljud taimedega koos elavad bakterid (Zymomonas mobilis, Acetobacter diazotrophicus, Pseudomonas syringae jt) toodavad sahharoosist levaani. Levaan aitab neil taimedele kinnituda, hoiab niiskust ja on ka rakuväliseks varuaineks. c. Tselluloos. Ei ole populaarne. Acetobacter xylinum, Sarcina ventriculi, Agrobacterium, Phizobium, E. coli. 2. Heteropolüsahhariidsed. Streptokokkide kapsel koosneb hüaluroonhappest. Hüaluroonhape on heteropolüsahhariid, milles on tuhandeid suhkrujääke. Koosneb glükuroonhappest ja NAG-st. Hüaluroonhape on inimesele omane aine (sidekude, liigesed jne). Seega on sellise kapsliga bakter vähe immunogeenne teda ei tunne inimene ära kui võõrast. Arvatakse, et bakter on saanud need geenid inimeselt, kuna inimesele on hüaloroonhape iseloomulik. 3
Sekretsiooniaparaat koosneb ligikaudu 20 erinevast valgust. Sekretsioon algab pärast aktiveeriva signaali saabumist; sageli tulevad signaalid märklaud-rakkudelt. Eraldi sekretsioonisüsteemina (tüüp V) on käsitletud sekretsioonisüsteemi, mille abil toimub näiteks DNA ja valkude liikumine rakust rakku. Süsteemi kuulub ligikaudu 10 valku, mis võimaldavad plasmiidide konjugatiivset ülekannet rakust rakku graam-negatiivsetel bakteritel, onkogeense T-DNA ülekannet taimerakku bakterilt Agrobacterium tumefaciens. 25 7. Globaalne geeniregulatsioon bakterirakus Bakterite elukeskkonna tingimused on muutlikud. Muutused, millega näiteks E. coli peab kohanema, on järgmised: 1. Sattumine toitaineterikkast kasvukeskkonnast toitainetevaesesse keskkonda 2. Kasvuks vajaliku C-allika asendumine teisega 3. Aminohapete hulk on limiteeritud 4. Aeroobse kasvukeskkonna asendumine anaeroobsega või vastupidi 5. Temperatuuri shokk 6
- seejärel V-D ühendus - inimeses ≈ 300 lambda perekonda V geeni ja ˃ 6 J-C geeni - ≈ 300 lambda perekonda V segmenti 1-5 J segment ja 1C segment (erinevad kombinatsioonid) - boosting – immuunvastuse tugevnemine (mutatsioonide sündmus) T-DNA eriline somaatiline rekombinatsioon, taime ja temaga koos oleva mikroobi vahel. Taim kasvab seal, kus ei peaks (nt pole substraati); mükoriisa puhul seened aitavad (taim seenelt vett ja mineraalaineid, seen taimelt orgaanilisi aineid). Nt Agrobacterium – koloniseerib taime juuri. Saadab oma DNA taimerakku, kus DNA hakkab taime instrueerima uute ühendite sünteesiks, mida tavaliselt taim ei tee. Bakteri annab osa plasmiidist, mis läheb peremeesraku tuuma, siseneb tema kromosoom ja hakkab seal paljunema. Vasakpoole järjestus jääb bakteri plasmiidi, parempoolne kordusjärjestus läheb taimeraku tuuma. Taim hakkab tootma nopaliin ja oktapiin (ained, mis on bakterile söögiks).
(i.e., promoters and terminators). Most com- It is based on the Luminex xMAP technol- mercially approved GMOs have been trans- ogy, and two different sets of fluorescent formed using constructs containing sequences beads are cross-linked to the specific oligo- from the Cauliflower Mosaic Virus (CaMV, nucleotide probes previously amplified and i.e., 35S promoter [P-35S] and/or 35S termi- labeled by polymerase chain reaction (PCR) nator [T-35S]) or from Agrobacterium tume- in the presence of a biotinylated nucleotide. faciens (i.e., nopaline synthetase terminator However, an important aspect that must [T-nos]). Screening methodologies have also be considered prior to routine use of these traditionally used selectable marker genes techniques in food analysis is the validation that encode proteins that confer herbicide of their performance through use by the sci- or antibiotic resistance (Draper and Scout
annaabi.ee 
