seega ei ole Met-tRNA võimeline transleerima AUG'le lähimat koodonit AUA, mis vastab isoleutsiinile. Teine erand on trüptofaani (Trp) tRNA, millel samuti antikoodoni esimeses positsioonis C. Siiski toimub trüptofaani lülitamine tema koodonile (UGG) lähedase, stop-koodoni (UGA) kohal suurema sagedusega kui teiste stop-koodonite kohale aminohappe lülitumine. 4. Tekib 2 vesiniksidet, vt joonis loeng 28 slaid 20. 5. Õige lugemisraami identifitseerimisel alustatakse lugemist AUG initsiaatorkoodonist. 1. lugemisraami puhul saab kodeerida aminohappeid: ACC AUC UCG AGA vastavalt treoniin, isoleutsiin, seriin, arginiin. 2. lugemisraam (raami nihe ühe aluse võrra) CCA UCU CGA GAG vastavalt proliin, seriin, arginiin, glutamaat. 3. lugemisraam (raami nihe kahe aluse võrra) CAU CUC GAG AGU vastavalt histidiin, leutsiin, glutamaat, seriin. 6
Selle koodi lahtimuukimiseks kasutatakse koodipäikest. · Geneetilise koodi omadused: universaalus- kehtib kogu eluslooduses; sünonüümsus- ühele aminohappele võib vastata mitu koodonit; ühetähendlikkus- ühele koodonile vastab alati ainult üksainus aminohape; mittekattuvus- üks ja sama nukleotiid ei saa olla korraga kahes kõrvutiolevas koodonis. Koodi lugemine algab koodonist AUG(initsiaatorkoodon), määrab ära meteoniini.Initsiaatorkoodon määrab ära lugemisraami. Stoppkoodon- valk on valmis. Geneetiline kood- koodipäike mRNA kohta Täpike- stoppkoodon, kolmnurk- initsiaatorkoodon · Translatsioon- mRNA alusel aminohapete järjekorda panemine, valgu tootmine. Vaja - mRNA, tRNA, rRNA, aminohapped, ensüümid, ATP ja GTP. Protsess toimub ribosoomis. Ribosoom on kaheosaline: mRNA liigub ribosoomi kahe osa vahele. Ribosoomi mahub korraga kuni kaks koodonit mRNAd
eukarüootidel, kuid eukarüootide translatsioonil osaleb rohkem valke. Üldiseloomustus: Vajab väga paljude valkude koostoimet, sh ka palju lahustuvaid valke. 3-5 liiki RNA molekule (mrna, trna, rrna). Osaleb vähemalt 20 aminohappeid aktiveerivat ensüümi. Osaleb 40-60 trna molekuli. 10. Iseloomusta valgusünteesi ribosoomitsüklit? I Initsiatsiooni astmed: ribosoomi subühikute assotsiatsioon, translatsiooni alguspunkti leidmine mRNA-l Kozaki, lugemisraami fikseerimine esimese peptiidsideme süntees. moodustub valgusünteesi initsiaatorgrupp: 40S rRNA subühik tunneb ära mRNA 5' cap otsa, sest sinna on seondunud spetsiifilised initsiaatorvalgud. seejärel liigub initsiaator - grupp piki mRNAd kuni valgusünteesi initsiaatorkoodonini AUG - , mis reeglina peab asuma ka spetsiifilises järjestuses (Kozaki konsensus - soodustab translatsiooni initsiatsiooni).NB! mRNA eukarüoodil on reeglina (>90%) monotsistroonne, s.t
Schleiden: taimemorfoloog, kõik taimsed koed on rakkudest Virchow:* rakud saavad tekkida ainult olemasolevatest rakkudest (“omnis cellulae e cellulae) * muutused raku ehituses ja talitluses on aluseks organismi patoloogilistele protsessidele ! 2. Mida teate HIV-1 mutatsioonist CCR5-▵32? (тетр.) 5 ! Kemokiini retseptor CCR-5 on HIV-1 koretseptoriks sisenemisel makrofaagi (geen CCR5). CCR5 geeni 32. nukleotiidipaari deletsioon põhjustab lugemisraami nihke, muutub retseptorvalgu 185. aminohape. Retseptorvalk muutunud, isik muutub HIV-1 infekstioonile suhteliselt vastuvõtmatuks. Homosügoodid ei nakatu HIV-iga, heterosügootidel progresseerub AIDS aeglasemalt. ! 3. Eubakteri ja arhebakteri erinevused (animatsiooni ja loengu alusel). (Б11) 6 ! Arhebakter Eubakter Rakumembraan membraanilipiidide vahel eetersidemed membraanilipiidide vahel estersidemed
hävitavalt Liigitus Punktmutatsioon – mõne lämmastikaluse insertsioon (liitmine), deletsioon (kotamine) või asendamine Missenssmutatsioon – kui saadakse kodoon, mis kodeerib teist aminohapet Nonsenssmutatsioon – kui tulemuseks saadakse koodon, mis valgu sünteesi lõpetab Vaikiv mutatsioon – kui ekslikult replitseerunud koodon kodeerib sama eminohapet mis ennegi Pöördmutatsioon, mis geeni funktsiooni taastab Lugemisraami nihe e. Raaminihe – kui lugemisraam mRNAl nihkub tänu nukleotiidide insertsioonidele või deletsioonile äsja sünteesitud DNAs Mõju Mutatsioonid tekitavad mittefunktsioneerivaid valke, mis võivad olla ohtlikud ja lausa surmavad Organismid selliste mutatsioonidega , mis osutavad kasulikuks antud keskkonnas, on võimelised adapteeruma, elus püsima ja paljunema – need mutatsioonid on aluseks populatsioonis toimuvatele muutustele
Enamus bunyaviiruseid omab lüilijalgseid vektoreid ja on inimesele suhteliselt vähepatogeensed. Samas leidub ka ohtlikke. Genoomi kodeerivad alad Erinevate bunyaviiruste genoomide organisatsioonis ja ekspressiooni strateegiates leidub nii sarnaseid kui ka erinevaid jooni: Ambisense strateegia phlebo- ja tospoviirustel Segmentide erinevad mõõtmed ning kodeeritud valkude arv. Ambisense segmendiks nimetatakse sellist RNA-d mille osa sisaldab lugemisraami (positiivne osa) samal ajal kui teisele osale (negatiivsele osale) vastav lugemisraam asub komplementaarses orientatsioonis. Ambisense segmentides erineva polaarsusega lugemisraamid ei kattu. Ambisense segmendi poolt kodeeritavad valgud ekspresseeruvad eranditult mRNA-de kaudu, st segmendi positiivse polaarsusega osa ei ole mitte kunagi translatsiooniliseks maatriksiks. Perekonna Tospoviruse esindajate M segment (4,8 kb) erineb ülejäänud
Geeli analüüsil selgus, et inserdi kontsentratsioon oli umbes 13,7 ng/l. Kuna vektori ja inserdi pikkuste suhe 3851/330=11,7. Kuna vektorit oli 9 ng, saame leida vektori ja inserdi koguste suhte: (13,7*11,7)/9=17,70. See suhe on küllaltki sobiv. 3. Rekombinantse plasmiidi ligeerimine a) Kasutasime pSTBlue-1 vektorit, mis sisaldab kahte replikatsiooniks vajalikku origini (üks kummaski suunas), ampitsilliini ja kanamütsiini resistentsusgeeni ja lacZ operoni, mille lugemisraami sisestame oma inserdi. See võimaldab sini-valge meetodil välja selgitada, millistes kolooniates on tühi, millistes meie inserti sisaldav plasmiid. Vektoril on T-overhangidega otsad, mis võimaldab A-overhangidega inserti sisestada. b) PCR-i produkti on võimalik vektorisse ligeerida, kuna vektoril on T-overhang otsad ning PCR-i produktil on A-overhang otsad. T ja A on omavahel komplementaarsed,
Antikoodon aasas on alati (v.a. raaminihke suppressorid, vt. allpool) 7 nukleotiidi, milles antikoodoni moodustavad 3 keskmist nukleotiidi. Antikoodoni ees paikneb konserveerunud U33 nukleotiid, mille järel teeb nukleiinhappe ahel järsu pöörde (vt. joonis 7.7). Antikoodoni kõik kolm nukleotiidi paiknevad RNA ahela ühel küljel sarnases konformatsioonis nagu esineb RNA kaheahelalises A vormis. Atikoodon on sobivas struktuuris koodoniga paardumiseks. Antikoodon aasa struktuur on oluline ka lugemisraami hoidmisel, kuna U33 on antikoodoni teljest järsult ära pööratud, siis ei saa see nukleotiid osaleda mRNA'ga paardumisel pideva heeliksina. Tuleb silmas pidada, et nukleotiid 34, esimene antikoodoni nukleotiid, paardub koodoni viimase, 3. nukleotiidiga ja seepärast on oluline, et koodon-antikoodon interaktsioon lõppeks just 34. nukleotiidiga ega jätkuks U33'ga. Seepärast määrab U33 juures toimuv järsk pööre ära koodon-antikoodon seose pikkuse (3 aluspaari)
võimatuks. Väga pikkade fragmentide sekveneerimiseks kasutatakse forward ja reverse praimereid, kuid eraldi reaktsioonides. Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik: Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami! Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada. Ümberkloneerimist ei saa teha vaid ühte restriktaasi kasutades, kuna pärast me ei saaks kontrollida kumba pidi insert vektorisse siseneb
retseptor-struktuurid, mis kontakteerudes vetikarakuga muudavad struktuuri (moodustavad viirust ja rakku ühendavad fiibrid). PBCV-1 genoomiks on 330,740 bp pikkune, permuteerimata dsDNA, mis sisaldab metüleeritud aluseid. Genoomi otstes asuvad 35 b pikkused juuksenõela struktuurid (st. genoomi otsad sarnanevad poksviiruste genoomile), millele järgnevad 2221 bp pikkused identsed inverteeritud terminaalsed korduvjärjestused. PBCV-1 genoomis on leitud 702 lugemisraami, millest 366 kodeerib ilmselt valke ja 11-st tRNA geenist koosnev klaster, mis paikneb genoomi keskosas. Lugemisraamid paiknevad lähestikku ja mõlemas ahelas. 40% PBCV-1 poolt kodeeritavatest valkudest omab homoloogiat mingite teistest organismidest pärit valkudega. 84 geeni kuulub geeniperekondadesses (26 perekonda, igas 2-6 liiget) Mõnedes geenides leidub introne, mis kuuluvad kolme erinevasse tüüpi: - isesplaiseeruvad intronid - splaisosoomi-splaiseeritavad intronid
võivad moodustada sekundaarstruktuure, mis on olulised viiruse genoomi replitseerumiseks ja pakkimiseks. Segmendi A kodeeriv ala sisaldab erinevates faasides kahte osaliselt kattuvat ORF-i. Pikk ORF1 kodeerib 110 kDa polüproteiini. Valmis valkude järjekord polüproteiinis on (N-terminusest alates) VP2-VP4-VP3. ORF2 kodeerib VP5 valku (17 kDa). VP5 on mittestruktuurne valk, mis pole viiruse replikatsiooniks absoluutselt vajalik. Segmendi B kodeeriv ala sisaldab ühte lugemisraami, mis kodeerib VP1 valku. VP1 on dsRNA segmentide terminaalseks valguks (side RNA 5'-terminaalse G-jäägiga Ser-jäägi kaudu VP1-s), mille abil genoomi segmendid moodustavad stabiilseid rõnga kujulisi struktuure. Peale selle on VP1 multifunktsionaalne ensüüm RdRp (transkriptaas ja replikaas), GT ja MT. 1.2. Replikatsioon Ehkki nii IPNV kui ka IBDV replitseeruvad rakukultuuris on nende andmed nende replikatsioonist väga piiratud
Prokarüootidel ja arhedel toimub modifitseerimine tsütoplasmas. Eukarüootidel võib see toimuda tuumas, tsütoplasmas või organellides. Kuid modifitseerimine muudab pisikesi tRNA molekule üksteisest erinevamaks, tõstab valgusünteesi täpsust ja efektiivsust. Loetelu mõnedest modifitseerimise funktsioonidest: Antikoodoni struktuuri ja koodon-antikoodon interaktsiooni stabiliseerimine ning lugemisraami nihke vältimine, tRNA üldise struktuuri stabiliseerimine, D-lingu painduvuse suurendamine: dihüdrouridiin, tRNA ebaõige voltumise vältimine, Kaitse endonukleaaside eest, Fotoprotektsioon, Identsuselemendid aaRS-dele, Antideterminandid aaRS-dele või teistele valkudele, Aluspaardumise spetsiifika laiendamine wobble-positsioonis N34, Termostabiilsuse tõstmine. Ribosoomi struktuur Ribosoomi subühikud PROKARÜOODID :- 2 subühikut :väike e
laboratooriumis) DNA kokaraamatus tooduga. Millised on erinevused? Me teeme transformatsiooni 37 kraadi juures, Sambrook´i raamatus 42 kraadi juures. 2.2) Millisel juhul võib bakterikoloonia sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine. Kuidas määrata, et selles koloonias on rekombinantne plasmiid? Bakterikoloonia võib sisaldada rekombinantset plasmiid, kuid samas koloonia värvus on ikka sinine, juhul, kui insert on väga väike ja ei muuda lugemisraami või kui järjestuses ei ole Stop-koodonit. PCR, ühe või teise praimeriga sekveneerida järjestus, restriktsiooniga on võimalik määrat ,et selles koloonias on rekombinantne plasmiid. 5 2.3) Mis juhtub, kui jätta Amp panemata? Meie bakterid on resistentsed Amp-le. Amp abil surevad teised bakterid ära ja me saame lihtsalt eristada vajalikud kolooniad. 2.4) Rakkude kompetentsus on nende võime vastu võtta DNA-d/plasmiidi. Ligeerimissegu
Antikoodon (nukleotiidid 34, 35, 36) paarduvad mRNA kolme nukleotiidiga (koodoniga), mis on geneetilise translatsiooni aluseks. Antikoodon aasas on alati 7 nukleotiidi, milles antikoodoni moodustavad 3 keskmist nukleotiidi. Antikoodoni ees paikneb konserveerunud U33 nukleotiid, mille järel teeb nukleiinhape järsu pöörde. Antikoodoni kolm nukleotiidi paiknevad RNA ahela ühel küljel sarnases konformatsioonis nagu esineb RNA kaheahelalises A-vormis. Antikoodoni aasa struktuur on oluline lugemisraami hoidmisel, kuna U33 on antikoodoni teljest järsult ära pööratud – see nukleotiid ei saa osaleda mRNA-ga paardumisel pideva heeliksina. Nukleotiid 34 (antikoodoni 1.) peab paarduma koodoni 3. nukleotiidiga ja on oluline et koodon-antikoodon interaktsioon lõppeks just 34. nukleotiidiga ega jätkuks U33-ga. U33 juures toimuv järsk pööre määrab ära koodon-antikoodon seose pikkuse (3bp). Antikoodoni järel paiknevad hüpermodifitseeritud nukleotiidid (ei ole võimelised
Ribosomaalsete RNA-de teke eukarüoodi rakus. Tuumakese ehitus ja tema muutused rakutsükli jooksul. G2- tuumake Mitoos- tuumake laguneb G1- tuumake koondub S- DNA replikatsioon Tuumakese osa ribosoomide ja teiste ribonukleoproteiinide sünteesis eukarüootides. Ribosoomi subühikute moodustumine rRNA-st ja valkudest, tuumakesse on koondunud tRNA sünteesi määravad geenid Geneetilise koodi mõiste ja tema degenereerituse põhjused. mRNA lugemisraami mõiste. Valku kodeerivat järjestust e. transleeritavat DNA piirkonda nimetatakse ka avatud lugemisraamiks – ORF. ORF algab initsiaatorkoodoniga AUG ja lõpeb stop – koodoniga. Erinevate lugemisraamide vahel asuvad spaisser – järjestused. Lugemisraami suund on 5´3´ Nukleotiidne triplettide seeirad mRNAs,mida tõlgendatakse translatsioonil Transport-RNA molekuli struktuur ja funktsioon. Ristiklehe kujuline, 3´ lõpus CCA asub kinnitunud aminohape estersidemega, antikoodon
transleerivad ribosoomid liiderpeptiidi tervikuna. See võimaldab liiderjärjestuses omavahel paarduda regioonidel 1 ja 2 ning 3 ja 4. Regioonide 3 ja 4 paardumise tulemusena on blokeeritud erm geeni RBS ja initsiaatorkoodon ning metülaasi ei sünteesita. Erütromütsiini madala kontsentratsioni puhul peatub liiderpeptiidi translatsioon 9-nda koodoni juures, mille tulemusena regioon 2 paardub hoopis regiooniga 3 ning erm geeni translatsiooni pärssivat sekundaarstruktuuri ei moodustu. Lugemisraami nihkumine (translational frame shifting) ja ribosoomide hüppamine translatsiooni elongatsioonil Arvatakse, et valgusünteesi ümberlülitamine ühelt lugemisraamilt teisele (lugemisraami nihkumine) toimub kohtades, kus translatsiooni elongatsioon korraks peatub, andes ribosoomile võimaluse mRNA-l "libiseda". Mõne polüpeptiidi sünteesil toimub ühelt lugemisraamilt teisele nihkumine kindlates kohtades kõrge sagedusega
initsiaator-koodoni, mis on enamasti AUG. Bakteriaalsetel mRNA’del eelneb initsiaator-koodonile ribosoomi sidumispiirkond RBS (ribosome binding site). Eukarüootide mRNA mRNA ehitus eukarüootides on võrreldes prokarüootsete mRNA-dega oluliselt erinev: Eukarüootne mRNA on reeglina (>90%) monotsistroonne ja kodeerib seega ainult ühte valku. Prokarüootne mRNA on reeglina polütsistroonne st. kodeerib mitut erinevat valgu molekuli (ühes mRNA molekulis on mitu ORF’i ehk avatud lugemisraami). mRNA prosessing. Prokarüootidel on geeni poolt määratav esmane transkript võrdne mRNA-ga ning ta on ka kohe transleeritav. Eukarüootides toimub aga esmalt eellas- ehk pre-mRNA süntees, misjärel toimub nn. eellas-mRNA protsessing küpseks mRNA-molekuliks. Protsessimise käigus toimub enne translatsiooni pre-mRNA-lt spetsiifilise järjestuse kõrvaldamine ning transkripti mõlema otsamodifikatsioon. Enamikus eukarüootsetes geenides on mittekodeerivad järjestused e
·Muutunud funktsioonid (peamiselt dominantsed mutatsioonid)gain of function. Funktsiooni kaod: · Geeni deletsioon · Osaline geeni deletsioon · Geenistruktuuri muutus (translokatsioon, inversioon) · Insertsioon geeni sisse · Transkriptsiooni takistamine · Promootormutatsioonid · mRNA stabiilsuse muut · Doonor splaisingu saidi muutus · Inaktiveeri splaisingu aktseptorsait · Aktiveeri krüptiline splaisingu sait · Lugemisraami nihke teke · Stopp koodoni teke · Vajaliku aminohappe asendus · Takistada protsessing · Takistada rakusisene 6ige lokalisatsioon Muutunud funktsioonid (peamiselt vähi puhul): · Üleekspressioon (CMT) · Retseptor on pidevalt aktiveeritud · Uus substraat · Strukturaalselt valed multimeerid · Kimäärsed geenid · Ioonkanalite funktsiooni muut Dominant negatiivsed mutatsioonid (kollageen) 15."Suurte" geenmutatsioonide tuvastamise meetodid
Ribosoomi väiksemal subühikul mRNA sidumispiirkond, mis toimib valgusünteesi initsiatsioonil. See piirkond koosneb eranditult rRNA'st ja moodustub 16S rRNA 3' otsas, mis paardub mRNA ribosoomi seondumispiirkonnaga (nn. anti-Shine-Dalgarno järjestus). Valgusüntees ribosoomidel jagatakse kolmeks etapiks: initsitsioon, elongatsioon ja terminatsioon. Initsiatsioonil toimub ribosoomi subühikute assotseerumine, valku kodeeriva ala alguse leidmine mRNA'l, õige lugemisraami fikseerimine ja esimese peptiidsideme süntees. Elongatsiooni käigus toimub valguahela pikenemine kuni stop-koodonini. Terminatsioonil toimub stop-koodoni äratundmine terminatsioonifaktori poolt, sünteesitud valgu, mRNA ja tRNA vabanemine ning ribosoomi subühikute eraldumine. Sellega on taastunud ribosoomide algne olek, st. subühikud on eraldi. 9
transitsioon (ingl. Transition)- Mutatsioon, mis põhjustatakse DNA- või RNA-molekulis puriini asendumisel teise puriiniga või pürimidiini asendumisel teise pürimidiiniga. transversioon (ingl. Transversion)- Mutatsioon, mis on põhjustatud DNA- või RNA-molekulis puriini asendumisel pürimidiiniga või vice versa (pürimidiin puriiniga). 11. Raaminihkemutatsioonid raaminihkemutatsioon (ingl. Frameshift mutation)- Mutatsioon, mis muudab mRNA lugemisraami nukleotiidide lisandumise või väljalangemise tõttu. 12. Transposoonmutagenees transposoonmutagenees (ingl. Transposon mutagenesis)- Mutatsioonide tekitamine transposooni sisenemisel geeni. 13. Punktmutatsioonilised haigused inimesel Tsüstiline fibroos, müotooniline lihasdüstroofia, soolevähk, sirprakuline aneemia, β-talasseemia, McArdle’i haigus, fragiilse X-i sündroom, Huntingtoni, Kennedy tõbi, tserebellaarne ataksia, Friedrichi ataksia 14. Malaaria 15
tavalisem. · Tsütosiini deaminatsioon: C->U · Depurinatsioon viib deletsioonini · Alküleerivad ühendid rikuvad guaniini ära · Aluspaaride analoogia · T dimeerub UV toimel · metülatsiooni vead: adeniin -> hüpoksantiin · replikatsiooni, rekombinatsiooni vead Võib jagada veel funktsiooni kaotavad mutatsioonid (retesessiivsed nt geeni deletsioon, geenistr. muutus mRNA stabiilsuse muut, lugemisraami nihe, stoppkoodoni teke jne.) või funktsiooni muutvad (dominantsed üleekspressioon, retseptor pidevalt aktiveeritud, uus substraat, ioonkanalite funkts. Muut; geenidoosi efekt duplikatsioonide tõttu jne) mutatsioonid. Nomenklatuur: · aminohappe asendus: R117H [positsioonis 117 R->H] · nukleotiidi asendus: · 621+1(G->T) [621 on eksoni viimane ja +1 introni esimene nukleotiid; +1 positsioonis toimus G->T];
PBP3 ning temaga assotsieerunud valkude toimel moodustub jaguneva raku keskele peptidoglükaani kaksikkiht. Min valgud MinCDE ja SlmA inhibeerivad FtsZ ringi moodustumist EnvA toimel toimub nende kihtide eemaldumine ja sellele järgneb välismembraani sissekasvamine. Raku jagunemisel osalevate valkude regulatsioon Suur osa raku jagunemisel osalevatest geenidest on kodeeritud mra operoni poolt. Selles operonis on leitud 16 avatud lugemisraami (ORF-i). Valgulised produktid on identifitseeritud 14 ORF-i puhul. Operonis on sisemisi promootoreid. ORF-ide vahed on väga lühikesed ning sageli asuvad kodeerivale järjestusele eelnevad RBS järjestusi sisaldavad regioonid eespoololevate ORF-ide lõpus. Neid geene sisaldavas regioonis on 7 sisemist promootorit, 4 neist paiknevad ftsA ja 1 ftsQ geenis. See võimaldab erinevaid geene erineval tasemel transkribeerida. Lisaks on promootorid veel erineva tugevusega
annaabi.ee 
