soolakontsentratsioone vaja. Samuti tuleks jälgida mis temperatuuri juures need restriktaasid töötavad. Enamusele sobib temperatuus 37 kraadi. Kontrollrestriktsiooni geelipildi analüüs. Minu restriktsioon õnnestus, kuna näeme, et eraldunud bänd on kuskil 600- 700bp, mis peakski nii olema. Rajal ei ole näha teisi segavaid bände ehk restriktaas ei ole kuskilt mujalt lõiganud. Praktiline töö nr.9: Bioinformaatiline sekveneerimise tulemuste analüüs Eesmärk: Kloneeritud plasmiidi sekventsi analüüs ja ümberkloneerimise plaani koostamine Töö käik ja analüüs: 14 Mina valisin DST_T7_E10.ab1 failist sekventsi Sekventsi kvaliteedi hinnang: Väga hea kvaliteet, usaldusväärsuse vahemik on suur ja tausmüra on väga vähe. Usaldusväärsuse vahemik : 23-820 Blast ja selle tulemused: 1. Identities 632/632 ehk kõik nukleotiidid klapivad ja ei ole toimunud mutatsioone. 2
· Selle tehnoloogiaga on saadud näiteks herbitsiidide suhtes resistentseid taimi. · Herbitsiid "Roundup", mille toimeaine on glüfosaat, mis ihibeerib aromaatsete aminohapete sünteesi taimedes, nii kultuurtaimedes kui ka umbrohtudes. · Seda herbitsiidi kasutatakse nn musta maa tegemiseks enne külvi. · tumefaciensi ja mitmete teiste bakterite vastav ensüüm on aga glüfosaadile tundetu. Agrobacterioumi vastav ensüüm on kloneeritud Ti plasmiidi ja viidud Agrobacteriumi abil sojasse. Saadi soja, mis oli resistentne glüfosaadi suhtes. Hairy root · Põhjustavad Agrobacterium rhizogenese tüved, kes omavad juurt indutseerivat plasmiidi pRi. Infektsioon toimub samuti nagu Ti plasmiidi puhul, kuid taimekoes ei moodustu kasvajakude, vaid toimub massiline juurte moodustumine. Juured võivad tekkida ükskõik millisel taime osal. Kui näiteks koetükki (porgandilõik)
valk, mida kodeerib rekombinantne DNA. On DNA kloneerimise teel saadud valk. Selliseid valke saab toota nt bakterite abil või transgeensete loomade abil. Mis on cDNA? cDNA (komplimentaarne DNA) on pöördtranskriptsiooniga saadud DNA koopia. Pöörd-transkriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse mRNA’lt cDNA’d. cDNA’d kasutatakse eukarüootsete geenide kloonimiseks prokarüootsetes organismides. Bakteri rakkudesse geenide viimisel peame me mRNA alusel tegema DNA. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Rekombinantsed valgud on meile väga praktilised, kuna saame neist toota erinevaid ravimeid nt. insuliini. Kasutatakse veel toidutööstuses ensüümid (piim, juust), keskkonnakaitses (toksiliste jääkide likvideerimine bakterite abil). Kloonitud geenid on kasulikud tegemaks uuritavast geenist kergesti hallatavaid koopiaid ja tootmaks selle põhjal vajaminevat valku. Sangeri sekveneerimise põhimõte.
Kloneerimine on DNA, raku või geneetiliselt identse ärglaskonna saamine, olemasolevate geenide koopiate tekitamine. DNA kloneerimine on teatud DNA lõigust koopiate tegemine, mida on võimalik teostada katseklaasis. Organismide kloneerimine on keerulisem: tuleb eraldada viljastunud munarakust tuum ja viia selle asemele teise looma somaatilise raku tuum. Seejärel viiakse munarakk asendusema emakasse ja sünnib kloneeritud järglane. Sündinud loom ei ole 100% oma ema, kelle somaatilisest rakust võeti tuum, koopia, vaid väga sarnane loom. 57. Miks on oluline teada organismide genoomide täispikki järjestusi? Loomade DNA kaudu võib jõuda lähemale inimhaiguste mõistmisele, ühtlasi täiustuvad teadmised bioloogiast ja evolutsioonist. Loomade DNA võrdlemine in omaga annab meditsiiniteaduse seisukohalt olulist infot ja setõttu valmisidki esmalt
42. Mis on cDNA? cDNA ehk komplementaarne DNA on RNA matriitsilt in vitro sünteesitud DNA molekul. In vitro on bioloogilise protsessi katseline läbiviimine või vaatlus organismiväliselt, katseklaasis. Isoleeritakse avalduvate geenid mRNA ning sünteesitakse pöördtranskriptaasiga komplementaarne DNA koopia ehk cDNA, selle kogu sisaldab vaid funktsioneerivate geenide kodeerivaid järjestusi. Viiakse läbi enne kloneerimist. 43. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Ravimitööstuses, kui kloneeritud DNA panna mingi looma sisse, siis loom hakkab tootma valku, nt insuliini saadakse nii. Saab teha transgeenseid organisme. 44. DNA sekveneerimise põhimõte. Sekveneerimine ehk järjestusanalüüs on DNA nukleotiidse järjestuse kindlaks tegemine. Ajalooliselt olid DNA sekveneerimise meetodid põhimõtteliselt kahte tüüpi: 1. Nukleotiidispetsiifiliste katkete tekitamine DNA- ahelas 2
populatsioonis on viiruse levik soodustatud, sest viiruse OVd satuvad massiliselt mullale ja lehtedele). Kuna NPVd on mitmetele kahjurputukatele väga virulentsed, kasutatakse neid taimekaitses (üle miljoni hektari soojauba Brasiilias ja mujal). Probleemiks on, et NPVd tapavad röövikud suhteliselt aeglaselt ja võimaldavad neil enne suremist taimi ulatuslikult kahjustada. Sellest ülesaamiseks planeeritakse kasutada geneetiliselt modifitseeritud NVPsid, millesse on kloneeritud putukavastaste toksiinide geene. Baculoviirused on väga tähtsad eukarüootse geeniekspressiooni vektorid (rekombinantsete valkude tootmine), kuna baculoviiruses leidub aktiivseid promootereid (polühedriini, p10, ka varajaste valkude promooterid) ja baculoviiruse genoomi saab kloneerida suuri inserte. Nudiviirused Nudiviirused on ebatüüpilised putukaviirused. Nende viiruste nimetus tuleneb sellest, et nende
Sbjct 36420564 CCGCGGGTCGGCGGGGAGGTTGGGCCCAGGGATAAAAGAACTGGGGCTGGTGGGGGGGAG 36420623 Query 61 GGGTTCCCGGCCTAGGGGAAGGGCTATGACAATGGAATGACAACCGCGG 109 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 36420624 GGGTTCCCGGCCTAGGGGAAGGGCTATGACAATGGAATGACAACCGCGG 36420672 . Tulemus: minu kloneeritud järjestus pärineb PARP16 geenist (kromosoom 15). 17 18
plasmiidi DNA molekuli. Sama koefitsendiga paljundatakse ka rekombinantset DNAd. 4.Rekombinantsete DNA kloonide eraldamine. Selektiivsöötmel kasvatatud kloonidest eraldatakse rekombinantne (milles on ühendatud eri liikidelt pärit DNA fragmendid) DNA. 41. Mis on cDNA? RNA matriitsilt in vitro (katseklaasis kunstlikult loodud ja kindlalt määratletud tingimustes) sünteesitud DNA-molekul. 42. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? Luuakse mudelhiired, et nende peal katsetades leida ravimeid erinevatele haigustele, võimalik on säilitada hävimisohus olevaid liike, toodetakse valke, uuritakse geeni struktuuri, huvipakkuvaid DNA fragmente saab uurimiseks lõputult paljundada, kloonitakse aiasaaduseid ja taimi, kloonitakse tüvirakke ravieesmärgil. 43. DNA sekveneerimise põhimõte selle protsessi käigus selgitatakse välja DNA nukleotiidne järjestus. 44
Query 121 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTAGTTGTTGCCCCGCTCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 180 |||||||||||||||||||||| |||||||||||| |||||||||||||||||||||||| Sbjct 94696 GCCCGGGGTTGGCTAATTTCTACTTGTTGCCCCGCGCAGGGCGGAGCGCCGAGGGGAAGG 94755 Query 181 AGGCCGCGG 189 |||| |||| Sbjct 94756 AGGCTGCGG 94764 15 "CpG island"i identifitseerimine inimese kromosoomis BLAT programmiga. Minu kloneeritud järjestus on pärit NMU geeni regioonist chr 4.(positsioon chr4:56,475,804- 56,475,988 ). Suurus: 185bp. 16
taustas uurida. Me võime kloonitud DNAsid kasutada praktilistel eesmärkidel, seda geneetilise koodi universaalsuse tõttu. Kui plasmiidi sisestada inimese geen ja sisestada see tagasi bakteri rakkus, siis hakatakse ka selle inimese geeni pealt transkribeerima mRNA'd. Siis hakkavad bakteri ribosoomid sünteesima selle mRNA pealt valke ja need valgud on täpsed samad, mis oleks tehtud inimeses. Plasmiidid looduslikult on bakterirakkudes, seega on kloneeritud järjestused otstarbekas viia bakterirakkudesse, aga pmst võib viia ka teistesse rakkudesse. Kui näiteks selline plasmiid sattub näiteks imetaja raku tuuma, siis tuumas hakkab ta käituma nagu iga teine DNA molekul. Kuid raku jagunemisel plasmiidi ei paljundata. Väga paljude eukarüüotsete geenide puhul, pärast seda, kui selle geeni pealt on valmis sünteesitud RNA, siis RNA ei ole mitte koheselt ,,küps", et teda oleks võimalik koheselt ribosoomides transleerida. Enne seda tuleb RNA'st
Selle DNA tegemise eesmärgiks luua DNA molekul, mida vabas looduses ei leidu ja millel on mingid uued omadused. Selle kombineerumine on võimalik, kuna kõikidel organismidel on DNA keemiline struktuur täpselt sama ja nende DNA erineb vaid nukleotiidse järjestuse poolest. 42. Mis on cDNA? Ehk komplementaarne DNA, mis on sünteesitud üheaheliselt RNA-lt (pöördtranskriptaas). Selle süntees on oluline etapp eukarüootsete geenide kloonimisel. 43. Millised on kloneeritud DNAde kasutusalad tänapäeval? 1. Saab uurida mingi geeni tegelikku funktsiooni e saab näha, millised muudatused kutsutakse rakus esile, kui sisseviidud geeni pealt hakatakse sünteesima valku. 2. Rakendusliku poole pealt on võimalik panna rakke sünteesima kloonitud geeni poolt kodeeritud valku tööstuslikel/kliinilistel eesmärkidel. Nt. kasutusel rekombinantsed DNA molekulid, kuhu kloonitud insuliini geen. Selline DNA viiakse laboritingimustes
uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T-antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni 124. 125. 126. 127. 128. 129. 130. 131. Esimene päev – rakkude transfekteerimine PEI-ga 132. Esmalt tuleb vaadelda rakkud mikroskoobis ja hinnata nende seisukorra. Rakud ei ole saastanud ega surnud. Rakkude tihedus on umbes 95%
Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis: • võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes • võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus • replitseerub episomaalsena rakuliinides, kus on ekspresseeritud SV40 viiruse large T- antigen (Cos1, Cos7), mis tähendab tugevamat ekspressiooni Figure 3 pEGFP C1 ekspressioonivetori kaart (Clontech). Joonisel on tähistatud plasmiidi funktsionaalsed osad ning numbriliselt on välja toodud kaugus mõttelisest plasmiidi alguspunktist.
10.Rakukiibid Transfekteeritud rakkude mikrokiibid: Positsionaalsed ja mittepositsionaalsed kiibid 25 Kasutatakse imetaja rakkudes ,,high-throughput" testidena uurimaks geenifunktsioone pärast mõjutamist potensiaalsete ravimite, patogeenide, keskkonnamõjude, stressifaktorite jne. poolt Positsionaalsed kiibid on tehnika, kus kasutatakse võrdluseks kindlaid cDNA-si ekspresseerivaid rakuklastreid X,Y koordinaatides. cDNA-d, on kloneeritud ekspressioonivektoritesse ja algselt seotud mikroskoobi slaididele. Pärast transfekteerimist adheeruvad rakud moodustavad elusa korrastatud ,,array". Eeliseks valkude natiivne vorm Cellomics CellChip (1999) kasutab märgistatud eri tüüpi rakke, mis püütakse plaadile kasutades erinevaid affiinsus reagente. Mittepositsionaalsed kiibid: Põhinevad mitte andmepunktide kogumisele X,Y koordinaadistikus vaid andmepunktid on assotseerunud unikaalsete eri päritolu koodidega
fusogeenseteks viirusteks, mis põhjustavad nakatatud rakkude liitumist. Siia kuulub Nelson Bay viirus, mis nakatab Austraalia lendrebased. Lindude reoviirused on reeglina patogeensed ja põhjustavad enamuses nakatatud rakkude liitumist (st. nad on fusogeensed viirused). Reoviiruseid on leitud ka madudel. Enim on uuritud imetajate reoviiruseid, milliste uurimiseks kasutatakse tänapäeval pöörgeneetikat (on olemas meetodid kloneeritud genoomi segmentidest infektsioonilise viiruse rekonstrueerimiseks). 3.1.1. Virion Reoviiruste virionide diameeter on ca 85 nm, ISVP-l (infectious subvirion particle) 80 nm ja core-osakesel 60 nm. ISVP on infektsioonilised ja erinevad täielikest virionidest valgulise koostise (ISVP-del puudub 3 valk) ning valkude konformatsiooni poolest. Virionid koosnevad kahest kontsentrilisest ikosaeedrilisest kapsiidikihist (välimine ja
so as to carry out the screening of the DNA molecules and analyse the modifications of the transcriptome brought by the transfection. In the drops, the cell can adhere to the support or maintained in suspension kasutatakse rakkude "high-throughtput" testidena uurimaks geenifunktsioone pärast mõjutamist. Positsioonilised kiibid on tehnika kus kasutatakse võrdluseks kindlaid cDNA klastreid X,Y koordinaadistikus. cDNA kloneeritud vektoritesse ja seotud mikroskoobi slaidile, pärast transfektsiooni adhereeruvad rakud moodustavad korrapärase array, eeliseks natiivne vorm. 11. Valgukiibid Valgukiipide eelis - vaheetappide puudumine, otseste interaktsioonide määramine, valguekspressiooni muutuste tuvastamine. Võimaldab tuhandete parameetrite üheagset analüüsi ühes eksperimendis. Valgukiibile on immobiliseeritud valgud, mida kasutatakse eelkõige valk- valk interaktsioonide tuvastamiseks
Madalaim 23 %-line GC-sisaldus on teoreetiliselt minimaalne väärtus, mis veel võimaldab kodeerida normaalse aminohappesisaldusega valke. Koodoni 3. positsioonis kasutavad mükoplasmad enamasti A-d või U-d. Mycoplasma ja Spiroplasma liigid kasutavad universaalset stop- koodonit UGA trüptofaani koodonina nagu mitokondrid. Acholeplasma's on UGA stop- koodoniks, trüptofaani kodeerib UGG nagu tavaliselt. Selle erineva koodonikasutuse tõttu ei saa mükoplasmadest kloneeritud geene ekspresseerida E. coli's. E. coli ei lülita UGA kohal valku Trp, vaid termineerib ahela sünteesi. Tekivad mittetäielikud valgud. Füsioloogia Mükoplasmad jagatakse fermentatiivseteks ja mittefermentatiivseteks. Mittefermentatiivsetel mükoplasmadel puudub heksokinaas, fosfofruktokinaas ja aldolaas ja EMP (Embden- Meyerhofi) rada neil ei funksioneeri. Küll aga saavad nad kasutada rasvhappeid ja alkohole ja neid aeroobselt lagundada. Kõigil seniuuritud mükoplasmadel on
Samuti tihti ei hakka tüvirakud täitma rolli, mida me soovime, et nad täidaks, näiteks ei taasta funktsioneerivat närvkudet. Lisaks suremusele kipuvad sisse toodud tüvirakud ka rändama minema, võib tekkida vähk. 44. Missugused on inimteraapias kasutatavad potentsiaalsed tüvirakkude allikad? 1) võtta inimeselt endalt tüvirakke, näiteks luuüdist, ning anda neid talle mujale tagasi. 2) Võtta lootelt. 3) võtta viljastatud munaraku blastotsüstist. 4) Võtta kloneeritud munaraku blastotsüstist 5) võtta lähedaselt sugulaselt? * loomadelt, hiired, sead aga see pole siis tüviraku tasemel, see on see, et võtad hiirelt tüviraku (või võtad hoopis koe), kasvatad neeru ning siis siirdad inimesele tegelikult siiski teed temast veidi GMO, lased tal enda sees kasvatada organi, opereerid välja ja siirdad inimesele (loom võib surra!) 45. Misugused onkogeeni kromosomaalse translokatsiooni molekulaarsed tagajärjed?
Parasporaalkehad on valgulised eeltoksiinid (protoksiinid). Valgu lagunemisel putuka vastse seedetraktis tekivad toksilised valgud, mis lüüsivad sooleseina. Moodustub sobiv keskkond ka batsilli endospooride idanemiseks. Vastne sureb. Kasutatakse taimekahjurite biotõrjes. Need preparaadid on maailmas suurimas koguses toodetavad biopestitsiidid. Kaubastatakse pulbrina, mis sisaldab spoore ja parasporaalkehasid. B. thuringensise toksiini (Bt toksiini) geen on kloneeritud ja sekveneeritud. Protoksiini M on 130-140 kDa, protsessitud toksiinil on M 30-80 kDa. Protoksiin on lahustumatu tavatingimustes ja seetõttu ohutu näiteks inimesele. Lahustuvaks muutub ta aluselises keskkonnas (pH9.5) ja redutseeritud keskkonnas (vastse sooles). Magnetosoomid Mõnedel bakteritel on leitud rakkudes magnetosoomid magnetiliste omadustega nanokerakesed. Magnettundlikud. Need koosnevad kas magnetiidist (Fe3O4) või greigiidist (Fe3S4)
Lon proteaas Lon proteaas on ATP-sõltuv seriini endoproteaas, mis degradeerib nii ebanormaalseid valke kui ka spetsiifilisi regulaatorvalke. Lon on tetrameerne valk, mis koosneb 87 kDa suurustest subühikutest. Substraadi lagundamise tulemusena tekivad 5 20 aminohappe pikkused oligopeptiidid. lon mutantides tõuseb looduslikult ebastabiilsete valkude eluiga, samuti temperatuuri-tundlike valkude ning organismile võõraste valkude (näiteks teisest organismist kloneeritud geenide produktid) eluiga. In vitro katsetes on näidatud, et Lon eelistab degradeerida kas osaliselt või täielikult denatureerunud valke. Samas on Lon-i substraadiks ka spetsiifilised valgud, näiteks SulA, mida vajatakse rakus ainult ajutiselt. SulA indutseeritakse SOS vastusena. See valk inhibeerib septumi moodustumise raku jagunemisel. Kui SulA-d rakus ei degradeerita, moodustuvad pikad rakkude filamendid ning rakud surevad. Clp proteaas
annaabi.ee 
