Lähteained: Rekombinantne DNA (~100 ng/l) Restriktaas Cfr42I (SacII) (10u/l, Fermentas; http://www.fermentas.com/; vt lisa) Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver Molekulmassi marker (DNA, 1 kb või 100 bp "ladder"; 100-200 ng raja kohta) H2O 10 x PCR puhver (Fermentas) 25 mM MgCl2 Taq DNA polümeraas, 5 u/l (Fermentas) 2 mM dNTP (Fermentas) T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/l Töö käik: A: Restriktsioon ei tee (1) Saadud rekombinantse DNA restriktsiooniks Cfr42I-ga: võta ~500 ng miniprep DNA-d (5 l), lisa 4 l H2O-d ja 1 l 10 x puhvrit (kokku 10 l). Jaga lahus kahte tuubi (5 l mõlemasse), ühte lisa restriktaasi (0,5-1 l) ja teise mitte
Lähteained: Rekombinantne DNA (~100 ng/l) Restriktaas Cfr42I (SacII) (10u/l, Fermentas; http://www.fermentas.com/; vt lisa) Restriktaasi 10 x puhver (lisatakse 1/10 reaktsiooni mahust) Agaroos (FMC) 1 x TBE foreesi puhver (TBE, 50 mM Tris-boraat, pH 8,3; EDTA-Na2) 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver Molekulmassi marker (DNA, 1 kb või 100 bp "ladder"; 100-200 ng raja kohta) H2O 10 x PCR puhver (Fermentas) 25 mM MgCl2 Taq DNA polümeraas, 5 u/l (Fermentas) 2 mM dNTP (Fermentas) T3 ja T7 RNA polümeraasi promootori praimerid AATTAACCCTCACTAAAGGG ja TAATACGACTCACTATAGGG, 100 ng/l Töö käik: A: Restriktsioon (1) Restriktsioon: 1) 20 µl plasmiidsed DNA-d 22 µl 2) 2 µl 10x restriktaasi puhvrit Saadud 22 µl lahust jagan kaheks tuubiks, mõlemad 11 µl. Ühele tuubisse lisan 1 µl Cfr 421, teisele ei lisa, see on kontroll proov
welovelenses.com/e n/swimming-goggles/swimming-goggles/swimmi/swimmi-sighted-swimming- goggles.html&docid=vaXzc7v_dsmC4M&imgurl=http://d3e93btz6by8mj.cloudfront.net/images/gallery/49-swimming-goggles-1- 710x360.jpg&w=710&h=360&ei=rbOFUO5mwa3RBdibgKAE&zoom=1&iact=hc&vpx=668&vpy=137&dur=6151&hovh=160&hovw=315&tx= 129&ty=78&sig=105712388009929426814&page=1&tbnh=136&tbnw=269&start=0&ndsp=13&ved=1t:429,r:8,s:0,i:87 http://www.google.ee/imgres?hl=et&client=firefox- a&hs=taQ&sa=X&rls=org.mozilla:et:official&biw=1024&bih=575&tbm=isch&prmd=imvns&tbnid=fUftx5uMSXxDcM:&imgrefurl=http://wond erfulmachine.tumblr.com/post/28927978745/happy-swimming-photo-by-john- sibilski&docid=XK1T1wHFdz14gM&imgurl=http://25.media.tumblr.com/tumblr_m8ejdyG6S91r7hmrgo1_500.png&w=500&h=332&ei=yLaFU O8dlKnQBe7wgKgE&zoom=1&iact=rc&dur=3748&sig=105712388009929426814&page=3&tbnh=136&tbnw=199&start=37&ndsp=19&ved=1t :429,r:31,s:20,i:221&tx=110&ty=73 http://www.google.ee/imgres
a) Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) b) DNA kloonimist plasmiidi ja paliundamist bakterite abil c) DNA keemiline süntees d) Western blot 20. Milline järgnevatest ensüümidest hoiab ära restriktaasiga avatud vektorplasmiidi retsirkulatsiooni kloonimise käigus: a) Veise soole fosfataas (calf intestine phosphatase-CIP) b) T4 DNA ligaas c) DNA polümeraas I Klenowi fragment d) Taq DNA polümeraas e) AMV pöördtranskriptaas Kontrolltöö 2. 1. Milliseid eelteadmisi on vaja meid huvitava ensüümi omaduste muutmiseks ratsionaalse (re)disani meetodil? a) Ensüümi aktiivtsentri ja toimemehhanismi tundmine b) Selektsioonisüsteemi olemasolu mutantide valikuks c) Võimalus rekombineerida erinevatest homoloogsetest organismidest pärit ensuume d) Valgu 3D struktuuri tundmine 2
- annealing 15. Millist kliinilist materjali saab kasutada PCR meetodil haigustekitaja tuvastamiseks?- röga, lima, seemnevedelik (DNA) 16. Millised on etapid haigustekitaja tuvastamiseks kliinilisest materjalist PCR meetodil?-algmaterjalisd DNA eraldamine ja puhastamine; PCR reaktsioon; restriktsioon; tulemuste visualiseerimine geelelektroforeesil 17. Nimeta PCR jaoks vajalikud komponendid?- DNA->praimerid->nukleotiidid->ensüüm Taq-> puhver ja MgCl 18. Mis on praimer ja milleks seda vaja on?- 15-30 nukleotiidi pikk üheahelaline DNA lõik; vajalik komplementaarsuse tõttu saavad seonduda uuritava DNA molekulile ja selle tähistada 19. Mille poolest erineb multiplex PCR tavalisest PCR-ist?-sama PCR ajal kasutatakse mitut praimerite paari, mitme erineva mikroobi tuvastamiseks samast DNA proovist 20. Mille poolest erineb real-time PCR tavalisest PCR-ist?- võimaldab hinnata algmaterjali kogust, nt.
Metüleerimise abil kaitstakse DNA restriktsiooni eest. Nii nt.kaitseb E.coli oma genoomset DNA enda poolt toodetud restriktaaside eest. Sellega võib manipuleerida: välja lülitada kloonimisel, et oleks võimalik DNA lõikamist restriktaasiga selleks, et sinna ehitada huvipakkuva DNA järjestust. 3. Võrdle omavahel järgnevate E.Coli ensüümide omadusi. DNA polümeraas I Klenow fragment Sequenase Taq polümeraas 5' 3' DNA-sõltuv polümeraasne aktiivsus DNA polümeraasi ,,mutantne" vorm. 5' (on vaja praimeri) 3' polümeraasne aktiivsus. 3' 5' eksonukleaasne aktiivsus (DNA parandamine) DNA sünteesil 5' 3' Tömbi otste Kasutatakse Kasutatakse eksonukleaasne saamiseks. peamiselt peamiselt PCR-
uuritavat DNA fragmenti. See meetod on loodud ülilihtsal põhimõttel: temperatuuride muutmisel. Selleks on PCR-masin, millesse asetatakse 0,2 ml-sed tuubid DNA-proovidega ja käivitatakse programm, mis automaatselt kuumutab-jahutab kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike järel. (PCR) vajalikud komponendid (joonis 5.2.2.4.): DNA proov, mida uuritakse; DNA-plümeraas, täpsemalt on see kuumaveebakteri nimest tulenev Taq-polümeraas; Nukleotiidid – A, G, C, T, mida läheb DNA molekuli sünteesiks vaja; 2 praimerit (tavaliselt 15–25 nukleotiidi pikkused DNA lõigud ), millest üks on komplementaarne uuritava DNA-lõigu ühe otsaga ja teine on komplementaarne teise otsaga; puhverlahus, mis on keskkonnaks. PCR ETAPID 1) tuubis oleva dna denatureerimine. Temperatuur tõstetakse 90–95 °C juurde, mille käigus DNA biheeliks laguneb kaheks üksikahelaks -
E. doonor H2, aktseptor Fe(III), Mn(IV), S Redutseerib sulfaati, kasutab selleks org. ühendeid või H2. Lipiididel eetersidemed. Ferredoksiinist sõltuvad CO2 fix reaktsioonid. E. doonor H2S, H2, aktseptor CO2. Anoksügeenne. CO2 fix hüdroksüpropionaadi rada. Omab välismembraani. Punase värvusega (karotenoidid). Väga vastupidavad. Thermus aquaticus (Taq-polümeraas). Unikaalne rakumorfoloogia ja liikumine (endoflagellid e aksiaalsed filamendid). Suudab elada ilma rauata. Põhjustab borrelioosi. Põhjustab süüfilist. Assimileerib org. ühendeid redutseerivate S-ühendite juures. Anoksügeenne. CO2 fix pööratud trikarboksüülhapete tsükli abil.
antigeen olemas. hemaglutiniini inhibitsioon – antikeha uuring, gripiviirus, paragripp, adenoviirus – seerumist 2x lahjendused, igasse 4 hemaglutineerivat antigeeni ühikut, lisame erütrotsüüdid. 19. Molekulaarbioloogilised uurimismeetodid (PCR) PCR – tundlik ja efektiivne. Mullis. 1 päevaga tulemused, lihtne, algmaterjali vaja vähe – koguaeg 2kordistub, pole vaja radioaktiivseid elemente (nt blottimisel on vaja). Vaja 2 praimerit, Taq polümeraasi. Töötsükkel: kokku 25-30x 1. DNA denaturatsioon – 92 kraadi 2. praimeri seondumine – 50 kraadi 3. Taq polümeraasi tööks – elongatsioon – 72 kraadi. Jäämäe konseptsioon: jäämäe alumine osa – ei märka mitte midagi, subkliiniline, haigusnähud puuduvad, neid põhjustavad defektsed viirused. jäämäe pealne osa – ilmekad haigustunnused, loomad paranevad ise multisüsteemsed haigused – põhjustavad varieeruvat pilti.
sünteesitud lühikesed 1-ahelalised DNA-lõigud(praimerid). Protsess on automatiseeritud vastava aparaadi, termotsükleri ja sellega ühendatud arvuti abil. Reaktsiooni 1 tsükkel kestab u 1min, tunni ajaga võib saada miljon koopiat. Reaktsioonisegus on uuritava isiku proovist eraldatud üliväike DNA kogus, desoksüribonukleotiidtrifosfaate, praimerid ja DNA polümeraas. Automatiseerumise on võimaldanud kuumaveebakterilt pärit nn Taq- polümeraas, mis säilitab aktiivsuse kuni 100 kraadi juures. Saadud DNA fragmendid lahutat mikrokapillaarsel elektrofeesil pikkuse erinevuse järgi. 51. Kromatograafia Käib laboratoorsete füüsikaliste-keemiliste meetodite kohta, kust lastakse läbi mitteliikuva või väheliikuva faasi vedelat või gaasilist vedelikku või segu ja siis tänu sellele jagunevad lõpuks ained erinevalt...tekivad erineva kiirusega komponentide grupid..
praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. 3. DNA süntees. Kui praimerid on amplifitseeritava DNA järjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, sünteesib termostabiilne DNA polümeraas praimerite 3' otsast alates mõlemale DNA üksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72 °C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq polümeraasi. Neid tsükleid korratakse 2030 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule. 45. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat? PCR on muutnud DNA kloonimise muutnud palju kiiremaks ja lihtsamaks. PCR abil saab haiguste diagnostikat teha palju väiksema koguse DNA-ga. Üheks tähtsaks PCR-i kasutusalaks on võimaliku AIDS-i nakatumise diagnoosimine väga varajases staadiumis juba enne antikehade teket
b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed, seega vektori ja inserdi ,,kleepuvad otsad" ühendatakse komplementaarsusprintsiibi alusel kõigepealt vesiniksidemetega, seejärel saab ligaas sünteesida fosfodiestersidemed. Polümeraasi valikul tuleb silmas pidada, et tegemist oleks Taq Polümeraasiga, mis lisab suure tõenäosusega 3' adeniini aluse, mis on vajalik T-A kloneerimiseks. c) Vektoril on kaks antibiootikumiresistentsust, seega rakke, kuhu plasmiid on transformeeritud, saab kasvatada nii ampitsilliini, kanamütsiini kui ka mõlemat sisaldavad keskkonnas seeläbi saab vähendada ohtu, et plasmiidi mitte sisaldavad rakud tekitavad saaste.
reaktsiooni läbi viivad ensüümid üldse samast organismist. Tavaliste eukarüootide ja prokarüootide endüümid lihtsalt ei peaks vastu temp-ile, mida PCRil kasutatakse ning häviks. Seetõttu kasutataksegi kasvavate bakterite ja arhebakterite DNA polümeraasi. Prokarüoodid (eriti arhed) elavad sageli väga ekstreemsetes tingimustes ja osad nendest kohanenud kasvuks nt. Kuumaveeallikates. Taq-polümeraasi PCR-i jaoks saadaksegi ühelt selliselt bakterilt. See polümeraas lisab DNA ahelasse u 100 nukleotiidi/sek, nii et sünteesifaasi pikkus varieerub sõltuvalt sünteesitava DNA fragmendi pikkusest. Pärast sünteesi segu uuesti kuumutatakse 94 kraadid ja algab uus PCR tsükkel. Kogu protsess (u 20 korda) võtab paar tundi. PCR piirangud – enne kui mingit DNA lõiku paljundada, peame teadma vähemalt
240 μM) – sisaldab 4 liiki nukleotiide 1 μl 10 μM Reverse ja 1 μl 10 μM Forward praimerit (lõppkonts. 0,5 μM) – komplimentaarsed vastassuunaliste ahelate otsadele 0,2 μl 25 ng/μl template-DNAd (lõppkonts. 0,25 ng/μl) – sisaldab DNA osa, mida on vaja paljundama 0,1 μl 5 U/μl HotFIRE Pol Polümeraasi (lõppkonts. 0,5 U/μl) – katalüüsib PCRi, peab säilitama oma aktiivsust kõrgel temperatuuril. Taq polümeraasid ei oma proof- reading aktiivsust (3’ – 5’ exonukleaasset aktiivsust), seega neil puudub võime kord valesti lülitatud nukleotiidi õigega asendada. See on tähtis TA-kloneerimisel, kuna meil on vaja, et moodustaksid sobivad restriktsioonisaidid edasiseks kloneerimiseks, kus 3’ otsas on adeniin ja 5’ otsas on tümidiin ning vektori ja inserdi ligeerimisel toimub A-T otste paardumine. 2
jätkata. 4. Praktikum – Rekombinantse plasmiidi ligeerimine Selleks, et meid huvitava amplifitseeritud DNA paljuneda, on vaja teda sisestada vahuvektorisse(plasmiidi). Selleks on vaja kokku ligeerida meie järjestus (L-Desmo) ja pSTBlue-1 vektor. Selle praktikumi käigus kasutasimi vektorit, mis oli enne lõigatud niimodi, et kleepuvad osted sisaldasid T-otsad. Taq polümeraas ei oma eksonukleaarset aktiivsust, sellega suure tõenäosusega lisab iga PCR produkti sabale lisa A-nukleotiidi. Sellega meil on ilusti kokku kleebuvad otsad: inserti A sabad on komplementaarsed vektori
auratiacus, Thermoactinomyces vulgaris, Clostridium thermocellum. Neid saab isoleerida näiteks kuumenevatest kompostihunnikutest ja kuumenevast mullast. Paljudel neist on on termoresistentsed dipikoliinhapet sisaldavad endospoorid. Termofiilsed on ka osa laktobatsillide liike. L. lactis, L. delbrückii, L. bulgaricus. Nende bakterite Tmax on ca 50-53 oC. Ka metanogeenide hulgas on termofiile. Näiteks Methanopyrus. Thermus aquaticus- tema DNA polümeraas (Taq polümeraas) on põhitööriist PCR tehnoloogias. Termofiilide iseärasused Rakud on väikesed, spooritaolised Vaba vee sisaldus rakkudes väike Rakukomponendid uuenevad kiiresti. Toitaineterikkal söötmel (söötmes on aminohappeid, suhkruid jne.) on rakud termotolerantsemad kui vaesel söötmel (lihtsam uuendada rakukomponente) Kromosoomi koopiaarv on suurem kui 1. See võimaldab kahjustunud DNA parandamist homoloogilise rekombinatsiooniga
Kui praimerid panna koos denatureerunud sihtmärk-DNA-ga lahusesse, seostub üks praimer ahela ühele spetsiifilisele kohale (sait S1), samas kui teine ahela teisele kohale (sait S2). Praimerite seostumise protsess toimub temperatuuril ≥50º-58ºC. KOMPLEMENTAARSE AHELA SÜNTEES. Praimer ja üheahelaline DNA koos moodustavad kompleksi (primer extension). Komplementaarse ahela sünteesiks kasutatakse Taq-polümeraasi, mis on suuteline sünteesima komplementaarset ahelat kõrgel temperatuuril (72ºC), samuti ei denatureeru ta korduvate tsüklite vältel 94ºC juures. Igast sihtmärk- DNA-st tekib esimese tsükli järel 2 ahelat, järgmises tsüklis tekib kahest ahelast 4, kolmanda tsükli ajal neljast ahelast 8 jne. Kasv toimub geomeetrilises progressioonis. 30-40 tsükli vältel tekib 107-108 uut koopiat. PCR PRODUKTI DETEKTEERIMINE toimub geel-elektroforeesiga. Peale elektroforeesi geel
praimeri nukleotiidsest järjestusest 3. DNA polümeraas muudab praimeritevahelised üksikahelalised lõigud kaheahelalisteks, tavaliselt 70-72 kraadi juures 90 sekundit PCR- meetod võimaldab oluliselt lihtsustada DNA- järjestuse analüüsi, sest uuritava materjalina on võimalik kasutada üliväikest DNA hulka. Tänapäeval kasutakse Taq- polümeraasi. Kasutatakse DNA amplifitseerimiseks in vitro tingimustes. 46. Kuidas on polümeraasi ahelreaktsioon muutnud geenitehnoloogiat? PCR võimaldab oluliselt lihtsustada DNA-järjestuste analüüsi, sest uuritava algmaterjalina on võimalik kasutada üliväikest DNA hulka. Kiirendab sekveneerimist. Saab teha miljoneid DNA koopiaid mõne tunniga. Muudes valdkondades: bioloogilise isaduse tuvastamine, kohtueskpertiisides, suguhaiguste diagnoosimisel. 47
füüsikalises distantsis fluorokroomi ja vaigistaja (quencher) vahel pärast proovide hübridisatsiooni. FRET (fluoresence resonance energy transfere) tehnika -Iga SNP vajab spetsiaalpraimereid -Kõige efektiivsemad väheste SNP-de ja suure hulga proovide puhul Introduction to TaqMan® probes TaqMan® probes are dual labeled hydrolysis probes and are a registered trademark of the Roche Molecular Systems, Inc. TaqMan® probes utilize the 5' exonuclease activity of the enzyme Taq Polymerase for measuring the amount of target sequences in the samples. TaqMan® probes consist of a 18- 22 bp oligonucleotide probe which is labeled with a reporter fluorophore at the 5' end and a quencher fluorophore at the 3' end. TaqMan® probe functioning While carrying out a TaqMan® experiment, a fluorogenic probe, complementary to the target sequence is added to the PCR reaction mixture. This probe is an oligonucleotide with a reporter dye attached to the 5'
5. plasmiid viiakse bakterirakku, bakter kasvab ja plasmiid paljuneb 6. paljundatud geen isoleeritakse plasmiidist. 7. Milleks kasutatakse polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on PCRi põhietapid? Kasutatakse uuritava DNA lõigu paljundamiseks in vitro.Geenide polümorfismi detekteerimine. Vajatakse: * kaks praimerit – peavad olema komplementaarsed uuritava DNA ahelate otstega * maatriks * termostabiilset Taq polümeraasi * vabu nukleotiide * puhvrit. Põhietapid: 1. DNA denaturatsioon üheahelaliseks (95 kraadi) 2. praimerite seondumine (50 kraadi) 3. DNA elongatsioon (72 kraadi). Tsükliline protsess – kokku 30 tsüklit. Uurimismaterjal: veri, karvad (karvasibul), sperma, limaskesta rakud, koeproov. 4. 8. Milleks kasutatakse kvantitatiivset polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR), milliseid põhikomponente selleks vajatakse, millised on RT-PCRi põhietapid?
Kvaliteedikontrollile alternatiive pole. 1. Valideerimise üks osa on laboritevahelised võrdluskatsed, mida viib läbi organisatsioon QCMD. 10. Millised ja millal tehtud avastused olid eelduseks molekulaardiagnostika meetodite väljaarendamisele ? (Nimetage mõned teie arvates olulisemad) 1869 DNA avastamine 1953 kaksikheeliks 1969/70 ensüümid restriktaasid PCR 1989 Taq polümeraas kaksikheeliksite de- ja renaturatsioon nukleotiidide komplementaarsus 11. Milliseid molekulaardiagnostika meetodeid kasutatakse Eestis nakkushaiguste diagnoosimisel? Hübriidimine (sh FISH) PCR sekveneerimine mikrokiip-analüüs 12. Milliseid meetodeid kasutatakse patogeensete mikroorganismide tuvastamiseks (mikroskoopia, isoleerimine ja kultiveerimine, biotestid, immunotestid s.o antigeeni
3. DNA Fingerprinting 4. Ühe nukleotiidi polümorfism (SNP) Kuidas PCR töötab: DNA koos amplifitseerimist vajava lõiguga ja kaks sünteetilist oligonukleotiidist praimerit, mis on komplementaarsed lõigu algustega. Denatureerime DNA kaksikahela üheahelaliseks kuumutades 94°C. Kiiresti jahutada DNA (37-65°C) ja liita praimerid soovitava lõigu otsa külge (komplementaarne otsa nukleotiidiga). Nüüd ahela süntees 70-75°C juures kasutades termo-resistentset DNA polümeraasi (nn. Taq polümeraas saadud Thermus aquaticus'elt). Sama protseduuri (denaturatsioon, liitmine ja ahela süntees) korrata 20-45 korda (s.o. 1 million kuni 35 trillionit koopiat). Jahutame 4°C ja säilitame paljundatud DNAd analüüsideks. Kaasaegne automatiseeritud sekveneerimine fluorestseeriva märgiga: 4 värviga märgitud nukleotiidid ühes tuubis ja foreesitakse ühel joonel polüakrüülamiid geelis või siis kapillarides, millistes on geel. UV laser detekteerib värvid ja loeb järjestuse
r,S a aaN o (h (uvJ, bjl !6d cglrpar! 6HH! - hn li ---taq! ^ .i - -(, P :J)EtQc, rl t- ! '))'D bjl -)l(J^v Gt.-d a,!-Y ! 3 *a PE!P ')
7 requires terminal transferase; 8 (DNA) ligase needed to seal nicks in DNA backbone; 9 ref to join phosphate - sugar / adds phosphate; 10 DNA may be produced by reverse transcriptase; 11 from mRNA; 12 single strand made double stranded by DNA polymerase; 13 wanted DNA replicated by polymerase chain reaction (PCR); 14 using, DNA polymerase with high optimum temperature /Taq polymerase; 15 AVP; max 8 QWC - clear, well-organised answer using specialist terms; 1 award QWC mark if three of the following are used endonuclease terminal transferase reverse transcriptase (DNA) ligase DNA polymerase PCR correct use of nucleotide and base sticky ends
annaabi.ee 
