komplekslahusesse, kompleksis sisalduv Cu(II) taandub sukrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B, mille kogus määratakse tiitrimise teel kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrides tekib uuesti Cu(II) kompleks, määratakse lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1ml ensüümilahuse kohta. Töö käik · Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine o invertiini lahust võetalse 0,4ml o invertiini lahjendatakse 25x (kokku lahust 10ml) o lahustiks kasutatakse atsetaatpuhvrit pH 4,8 · Ensüümireaktsiooni läbiviimine o 50ml katseklaasi pipeteeritakse 25ml substraati (7% sahharoos atsetaatpuhvris)
Reaktisooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine · Proovidega katseklaasid jäetakse 15 minutiks sademe formeerumiseks seisma · Proovidega katseklaaside sisud filtreeritakse kuivadesse katseklaasidesse · Kontrollitakse, et filtraadid on täiesti selged · Proovide optilised tihedused määratakse spektrofotomeetril lainepikkusel 280 nm · Vastavalt saadud väärtustele leitakse kaliibrimissirgelt türosiini kontsentratsioonid · Koostatakse graafik, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni sõltuvust ajast · Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv valitud ajavahemikus · Arvutatakse ensüümipreparaadi aktiivsus Türosiini juurdekasv on 0,0044 · CTyr türosiini kontsentratsiooni muutus ajavahemikus, · t valitud ajavahemik, 1 min = 60 s · V1 reaktsioonisegu üldmaht, 26 ml · V2 valmistatud ensüümilahuse üldmaht, 5 ml
reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovid viiakse komplekslahusesse. Keemisel taandub vask ja moodustub Cu2O, mis eraldub punase sademena. Lahusesse jääb vaba triloon B, mille kogus määratakse tiitrimisega, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ja indikaatorit mureksiidi. Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse hulga järgi leitakse taandavate suhkrute kontsentratsioon (kaliibrimissirgelt). Töö käik Kasutati tahket invertaasi, mida kaaluti 0,01g ja millele lisati 5ml atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Seda segati klaaspulgaga 5 minutit. 50ml katseklaasi pipeteeriti 25ml 7%-list sahharoosilahust atsetaatpuhvris (pH=4,8) ja katseklaas asetati vesitermostaati 30-kraadi juurde 10ks minutiks. Samal ajal valmistati ette kolm 250ml koonilist kolbi, pipeteerides sinna 10ml komplekslahust.
Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades kindlakonsentratsioonilist 0,02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon-B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Töö käik Tegin oma vedela invertaasi preparaadist 40 kordse lahjenduse. 10 ml lahuse kohta 0,25ml invertaasi. Kasutasin automaatpipetti 250 mõõduga, millega viisin mõõdetud invertaasi gradueeritud katseklaasi ja lisasin 10ml märgini puhverlahust. Loksutasin ühtlase konsentratsiooni saamiseks. Lisasin 50ml-sse katseklaasi 25 ml substraati, milleks on 7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8.
Reaktisooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine • Proovidega katseklaasid jäetakse 15 minutiks sademe formuleerumiseks seisma • Proovidega katseklaaside sisud filtreeritakse kuivadesse katseklaasidesse • Kontrollitakse, et filtraadid on täiesti selged • Proovide optilised tihedused määratakse spektrofotomeetril lainepikkusel 280 nm kasutades kvartsküvette • Vastavalt saadud väärtustele leitakse kaliibrimissirgelt türosiini kontsentratsioonid • Koostatakse graafik, mis väljendab türosiini kontsentratsiooni sõltuvust ajast • Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv valitud ajavahemikus • Arvutatakse ensüümipreparaadi aktiivsus Katse tulemused Aeg Optiline tihedus Türosiini λ=280nm konsentratsioon
keedetakse, mille käigus taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena sadenev Cu2O ning lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B: Jägnevalt tuleb määrata tiitrimise teel triloon B kogus, kasutades 0,02M vasksulfaadi lahust ning indikaatorine mureksiidi. Tiitrimisel komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ning seda näitab ka indikaator: Kulunud CuSO4 koguse järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1g kohta. Töö käik: I. Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistan 4ml lahust ensüümi kontsentratsiooniga 3mg/ml (lahusesse 12mg) tahkest ensüümipreparaadist. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit pH=4,8. Ensüümi kaalun analüütlilisel kaalul, viin kvantitatiivselt
Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ning moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust. Lahusesse lisatakse ka indikaatorina mureksiidi, mis muudab värvi triloon B ja Cu(II)-ioonide kompleksi taastekkimisel. Suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrmiseks kulunud CuSO 4 hulga järgi kaliibrimissirgelt. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites: vedela ensüümipreparaadi korral μkat/ml, tahke preparaadi puhul μkat/g. Tiitrimisel toimub järgnev reaktsioon: Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistan vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Mõõdan automaatpipetiga 1 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9 ml atsetaatpuhvrit.
moodustub punane Cu2O sade. Keetmisel toimub järgnev reaktisoon: Järgnevalt tuleb tiitrimise teel määrata vabanenud triloon B kogus. Selleks kasutatakse 0,02M CuSO4 lahust. Lahusesse lisatakse ka indikaatorina mureksiidi, mis muudab värvi triloon B ja Cu(II)-ioonide kompleksi taastekkimisel. Tiitrimisel toimub järgnev reaktsioon: Suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrmiseks kulunud CuSO 4 hulga järgi kaliibrimissirgelt. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites: vedela ensüümipreparaadi korral kat/ml, tahke preparaadi puhul kat/g. Töö käik: 1. Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine: Tuleb valmistada vajalik kogus sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Lahustina kasutan atsetaatpuhvrit, mille pH=4,8. Mõõdan pipetiga 0,5 ml vedelat ensüümpreparaati ning viin selle gradueeritud katseklaasi. Lisan 9,5 ml atsetaatpuhvrit. 2
Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitrimisel komplekseerub triloon B Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist saab kindlaks määrata indikaator mureksiidi värvuse muutumise järgi. Taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi kaliibrimissirgelt. Kui on tegemist vedela ensüümipreparaadiga, siis avaldatakse invertaasi aktiivsus mikrokatalites ensüümilahuse 1 mL kohal, tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta. Katse käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Selleks kaausin 0,0108g tahket ainet invertaase ja lisasin sellele 5 mL atsetaatpuhvrit, mille pH oli 4,8. Loksutasin katseklaasi.
vask(II)oksiid. Cu2O eraldub punase sademena. Alles jääb ekvivalentses koguses vaba triloon-B. Vabanenud triloom-B kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kasutatakse 0,02 M vasksulfaadi lahust. Protsessi käigus komplekseerub triloon-B uuesti Cu (II) ioonidega. Lahusesse lisatud indikaator mureksiid muutub rohekaks, kui vastav kompleks on tekkinud. Tiitrimisel toimuv reaktsioon: Tiitrimiseks kulunud vasksulfaadi lahuse mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldataks e mikrokatalites ensüümlahuse 1 ml kohta. Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Automaatpipeti abil viiakse gradueeritud katseklaasi 0,25 ml vedelat ensüümpreparaati. Katseklaas täidetakse 10 ml-ni puhverlahusega. Katseklaas suletakse korgiga ja loksutatakse kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümreaktsiooni läbiviimine
Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Keetmisel toimub reaktsioon: Reaktsioonil vabanenud triloon B kogust määratakse tiitrimise teel, kasutades selleks 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)- ioonidega ja kompleksi taastekkimist võib täheldada lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel: Tiitrimiseks kulunud lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral ja tahke ensüümipreparaadi korral. 1 mikrokatal ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekudi jooksul juures produtseeritakse 1 mikromool produkti. Töö käik: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. · Doseerisin ensüümipreparaati sobiva automaatpipeti abil ja viisin otse lahuse
punane Cu2O sade. Keetmisel toimub reaktsioon näeb välja nii: Sellele järgneb triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M CuSO4 lahust. Tiitrimisel komplekseerub triloon B Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimist saab kindlaks määrata indikaator mureksiidi värvuse muutumise järgi. Taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus leitakse tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi kaliibrimissirgelt. Kui on tegemist vedela ensüümipreparaadiga, siis avaldatakse invertaasi aktiivsus mikrokatalites ensüümilahuse 1 mL kohal, tahke preparaadi korral mikrokatalites 1 g kohta. Katse käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin vajaliku koguse sobiva ensüümikontsentratsiooniga lahust. Selleks mõõtsin kaliibritud katseklaasi pipetiga 0,5 mL vedelat ensüümipreparaati invertiin ning lisasin sellele 9,5 mL atsetaatpuhvrit, mille pH oli 4,8
Keemisel taandub kompleksis sisalduv vask(II) suhkrute toimel vask(I)-ks. Seejärel moodustub Cu 2O, seda on näha punase sademena, mis tekib sinise lahuse põhja. Ekvivalentses koguses jääb lahusesse vaba triloon B. Vabanenud triloon B tiitritakse 0,02 M vasksulfaadi lahusega. Stöhhiomeetrilise punkti määramiseks lisatakse indikaatorina mureksiidi, mis värvub selles punktis roheliseks. Tiitrimiseks kulunud CuSO 4 lahuse hulga järgi leitakse eelnevalt juba koostatud kaliibrimissirgelt taandavata suhkrute kontsentratsiooni. Invertaasi aktiivsus avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta. Töö käik Valmistan töölahuse tahkest preparaadist. Selle jaoks kaalun analüüilisel kaalul juhendaja näpunäite järgi 10 mg (tegelikult kaalusin 0,0103 g ehk 10,3 mg) tahket invertaasi ja viin mahu 5 ml-ni. Lahjenduseks kasutan atsetaatpuhvrit (pH=4,8). Segan gradueeritud katseklaasi sisu klaaspulgaga, kuni tahke aine on enam-vähem ära lahustunud
Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0.02M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vaba triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varemkoostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta. TÖÖ KÄIK: Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine. Töölahuse maht on 10 ml ning vedela preparaadi maht on 1:40 ehk 10/40=0.25 ml. Mõõtsin selle automaatpipetiga katseklaasi ning lisasin atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4.8. Sulgesin katseklaasi korgiga ning loksutasin.
Cu(II) ioonidega. Kompleksi tekkest saadakse aru tänu lisatud mureksiidi (indikaatori) värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon: CH2N(CH2COONa)2 CH2N(CH2COO)2Cu CH2 N (CH 2 COONa)2 CH2N(CH2COO)2Cu Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimissirgelt suhkrute kontsentratsiooni reaktsioonisegus. 2. Töö käik 1.3 Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin 100 kordse lahjendusega töölahuse. Selleks võtsin 0,5 ml vedelat invertaasi preparaati ja 50 ml atsetaatpuhvrit. Tegin 100 kordse lahjenduse (algselt pidin tegema 50 kordse lahjenduse, kuid võtsin suurema mõõtkolvi ja sealt tuli ka suurem lahjendus). Segasin klaasi sisu 5 minuti vältel klaaspulgaga kuni ühtlase suspensiooni moodustumiseni. 1
reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon-B kompleksi. Reaktiiv lõpetab ensüümireaktsiooni ja tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub punase sademena eralduv Cu2O. Reaktsioonil vabaneb vaba triloon-B, mille kogus määratakse tiitrimise teel. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 mahu järgi leitakse kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus tahke ensüümi puhul avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta. 1 mikrokatal on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 °C juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (meie töös taandavat suhkrut). Töö käik Töölahuse valmistamine Kasutan töölahuse valmistamiseks tahket invertaasi. Vajan töölahust kontsentratsiooniga 2 mg/ml.
Eraldub reaktsioonisegust punase sademena. 2. Lahusesse jääb ekvivaletsetes kogustes vaba triloon B Reaktsioonil vabanenud triloon B kogus tehakse kindlaks tiitrimise teel: - Kasutada tuleb 0,02 M vasksulfaadi lahust - Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega - Taastekib kompleks, mis on detekteeritav indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. INVERTAASI AKTIIVSUS: - VEDEL ensüümpreparaat: avaldatakse mikrokatalites ensüümilahuse 1 ml kohta () - TAHKE ensüümpreparaat: avaldatakse mikrokatalites 1 g kohta (). NB! 1 - ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jookul 30°C juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1), st 1 taandavat suhkrut. 3.1.1. Töö käik ENSÜÜMPREPARAADIST
Seal olev vask(II)-triloon B kompleks laguneb reaktsioonil suhrutega ning lahusesse jääb vaba triloon B. Järgnes vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades 0,02 M vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leidsin kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsiooni reaktsioonisegus. Kõigepealt valmistasin invertaasi lahuse, et hakata määrama seal oleva invertaasi aktiivsust. Selleks mõõtsin vajalikud kogused ja mahud ning et töö tulemus oleks täpne tegutsesin kvantitatiivselt. Seejärel segasin, et moodustuks ühtlane suspensioon. Vedela ensüümpreparaadi doseerisin sobiva pipeti abil. Seejärel valasin katseklaasi reaktsioonisegu ja panin ta vesitermostaati juurde soojenema
kindlakontsentratsioonilist (0,02 M) vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav 75 lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon on järgmine: Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta (µkat/ml), tahke preparaadi puhul mikrokatalites 1g kohta (µkat/g). Meenutame, et 1 mikrokatal (1 µkat) on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 ºC juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1 µmol/s), st antud juhul 1 µmol taandavat suhkrut. Töö käik
annaabi.ee 
