aminopeptidaasid (R1= N-terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid vabastades. Optimaalne pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH~2,5), neutraalseid (pH~7,2) ja leelisproteaase (pH~9,0). Aktiivtsentri ehitusest, millised aminohapped sinna kuuluvad, tuleneb ensüümi toimemehhanism. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 mikrokat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 miksomooli aminohapete vabanemist 1 sekundi vältel 30 kraadi juures Celsiuse järgi. Proteaase aktiivsust avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate aminohapete/peptiidide hulga kaudu, kuna peptiidsidemete hulk pole otseselt mõõdetav. Neutraalsed ja aluselised proteaasid: - substraadina kaseiin (piima põhivalk, fosfoproteiin). Jälgitakse hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud sidemed
aminopeptidaasid (R1= N-terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid vabastades. Optimaalne pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH~2,5), neutraalseid (pH~7,2) ja leelisproteaase (pH~9,0). Aktiivtsentri ehitusest, millised aminohapped sinna kuuluvad, tuleneb ensüümi toimemehhanism. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 mikrokat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 miksomooli aminohapete vabanemist 1 sekundi vältel 30 kraadi juures Celsiuse järgi. Proteaase aktiivsust avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate aminohapete/peptiidide hulga kaudu, kuna peptiidsidemete hulk pole otseselt mõõdetav. Neutraalsed ja aluselised proteaasid: - substraadina kaseiin (piima põhivalk, fosfoproteiin). Jälgitakse hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud sidemed
invertiini aktiivsus. Invertaasi aktiivsus on 8,9*20=178 kat/ml, mis on liiga palju. Sellega järeldub, et midagi oli minul tehtud väga valesti. Võib olla viga oli tehtud kas invertaasi lahuse tegemise käigus või tiitrimise käigus või reagentide kogused ei olnud eriti täpsed. Kokkuvõte: Järeldub, et invertiini aktiivsuseks saadi 178 kat/ml .See näitab invertiini kogust, mis produtseerib 1 sekundi jooksul 30°C juures 178 mikromooli taandavat suhkrut. See näitab, et 178 mikromooli sahharoosi hüdrolüüsiti 1 sekundi jooksul.
valk ja peptiidid sadestatakse lahusest trikloroäädikhappega, mis ühtlasi inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisaldus määratakse spektrofotomeetriga. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped on tänu 280 nm piirkonnas paiknevale neeldumismaksimumile spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Proteolüütilise aktiivsuse ühikuks on 1 kat. See on ensüümi hulk, mis põhjustab 1 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi 1 sekundi vältel 30 °C juures. Töö käik Kõigepealt valmistasin 5 ml uuritavat proteaasi lahust. Selleks kaalusin 0,0049 grammi tahket ensüümipreparaati (Alcolase) ja lahustasin selle boraatpuhvris 5 ml-ni (pH=8,4). Järgnevalt pipeteerisin suurde katseklaasi 25 ml 2%-list kaseiini lahust ja asetasin lahuse kümneks minutiks vesitermostaati 30 °C juurde soojenema.
aktiivsuse ülejäänud katsete tulemuste põhjal. Tulemused aeg Vasksulfaadi maht Suhkrute kontsentratsioon 10 min 11,20 mL 9,9 mg/mL 20 min 22,05 mL 18,45 mg/mL Järeldus: kasutatud invertaaasipreparaadi aktiivsus on 100,9 mis tähendab et 1ml invertiini katalüüsib 1 sekundis 30 kraadi juures 100,9 mikromooli sahharoosi glükosiidsideme hüdrolüüsi, mille käigus tekib -fruktoos ja glükoos. Katse tulemus oleks võinud olla täpsem, kui oleks saanud arvutusel kasutada ka 0-proovi.
· t valitud ajavahemik, 1 min = 60 s · V1 reaktsioonisegu üldmaht, 26 ml · V2 valmistatud ensüümilahuse üldmaht, 5 ml · V3 proovi maht hüdrolüüsisegus, 1 ml · g proteaasi preparaadi kaalutis, 7,6 mg = 0,0076 g Järeldus: Praktilise töö käigus õnnestus määrata kasutatava alkalaasiproovi aktiivsus, milleks on 13,8606 mikrokatalit grammi kohta. See tähendab, et 1 gramm alkalaasi hüdrolüüsib ühe sekundiga 30 kraadi juures 13,8606 mikromooli peptiidsidemeid. Kaod võisid tekkida näiteks ensüümi ülekandmisel mõõteklaasist katseklaasi, või liiga vara reaktsioonisegust võetud proovide tõttu.
YKL3312 Biokeemia - praktikum Laboratoorse töö nr ja pealkiri 3.1 Invertaasi aktiivsuse määramine Õpperühm: Töö teostaja: Matriklinumber: Teoreerilied alused. Invertaas ehk sahharaas on ensüüm, mis katalüüsib , D fruktofuranoosiide hüdrolüüsi: , D fruktofuranoosiide + H2O alkohol + fruktoos Kõige levinumaks substraadiks invertaasile on sahharoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, aga ka paljud taimed. Invertaasi aktiivsuse määramine põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahhariidi hüdrolüüsi läbiviimisele uuuritava ensüümipreparaadi toimel ja vabanenud taandavate monosahhariidide glükoosi ja fruktoosi detekteerimisele reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüs invertaasi toimel. Glükoosi ja fruktoosi koguse kinladktegemiseks kasutatakse kompleksomeetrilist meetodit. Põhireaktiiv tugevalt leeliselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II) triloo...
ml 2 - TKÄ lahusest tingitud lahjendus V2 - ensuumilahuse uldmaht ml V3 - ensuumi maht hudroluusisegus ml g - proteaasi kaalutis g 181 - turosiini molekulmass A = (0,023 x 103 x 26 x 2 x 5) / (600 x 181 x 1 x 0,0055) = 10,01 m. kat / ml Vastavalt definitsioonile, 1 ml ensüümi lahust vastava lahjendusega katalüüsib 1 sekundiga 30 kraadi juures 10,01 mikromooli aine teket. 5. Kokkuvõte: Läbiviidud tööga peaks ensüümi aktiivsuse mõiste selgeks saama. Töö oli viidud lõpuni ja piisava täpsusega, arvutused tehtud ja kõik. 3
tingimustel 1 mooli substraati reaktsiooniproduktideks. Kuna see on aga väga suur ühik, siis praktikas kasutataksegi tihti ühikuna hoopis µkatalit. Defineerisid ühiku 1 katal. Antud töös leiti, et invertaasi preparaadi aktiivsus on 825 µkat/g. Mida väljendab konkreetselt 825 µkat/g? St kui palju taandavaid suhkurid tekib, mis aja jooksul, mis preparaadi koguse kohta? 825 µkat/g väljendab seda, et taandavaid suhkruid tekib 825 mikromooli 1 sekundi jooksul 1 g preparaadi kohta. Järeldus Ideaalis peaksid tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20 % võrra. Kuna ka minu tulemused on võrdlemisi sarnased ja erinevus on väiksem kui 20%, siis loen invertaasi aktiivsuse määramise katse õnnestunuks.
ülejäänud 3 tulemust graafikul samal sirgel, mis näitab, et katse üldjoontes õnnestus. Ühik näitab, mitu grammi ensüümi kulub ühe mooli peptiidsidemete hüdrolüüsiks. Definitsiooni järgi: ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 kat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 mooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 mooli aminohapete vabnemisel 1 s vältel 30°C juures. Alkalaasi aktiivsus 7,1823 kat/g näitab, et üks gramm alkalaasi katalüüsib 7,1823 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi ühe sekundi jooksul 30 °C juures.
üldjoontes õnnestus. Ühik näitab, mitu grammi ensüümi kulub ühe μmooli peptiidsidemete hüdrolüüsiks. Definitsiooni järgi: ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 μkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 μmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 μmooli aminohapete vabnemisel 1 s vältel 30°C juures. Alkalaasi aktiivsus 7,1823 μkat/g näitab, et üks gramm alkalaasi katalüüsib 7,1823 mikromooli peptiidsidemete hüdrolüüsi ühe sekundi jooksul 30 °C juures.
Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena. Kahe saadud tulemuse ja erinevus protsentides: Järeldused: Kui töö on läbi viidud korrektselt, peaksin tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20% võrra. Keskmine invertaasi preparaadi invertiini lahuse aktiivsus oli katse tulemusena . See näitab, et 1 sekundi jooksul juures produtseeritakse 64,825 mikromooli produkti (sahharoosi). Üksikud katse tulemused erinesid teineteisest vaid 0,37%, mille järgi võib öelda, et katse oli sooritatud üsna täpselt.
3 ΔCTyr ·1 0 ·V 1 ·V 2 · 2 Proteolüütiline aktiivsuse leidmine A= (µkat/g) Δt · 181· V 3 · g 0,029 ·1 03 ·26 · 5 ·2 A= = 6,489 µkat/g 600 ·181 · 1· 0,0107 See tähendab, et 1 gramm alkalaasi hüdrolüüsib ühe sekundi jooksul 30 °C juures 6,489 mikromooli peptiidsidemeid. ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus, 0,029 mg/ml Δt – valitud ajavahemik, 10 min = 600 s V1 – reaktsioonisegu üldmaht, 26 ml V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht, 5 ml TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2) V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus, 1 ml g – alkalaasi preparaadi kaalutis, 10,7 mg = 0,0107 g Türosiini molekulmass 181
Vmax jagamisel ensüümi ja substraatide komplekside arvuga (mis peab olema täielik, ehk kõik ensüümi molekulid on seotud substraadiga) Ensüümi aktiivsuse mõiste ja ühikud. Ensüümi aktiivsus näitab kui palju ja kui kiiresti substraadi molekule ta on võimeline produktiks muutma. Kui ensüümi molekulaarsete kontsentratsiooni pole teada, väljendatakse tema kogust aktiivsuste kaudu. ühikud: rahvusvaheline ühik ehk IU see on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 min jooksul katal 1 kat on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mol substraati reaktsiooniproduktiks 1 sek jooksul 1 katal = 6*107 IU eriaktiivsus ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümvalgu kohta 3. Michaelis-Menteni kineetiline võrrand matemaatiline ja graafiline väljendus ja teisendused. [S] substraadi kontsentratsioon, mis iseloomustab siduvust See võrrand toimib järgmistel eeldustel (pluss siis veel tasakaalulise konts. saavutamine):
1200 180 1 1 0, 0103 Kahe arvutuse vahe protsentides on 50,25 / 669,63 = 7,5% ja see jääb lubatud 20% piiridesse. Arvutan kahe tulemuse keskmise, mis ongi invertaasi aktiivsus. 669, 63 + 719,88 A= = 694, 755( µ kat / g ) 2 Invertaasi aktiivsus on 694,755 kat/g. Järeldused Oma katse tulemusel leidsin, et invertaasi aktiivsus on 694,755 kat/g. See tähendab, et üks gramm invertaasi produtseerib 694,755 mikromooli taandavat suhkrut 1 sekundi jooksul 30 °C juures. Kahjuks ei leidnud kirjandusest invertaasi aktiivsuse kohta sobilikke materjale, seega ei saa oma tulemust millegagi võrrelda. Tegelikkuses oleks võinud kahe aktiivsuse vahe olla väiksem, mistõttu ei saa oma katset täiesti õnnestunuks lugeda. Sellegi poolest oli aktiivsuste vahe piisavalt väike, et arvutada nende keskmist. Kasutatud kirjandus Malle Kreen, Terje Robal, Tiina Randla ,,Biokeemia laboratoorsed tööd" , Tallinn 2010
7. Kirjutage Cu(II)-triloon B kompleksi struktuur. Nimetage kaks põhjust selle, tugevalt aluselise reaktsiooniga lahuse kasutamiseks invertaasi aktiivsuse määramisel. Kuna on aluseline, siis lõpetab invertaasi töö, mille optimaalne pH on happeline. Tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaiku leeliselise keskkonna. 8. Selgitage, mida tähendab invertaasi preparaadi aktiivsus 85 kat/ml sisuliselt? See näitab, et 1 sekundi jooksul produktseeritakse 1 ml ensüümilahuse poolt 85 mikromooli produkti teke. 9. Kuidas tuleb toimida, et valmistada tahkest invertaasi preparaadist 5,0 ml lahust, milles ensüümi kontsentratsioon on 4,0 mg/ml? 20 mg tahket invertaasi tuleb lahustada 5ml lahustis. 10. Kasutasite töös 7%-list sahharoosi lahust. Milline on sellise sahharoosi lahuse molaarnekontsentratsioon (Mr = 342)? Millises suhtes (suurem/ väiksem/võrdne) on see invertaasi K m väärtusega, kui on teada, et sahharoosi hüdrolüüsil Km = 26 mM? 0,2 M 1
tõstmisel reaktsiooni algkiirus läheneb asümptootiliselt Vmax väärtusele. Kcat on katalüütilise aktiivsuse mõõt. See on nn pöörete arv substraadi molekulide arv, mis konverteeritakse ühe ensüümi molekuli poolt ühes ajaühikus produktiks, tingimusel, et ensüüm on küllastatud substraadiga. Kcat=Vmax/[ET], (1/s). Ensüümi aktiivsuse ühikud: ravusvaheline ühik IU (1 IU on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 minuti jooksul); katal (1 kat on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 moli substraadi konversiooni 7 produktiks 1 sek jooksul) 1 kat = 6 x 10 IU; eriaktiivsus (ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümivalgu kohta). [ ] 3. Michaelis-Menten'i võrrand: . [ ]
Ensüümi aktiivsuse mõiste ja ühikud. Lihtsustatud võrrand - Täielik võrrand E+S -> ES->EP->E+P Ensüümi ja substraadi liitumisel tekib ensüüm-substraat kompleks, millest omakorda tekib ensüüm-produkt kompleks ja siis eraldub ensüümist produkt. Ensüümi aktiivsuse ühikud : Kui ensüümi molaarne kontsentratsioon ei ole teada, väljendatakse tema kogust aktiivsuse kaudu. Rahvusvaheline ühik (IU -International Unit) 1 IU on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 minuti jooksul. Katal (kat) 1 katal on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mooli substraadi konversiooni produktiks 1 sekundi jooksul. Seega: 1 katal = 6 x 107IU Eriaktiivsus - Ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümivalgu kohta 3. Michaelis-Menten'i kineetilise võrrandi matemaatiline ja graafiline väljendus. Michaelis-Menten'i võrrandi teisendus Lineweaver-Burk'i koordinaatides. Vmax ja Km arvväärtuste määramine. 4. Reaktsiooni kiirust mõjutavad tegurid
1.järku, kõrgematel substraadi konts. 0.järku reaktsioon. Km kineetiline aktivatsioonikonstant Vmax ensüümi iseloomustav konstant, teoreetiline maksimaalne reaktsioonikiirus, millist reaktsioon mitte kunagi ei saavuta. Kcat substraadi molekulide arv, mis konverteeritakse ühe ensüümi molekuli poolt ühes ajaühikus produktiks. Ensüümi aktiivususe ühik: (IU international unit) 1IU on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 min jooksul. Katal (kat) 1 katal ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mooli substraadi konversiooni produktiks 1 sek jooksul. 3. Michaelis-Menten'i kineetilise võrrandi matemaatiline ja graafiline väljendus. Michaelis-Menten'i võrrandi teisendus Lineweaver-Burk'i koordinaatides. Vmax ja Km arvväärtuste määramine. Lineweaver-Burk'i koordinaatides. 4. Reaktsiooni kiirust mõjutavad tegurid
SR arengutase Madal Kõrge Kõrge Kiu diameeter Väike Keskmine Suur 35 Maris Kallus KKS 2010 ATP kui universaalne energiakandja 1. ATP kontsentratsioon lihasrakus puhkeseisundis ja aktiivse talitluse tingimustes: Keskmiselt on 5 mikromooli grammi kohta. Müosiini ATP-aasne aktiivsus küünib 10 mikromooli ATP-d ühe grammi kohta ühes sekundis ja maksimaalse pingega sooritatud tööl kasutatakse müosiini ATP-aasne aktiivsus sajaprotsendiliselt. Põhimõtteliselt ATP kontsentratsioon ei muutu lihases kehalisel tööl, kuna teda nii hüdrolüüsitakse ja kohe ka resünteesitakse. 2. ATP resünteesi olemus ja regulatsiooni põhiprintsiip: Lihase kontraktsiooniks ja lõõgastumiseks saadakse energiat ATP-st, kuid viimase hulk
Enamasti on see väljendatud mmol m⁻² s⁻¹. Õhulõhede juhtivust mõõdetakse üldiselt infrapuna- gaasianalüsaatoriga (IRGA – infrared gas analyzer). Aparaadi õhukamber kinnitatakse taime lehe külge ning andurid mõõdavad CO₂ ja veeauru sisenemist ja väljumist kambris. Lehega on kambris kokkupuutes ka termopaar, mis mõõdab lehe ja kambrist väljuva õhu temperatuuri. 10. Lehe fotosünteesi intensiivsus on 12 mikromooli CO2-e ruutmeetrilt sekundis. Kui suur peaks olema õhulõhede juhtivus veeaurule, et CO2 kontsentratsioon rakuvaheruumides oleks 3 korda väiksem kui välisõhus, kus see on 360 ppm? Või järeleksamil olid sellised, kõiki ei mäleta loomulikult... Kuidas sõltub taime suhteline kasvukiirus summaarsest fotosünteesist ja taime massist? :S Mis on lehepinnaindeks, Signaalainete mõju taimele, too näide
S-S rühmad SH-deks. 50. Kuidas on defineeritud CO2 kompensatsioonipunkt CO2 kontsentratsioon, mille juures fotosünteesil CO2 assimileerimise kiirus on võrdne hingamisel moodustuva CO2 tekkekiirusega. 51. Kuidas on defineeritud valguskompensatsioonipunkt Valguse intensiivus, mille juures fotosünteesil O2 moodustuskiirus on võrdne rakuhingamiskiirusega. 52. Milline on fotosünteetiliselt aktiivse valguse maksimaalne intensiivsus maakeral? 1800 mikromooli * m-2 * s-1 53. Mis on valgushingamine ja millise reaktsiooniga see algab? Protsess, kus hapnik asendab CO2 Calvini tsüklis. CO2 ja O2 konkureerivad Rubisco aktiivtsentri eest. Valgushingamisel seob Rubisco O2, mistõttu tekib glükolaat, mida tuleb edasiselt metaboliseerida. Kui CO2 kontsentratsioon on madal ja temperatuur tõuseb, siis need soodustavad. See alandab fotosünteesi efektiivsust. Ribuloos-1,5-bisfosfaat + O2 2-fosfoglükolaat + 3-fosfoglütseraat. 54
Ensüümi aktiivsus Def: Iseloomustab ensüümi kogust tema poolt esile kutsutava katalüütilise efekti järgi, st substraadi reageerimise kiiruse suurenemise järgi ensüümi juuresolekul. Ensüümi ektiivsuse rahvusvaheliseks ühikuks o katal. Ühikud: Kui ensüümi molaarne kontsentratsioon ei ole teada, väljendatakse tema kogust aktiivsuse kaudu. Rahvusvaheline ühik (IU international unit) 1 IU on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mikromooli produkti teket 1 minuti jooksul Katal (kat) 1 kat on ensüümi kogus, mis katalüüsib 1 mooli substraadi konversiooi produktiks 1 sekundi jooksul Eriaktiivsus Ensüümiaktiivsus 1 mg ensüümivalgu kohta LIISI KINK 27 BIOKEEMIA test I 3
optimaalsetel tingimustel 1 mooli substraati reaktsiooniprodukti(de)ks. Kuna 1 kat on väga suur ühik, siis praktikas kasutatakse ühikuid 1 mkat = 10-3 kat, 1 kat = 10-6 kat, 1 nkat = 10-9 kat. Levinud on ka aktiivsuse väljendamine rahvusvahelistes ühikutes IU-des (International Units). 1 IU = 1mol min-1. 1 IU on selline ensüümi hulk, mis katalüüsib 1 minuti jooksul 25°C juures ensüümile optimaalsetel tingimustel 1 mikromooli substraadi konversiooni reaktsiooniprodukti(de)ks. Kui ensüümi toimeks on optimaalne 25°C, siis 1kat = 6 · 107 IU ehk 1 IU = 16,67 nkat Asudes mingi ensüümi aktiivsuse määramisele, tuleb teada: ¾ ensüümireaktsiooni üldvõrrandit kasutatava substraadi puhul, ¾ ensüümi aktiivsuse sõltuvust substraadi kontsentratsioonist, ¾ ensüümile optimaalset keskkonna pH väärtust, ¾ temperatuuripiirkonda, kus ensüüm on stabiilne ja omab kõrget aktiivsust,
annaabi.ee 
