kõige kuluefektiivsem. Küüliku retikulotsüüdi ekstrakt Küüliku retikulotsüütide lüsaat valmistatakse aneemiliste küülikute retikulotsüütidest ja dialüüsitakse. Lisatakse AH, ATP, GTP ja energia regeneratsiooni süsteem.Sünteesitavaid valke analüüsitakse geelelektroforeesiga. Kuidas teha rakuvaba valgusünteesi süsteem sõltuvaks lisatavast mRNAst Tehes lüsaadile nagu restardi, paned lahusesse Ca-sõltuva nukleaasi (RNaas?), sellega vabaned üksnes endogeensest mRNA-st (mitte aga rRNA-st), siis lisad EGTA, mis aktiveerib lüsaadi. Millised on fraktsioneeritud valgusünteesi süsteemid ja mida need sisaldavad. Bakteriaalsed ribosoomid, mRNA, tRNA, S-100 valgufraktsioon, Foolhape (tetrahüdrofolaat), aminohapped, ATP, GTP, energia regeneratsioon SH reagent, Mg2+, K+ või NH4+ DNA sõltuvad valgusünteesi süsteemid DNA suunatud valgusüntees. Seda süsteemi saab
Mõned neist osalevad ka mRNA degradatsioonil. Vastavalt sellele, kas nad lõikavad RNA molekulide sisemistesse järjestustesse, lõhkudes fosfodiestersidemeid või lagundavad RNA molekule otsast, jaotatakse RNaase endo- ja eksoribonukleaasideks. Eksoribonukleaasid Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3' 5' suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase. Põhilised mRNA-d degradeerivad eksoribonukleaasid on polünukleotiidi fosforülaas ja RNaas II. Juhul, kui degradatsiooni käigus ei tule ette ületamatuid sekundaarstruktuure, jäävad algsetest mRNA molekulidest järele ainult lühikesed, 10 20 nt-pikkused oligonukleotiidid molekulide 5' otstest. Tekkinud oligod degradeerib RNaas I. Paljudel mRNA-del on 3' otsas juuksenõelastruktuur, mis on mRNA-d stabiliseeriva toimega. Arvatakse, et see juuksenõelastruktuur ei pruugi alati sugugi olla
denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus? RNaasi töötlus aitab veelgi puhtamaks saada puhastatavat DNA lahust. RNaas lagundab RNA rakkudes. 11. Millist tüüpi restriktaase kasutame? tüüp 2 - lõike- ja seondumissait kattuvad. Lõikavad vaid dsDNA-d (ainult ds lineariseerub, ss jääb tsirkulaarseks - tsirkulaarne jookseb geelil kiiremini - saab neid eristada). Tunneb ära 6-nukleotiidilise järjestuse GAATTC. Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema?
ensümaatiline hüdrolüüs happeline hüdrolüüs (DNA, kaasneb depuriinimine) aluseline hüdrolüüs (RNA) Nukleaasid Ensüümid, mis katalüüsivad fosfodiestersideme hüdrolüüsi Funktsioone nukleiinhapete degradatsioon kahjustuste, võõra DNA sissetungi korral jm Mõned nukleaasid on DNA või RNA spetsiifilised, mõned järjestusspetsiifilised, mõned mittespetsiifilised DNaas desoksüribonukleaas, hüdrolüüsib DNA molekule RNaas ribonukleaas, hüdrolüüsib RNA molekule Nukleaasid Vastavalt hüdrolüüsitava sideme asukohale jaotatakse nukleaasid: Eksonukleaasid katalüüsivad terminaalse nukleotiidi eemaldamist 3´ eksonukleaasid 5´ eksonukleaasid Endonukleaasid katalüüsivad ahelasisese fosfodiestersideme hüdrolüüsi produktiks 3´ fosfaadiga nukleotiid produktiks 5´fosfaadiga nukleotiid Nukleaasid
tekib teistsugune ruumiline struktuur. Ruumilise struktuuri teket suunab ja mõjutab chaperoni valgud. Suunavad valkude voltumist sünteesi käigus – aitavad sünteesile kaasa või katkestavad lõpliku ruumilise struktuuri teket enne kui valk on oma sihtkohta viidud. Väiksemate valkude ruumiline 7 struktuur tekib iseenesest sünteesi käigus ja ei vaja lisafaktoreid (ruumilise struktuuri tekkeks vajalik info valgu primaarstruktuuris). Ribunukleaas A (RNaas A) – denatureerida (kuumutamise, keemiliste ainetega), jääb primaarstruktuur muutumatuks, lagunevad vaid nõrgad sidemed, mis ruumilist struktuuri kinni hoidsid. Renatureerub kui on sobivad kofaktorid – valgu ligandid, mis stabiliseerivad tema struktuuri. Nt metalli ioonid (moodustavad valgu struktuuris koordinatiivseid sidemeid). Renatureerimist kiirendavad ensüümid – valgu disulfiidi isomeraas, peptidüül-prolüül isomeraasid – kiirendavad disulfiidsidemete vahetust või
1 h ja seda inaktiveeritakse phenol extraction. Alkaalne fosfataas ,,CIP": fosfataas, mis eemaldab 3´ ja 5´ fosfaatrühmad DNAst ja RNAst. Hüdrolüüsib NTPd ja dNTPd. Kasutatakse kloonimisel, et vältida korduvat ligeerimist (Aga seda raske väljalülitada, võib häirida ligeerimist). Võib kasutada ka dNTP lõhutamiseks PCR reaktsioonis, et valmistada DNA sekveneerimiseks või SNP analüüsiks. Rnaas H: Lõhustab heterodupleksis (RNA/DNA) olevat RNA. Tulemusena moodustub üheahelaline DNA. Nukleaas S1: Lõhustab üheahelalist DNA ja RNA, moodustades 5´fosforüülitud mono- ja oligonukleotiide. 5. Millised omadused peavad olema plasmiididl, et ta saaks toimida kui kloonimise vektor? Antibiootikume resistentsust kodeeriv geen (ampitsiliin või tetratsükliin Väike suurus
Chaperonid suunavad enamuse valkude voltumist sünteesi käigus. Mõnede (peamiselt väiksemate, alla 150 aminohappe jäägist koosnevate) valkude ruumiline struktuur tekib iseeneset sünteesi käigus ja ei vaja 8 lisafaktoreid. Sel juhul on kogu ruumilse struktuuri tekkeks vajalik informatsioon olemas valgu primaarstruktuuris. Üks hästiuuritud näide on ribonukleaas A (RNaas A). Kui RNaas A molekul denatureerida st. lõhkuda tema ruumiline struktuur kas kuumutamise või keemiliste ainetega, siis jääb valguahela primaarstruktuur muutumatuks ja lagunevad ainult nõrgad sidemed, mis hoiavad valgu ruumilist struktuuri. Sobivates keskonnatingimustes tema aktiivne konformatsioon taastub. Seda protsessi nimetatakse valgu renatureeumiseks. Mõnede valkude renatureerimiseks on vajalikud kofaktorid, valgu ligandid, mis stabiliseerivad tema ruumilst struktuuri.
on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. 8 (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks: - lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 l) (tõmbe all!!!) - tsentrifuugi 1-2 min - kanna vesikiht uude tuubi (~100 l). Vesikihis on DNA ning valgud (RNaas) jäävad fenoolkihti ja vahekihti - DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 l) NaOAc ja 3 mahtu (300 l) 95% etanooli - sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min DNA Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt
kiirus. Teatavad sekundaarstruktuurid stabiliseerivad mRNA-d, osa on aga substraadiks endonukleaasidele. Paljudel mRNA-del on 3' otsas juuksenõelastruktuur, mis on mRNA-d stabiliseeriva toimega. Erinevalt eukarüootidest on bakteritel kirjeldatud ainult 3' 5' suunas mRNA-d lagundavaid eksoribonukleaase. Endonukleaaside poolt teostatavad atakid määravad sageli mRNA degradatsiooni edasise kiiruse, kuna aitavad kõrvaldada mRNA 3' otsast juuksenõelastruktuure. RNaas E on üks põhilisi mRNA degradatsioonil osalevaid endoribonukleaase. See ttunneb ära spetsiifilisi sekundaarstruktuure, kuid lõikab nende kõrvalt üksikahelalist RNA-d, mille puhul on erinevate mRNA-de degradatsiooni uurides pakutud välja erinevaid konsensusjärjestusi. RNA I 5' otsas olev juuksenõelastruktuur stabiliseerib RNA-d, kuid 5 mittepaardunud, nt enne seda sruktuuri, on destabiliseeriva toimega, võimaldades RNaas E-l mRNA 5' otsale seonduda ja RNA-d lõigata. Olulised on
Jahutada vesivannis ja lisada DNA nähtavaks tegemiseks 1 l EtBr (5 g/l). Valada geel vormi, kuhu on varem valmis pandud nn ,,kamm" või ,,hambad". ~30 min pärast on geel tardunud. Punkt 9 jääb vahele. (9) Peale 30 min inkubatsiooni teosta DNA-le fenooltöötlus. See on vajalik RNaasi eemaldamiseks. Selleks: - lisa RNaasA-ga töödeldud DNA-le võrdses koguses fenooli (100 l) (tõmbe all!!!) - tsentrifuugi 1-2 min - kanna vesikiht uude tuubi (~100 l). Vesikihis on DNA ning valgud (RNaas) jäävad fenoolkihti ja vahekihti - DNA sadestamiseks lisa vesikihile 1/20 osa (5 l) NaOAc ja 3 mahtu (300 l) 95% etanooli - sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min 7 Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt
kohal) eppendorfi põhja on kogunenud rakusade. 4. Re-suspendeeri pellet (väike hunnik rakke epsi põhjas) 0,2 ml-s E1 lahuses Ole hoolas: lahusesse jäävad klämbud ei lüüsu järgmises etapis täielikult ja seega saad vähem plasmiidi. Glükoos muudab E1 lahuse isotooniliseks, EDTA seob kahevalentsed katioone (seega inhibeerib paljusid ensüüme, kes töötamiseks neid enda koostisse vajavad) ja Tris on puhverdav reagent. RNAas A eemaldab bakteraalse RNA prepsist(ehk prepareeritavast plasmiidsest DNAst) 5. Lisa 0,2ml E2 lahust ning pipeteeri mitu korda edasi-tagasi. E2-s sisalduv SDS solubiliseerib (lahustab pisikesteks puhvris ujuvateks mullikesteks e.mitsellideks) bakteriraku membraani fosfolipiidid ning denatureerib valgud. Naatriumhüdroksiid aga denatureerib DNA struktuurid. Lahus muutub"tatiseks" 6. Inkubeeri laua peal 3 minutit
KORDAMISKÜSIMUSED Talpsep 1. Millisel juhul on LCR eelistatud meetod PCR ga võrreldes LCR on suurema spetsiifilisusega kui PCR. Seda on kaval kasutada tuntud järjestuste ja punktmutatsioonide tuvastamiseks kui kasutada oleva DNA kogus on limiteeritud. 2. Milline meetod võimaldab RNA amplifitseerimist DNA juuresolekul? NASBA on RNA tuvastamiseks eriti hea meetod: RNA ahelale saab panna pöördtranskriptaasiga praimeri juurde, sünteesitakse uus ahel, RNAas lõhutakse H-ga ära ja sünteesitakse uuesti jne kuni saadakse detekteeritav kogus nukleiinhappe molekule. Tal on ka see omadus, et töötab DNA juuresolekul ei pea proovi ära puhastama, mis RNA puhul on väga keeruline. Kasutatakse ka ekspressiooniproduktide määramiseks. 3. Millised ensüümid on vajalikud TMA meetodil amplifitseerimiseks? TMA- transcription mediated amplification. RNA polümeraas ja pöördtranskriptaas 4
ja plasmiidsed DNAd renatureeruvad tagasi. Nüüd fuugimisel lihtne genoomset DNAd eraldada plasmiidsest. 1. Võtsin kasvanud epsis bakterikultuur, fuugisin bakterid põhja 2 min maksimumpööretel ning eemaldasin pipetiga sööde sademe kohal. 2. Esimesena lisasin 0,2 ml E1 lahust (Glükoos teeb lahust isotooniliseks, EDTA seob katioone samas inhibeerib paljusid ensüüme, Tris-HCl on puhverdav reagent ning Rnaas A eemaldab bakteraalse RNA prepsist) 3. Teisena lisasin 0,2 ml E2 lahust (SDS lahustab bakteriraku mambraani fosfolipiidid ja denatureerib valgud, NaOH denatureerib DNA struktuurid) 4. Lahus muutus „tatiseks“. Pärast 5 min inkubeerimist laua peal lahus muutus selgemaks. 5. Nüüd pipeteerisin peale 0,2 ml E3 lahust (KAc peatab lüüsi ning normaliseerib pH, mille tagajärjel valgud ja gDNA välja sadenevad) 6
tuumas enne suunamist tsütoplasmasse sünteesi käigus modifitseeritakse mRNA primaarseid transkripte kovalentselt nii 5' kui 3' otsast, muutes nad erinevateks teiste polümeraaside poolt toodetud RNA-dest. ?? VAATA LOENG 27, SLAID 34 splaisingu käigus lõigatakse välja intronid ning eksonid ,,õmmeldakse" kokku küpseks mRNAks, splaising toimub ainult tuumas!!! 16. Ribosüümid RNA segmendid, mis ilmutavad ensüümkatalüütilist aktiivsust nt Rnaas P ja peptidüültransferaas (ribonukleiinhape, millel on katalüütilised omadused) Ribosüümid võivad katalüüsida transesterdamisreaktsioone, mis ühendavad eksonid??? 17. prootonite elektrokeemiline gradient tekib läbi mitokondri sisemembraani. Prootonigradiendi olemasolul vabaneb ensüümilt sünteesitud ATP. Kui prootonigradient puudub, siis sünteesitud ATP ensüümilt ei vabane. 18.
Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väiksema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat. Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga ligaas, mis liidab augud ahelas ning lõpetab sellega replitseeritud DNA molekuli sünteesi. 8. Mis on geen? Geen on DNA järjestuse lõik, funktsionaalne ühik, mis kodeerib valku või struktuurset, katalüütilist või regulatoorset RNAd, geenis on regulatoorsed
Seega on A-T sidemeid lihtsam lõhkuda, sest väikesema arvu vesiniksidemete lõhkumise jaoks kulub vähem energiat.[5] Pärast DNA ahelate eraldamist luuakse algahelatele RNA praimerid. Juhtivale DNA ahelale sünteesitakse üks RNA praimer aktiivse origini kohta, mahajäävale ahelale sünteesitakse aga mitmeid praimereid, neid nimetatakse avastaja järgi Okazaki fragmentideks. DNA polümeraas pikendab juhtivat ahelat pidevalt, mahajäävat ahelat aga fragmentide kaupa. RNaas eemaldab replikatsiooni initsiatsiooniks kasutatud RNA praimerid, ning teist sorti DNA polümeraas liitub ahelatega, et täita sünteesimata fragmente. Pärast seda liitub DNAga ligaas, mis liidab augud ahelas ning lõpetab sellega replitseeritud DNA molekuli sünteesi (vt mahajääv ahel). Replikatsioonikahvel Replikatsioonikahvel on Y-kujuline aktiivne struktuur, mis moodustub sünteesilookuse juures, kus 2- ahelaline DNA läheb üle 1-ahelaliseks. See tekib rakutuumas DNA replikatsiooni ajal
toimespetsiifika erinevus? Eksonukleaasid hüdrolüüsivad otsmisi ehk terminaalseid fosfodiestersidemeid. Endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete ahelasiseseid ehk mitte-terminaalseid fosfodiestersidemeid. 15. Iseloomustage järgmiste ensüümide toimet (kirjeldage katalüüsitavaid reaktsioone). Vajadusel illustreeriga vastust joonise või skeemi abil. a) Endonukleaas Rnaas A endonukleaasid hüdrolüüsivad nukleiinhapete sisemisi fosfodiestersidemeid. Powerpoindist võetud tabel: Ahelate lõikamise loogika üldiselt: Alguses: Peale hüdrolüüsimist: a - fosfodiestersideme 3' pool; b - fosfodiestersideme 5'-pool b) Restriktaas EcoRI (,,kleepuvaid" otsi produtseeriv endonukleaas) restriktaas ehk restriktsiooniensüüm kaitseb bakterit võõra DNA sissetungi eest. II ja III tüüpi restriktaasid
paremalepöörduv/positiivne ja vastupidi vasakulepöörd/negatiivne. 82. Kromosoomid struktuur prokarüootidel. Prokarüootidel (bakteritel, viirustel) koosnevad kromosoomid ainult kahest DNA niidist (valk puudub). DNA ahelad on neil tavaliselt omavahel ühendatud algusest ja lõpust nii, et nad moodustavad rõnga. Selline rõngas on tavaliselt spiraliseerunud negatiivselt. Volditud kromosoom, 50-100 lingu e. domääni, negatiivselt superspiraliseerunud volditud kromosoom; Rnaas ja Dnaas - põhjustavad osalise lahtivoltimise; üksikahelalisi katkemisi. 83. ocDNA, cccDNA, lineaarne DNA. Konkatemeerid. cccDNA (kovalentselt suletud tsirkulaarne DNA); ocDNA (avatud ringkujuline DNA) lineaarne DNA (12 aluselised üksikahelalised "kleepuvad" otsad). Interkonversioon - ringikujuliseks kleepuvad otste abil. Lineaarne DNA on see, kus ahelad on üksteise peegelpildid (ühe ahela 5' on teise ahela 3' otsaga kohakuti ja vastupidi).
struktuuriga prekursos RNA lõikamisel Dicer ensüümiga ning mis viib komplementaarse mRNA translatsiooni inhibitsioonini miRISC kompleksis RISC RNA induced silencing compleks kompleks (160kDa 80S), mis viib läbi siRNA-le või miRNA-le komplementaarse mRNA vaigistamist degradatsiooni või translatsiooni ihibitsiooni teel. Põhikomponendid agronaudid (AGO), millel on 2 olulist domääni: PAZ RNA-d siduv domään ja PIWI Rnaas H-ga sarnanev endonukleaasset aktiivsust omav domään. Dicer RNaasIII perekonda kuuluv ensüüm, mis viib läbi dsRNA või pre-miRNA lõikamist lühikesteks siRNA-deks /miRNA-deks. Drosha tuumne RNaasIII perekonna ensüüm, mis viib läbi pri-miRNA lõikamise pre-miRNA-ks Pasha tuumne dsRNA-d siduv valk, mis interakteerub Droshaga, stabiliseerides kompleksi. Drosha ja Pasha moodustavad mikroprotsessori
samas kui toksiin käitub repressorina. Tihti jaotatakse süsteemid kaheks (mõnikord viieks). Tüüp I korral inhibeerib antitoksiini antisens-RNA toksiini geeni ekspressiooni ning tüüp II korral antitoksiin neutraliseerib toksiini valguna. Toksiin-antitoksiin süsteemid ei pea olema letaalse efektiga bakterile. Mõned süsteemid pärsivad bakterite metabolismi. Näiteks RelBE (leidub andmeid ka MazEF-i kohta) toksiin-antitoksiin süsteemi toksiin RelE on mRNA ribosoomis- sõltuv RNaas, mis lõikab transleeritavat mRNA-d. Sellisel moel rakk kaitseb ennast näljatingimustes sellega, et vähendab energia kulutamist translatsioonile. Lõigates mRNA-sid katki läheb bakter metaboolselt inaktiivsesse seisundisse. Selliseid baktereid nimetatakse persistoriteks. Osa teadlasi arvab, et toksiin- antitoksiin süsteemiga indutseeritud metaboolne inaktiivsus on tagasipööratav. Et kui bakter satub toitaineterikkasse keskkonda, siis uuesti sünteesitud
annaabi.ee 
