kasutada? Transfektsioon on võõra DNA viimine rakku. Keemilised meetodid. Kaltsiumfosfaadi meetod, DEAE dekstraan Füüsikalised meetodid. Mikroinjektsioon ja elektroporatsioon Membraanide fusioonid. Liposoomid, katioonsed lipiidid ja DNA kompleks lipofektsioon (DNA) konstrukti sisestamine viiruste abil. DNA viirused= näit. SV 40 (simian virus) pôhinevad vektorid · Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega, mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI
tekivad üheahelalised otsad – “kleepuvad otsad”.Selliste otstega DNA juppe on komplemen-taarsuse tõttu võimalik mugavalt liita.Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA SLAID 6: RESTRIKTAASIDE JOONIS eelmisele slaidile sarnane seletus joonise põhjal SLAID 7: KUIDAS GEENID KOHALE VIIA? SLAID 8:KUIDAS ARU SAADA KAS GEEN ON ÜLE KANDUNUD? 1)Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) 2)Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. 3)Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. SLAID 9: Erinevaid meetodeid on tegelikult ligi 15, aga räägin põgusalt enim kasutatavatest. Loomadel: Embrüonaalsete tüvirakkude meetod: DNA paljastamine, rakkude süstimine teiste rakkude blastotsüsti, embrüosiirdamine, järglaste DNA uurimine N:hiired
väikesed avad ja DNA siseneb rakku. Tapab osa rakke maha. · sono-poratsioon ultraheliga · optiline transfektsioon laseriga tehakse raku membraani auk, kasulik üksikute rakkude uurimiseks. · pommitamine kullaosakestega (geenipüss) · magnetofektsioon DNA seotakse magnetiseeruvate nanoosakestega ja magnetvälja mõjul sisestatakse rakku. · Mikroinjektsioon DNA süstitakse otse üksikutesse rakkudesse, transgeensete loomade tegemisel kasutatakse 2. Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents- efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega,
o Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks- need lõikavad DNA lõikudeks, aga nii, et tekivad üheahelalised otsad- ,,kleepuvad otsad" o Selliste otstega DNA juppe on komplementaarsuse tõttu võimalik liita o Erinevate DNA-de liitmisel saadakse rekombinantne DNA · Kuidas aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? o Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud · Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina o Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisetatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui tka GFP-valk on valmis. · Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha · Helenduv kärss · GM-bakterid toiduainetetööstuses o Ensüümid o Maitsetugevdajad o Magustajad o Värvuse parandamiseks o Paksendajad o Säilitusained o Happesuse regulaatorid
Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Viirusvektor viib soovitud geeni rakku Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP (helenduv) geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp-koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab üle viidud geeni avaldumist organismis kindlaks teha: vaatad ja näed, et helendub! Fluorestseeruv valk GFP on saadud meduusist. O.Shimura eraldas esimesena Nobeli preemia 2008 Plasmiid, mis sisaldab GFP-geeni ja antibiootikumiresistentsust määravat geeni Inimese kasvajat
Kleepuvad otsad ühinevad Rekombinantne plasmiid Kuidas geenid kohale viia? 1. Bakteri plasmiidiga 2. Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduv-GFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp- koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP-valk on valmis. Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja
GMO-sid on 2. tüüpi 1. organismid kellesse on viidud võõra liigi geene transgeensed org. 2. Organismid kelle geen on rikutud nii ,et ta ei avaldu ja muutus pärandub edasi- nokautorganism kuidas saab geene kohalt viia? Transgeensete organismide puhul · bakteri plastiididega · viirusega · kullapüstoliga · taimedesse agrobakteriga( kasvajat tekitav bakter taimel) Üle viidavale geenile on markergeen külge pandud. Näiteks kasutatakse GFP(helendav ) geeni markerina. Seda saadakse süvavee meduusidest. Kui uuritava geeni lõppu , enne stoppkoodonit on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne ,kui ka GFP -valk on valmis Bakterid toodavad inimese valke alates 1978. aastast · esimene oli insuliin · Inimese kasvuhormoon · erütropoietsiin aneemia raviks · interferoon , mis reguleerib immuunsüsteemi · vere hüübimisfaktorid · Difteeria ja teetanuse vaktsiin
antikeha fluorokroomiga konjugeerida, lisaks võimendab see signaali, kuna iga primaarse antikehaga saab seostuda mitu sekundaarset antikeha. Alusklaasidele panemine on vajalik mikroskopeerimiseks. Sulundamislahus sisaldab DAPI-t, mis seondub DNA-ga ning fluorestseerub siniselt, see võimaldab fluorestsentsmikroskoobiga näha ka DNA-d. 14. a. Kontroll-plasmiidiga rakud: Pildil on näha siniselt DNA, roheliselt edukalt transfekteeritud rakkudes ekspresseeritud GFP ning punaselt antikehaga värvitud tubuliin. pEGFP FoxO3a-ga transfekteeritud rakud: b. Valke detekteerisin kahekihilise reaktsioonina. Primaarseks antikehaks oli Mouse anti tubuliin 1:500 ja sekundaarseks antikehaks Goat anti mouse Alexa546 1:2000. c. Sekundaarne antikeha on valitud kasutatud primaarse antikeha järgi. Kuna primaarne antikeha oli tehtud hiires, kasutasime kitses toodetud antikehasid, mis tunnevad ära hiire primaarsed antikehad (mouse anti tubuliini)
ligaasi 2. tekivad tömbid otsad Geenide kohale viimine: 1. bakteri plasmiidiga 2. viirustega 3. Kui neile on soovitud geen lisatud nim teda geenivektoriks 4. kulla-või volframipüstoliga 5. taimedesseagrobakteriga 6. Kuidas aru saada,et tegu on geeni ülekandmisega ? - pannakse külge markergeen(helenduv), mida on võimalik UV kiirguses jälgida - kui enne stoppkoodonit on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFP valk on valmis 7. Kasutatakse kasvarakkude uurimiseks 8. Miks bakterirakus ei hakka geen kohe tööle ? - eükarüootsete rakkude DNA sisaldab geenides eri tüüpi piirkondi: eksoneid(määravad aminohappe jrk) ja introneid(ei ole kodeeritavad,ei sisalda infot aminohapete kohta). - Kui toimub eükarüootse raku DNA-lt mRNA tootmine, siis sisaldab see ka introne, need lõigatakse mRNA-lt välja ja eksonid kleebitakse kokku.
Mitteviirusvektoritel on viirusvektoriga võrreldes olulised eelised ohutuse poole pealt. Kõige tähtsaimaks eeliseks on bioloogiline ohutus. 1997 Dr Jay Vacanti siirdas hiirele inimese kõhrkoe rakke ja kasvatas hiire seljas kõrva. 2002 lõid Caltechi teadlased pimedas helendavad hiired siirdades embrüodesse viirust, mis sisaldas meduuside rohelist helendust. Kasutatud kirjandus 1. http://www.businessinsider.com/genetically-modified-animal-experiments-20 15-10/#gfp-bunny-10 2. https://et.wikipedia.org/wiki/Geeniteraapia 3. https://et.wikipedia.org/wiki/Geenitehnoloogia 4. https://www.slideshare.net/chryssy/geenitehnoloogia?next_slideshow=1 5. https://www.slideshare.net/MihkelIlves/esitlus-bioloogia-geeniteraapia 6. http://geneetika.ee/lexicon/somaatiliste-rakkude-mitteparanduv-geeniteraapi a/ 7. http://www.genetherapynet.com/types-of-gene-therapy.html 8. Bioloogia õpik
Erinevate DNA-de liitmisel saame rekombinantse DNA. Kuidas geenid kohale viia? Bakteri plasmiidiga Viirustega Kui neile on soovitud geen lisatud, nime- tame teda geenivektoriks. 3. Kullapüstoliga 4. Taimedesse Agrobakteriga Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? Üle viidavale geenile on markergeen ka külge pandud (näiteks helenduvGFP) Nüüd kasutataksegi GFP geeni markerina: Kui uuritava geeni lõppu, enne stopp- koodoneid, on sisestatud GFP geen, siis vastava valgu süntees ei peatu enne, kui ka GFPvalk on valmis. Nii saab iga valgu translatsiooni toimumist organismis uurida. Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meie ja teiste loomade, seente ja taimede geenis on intronid ja eksonid. Pärast transkriptsiooni lõigatakse intronid välja ja ainult kokkuliidetud eksonid
Küpsel (naiivsel) B-rakul esinevad antikehad e. immunoglobuliinid (Ig) rakupinnal B-raku retseptori (BCR) koosseisus. Peale kokkupuutumist antigeeniga ja lisasignaalide saamist T- abistajarakkudelt diferentseeruvad B-rakkudest plasmarakud, mis produtseerivad sama spetsiifikaga sekreteeritavaid antikehi. Iga B-rakk ja tema järglaskond (kloon) produtseerib täpselt ühesuguseid antikehi. 51. Mis on roheline fluorestseeruv valk, milleks ja kuidas seda kasutatakse? GFP (green fluoroescent proteiin), see on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. Töö põhimõte seisneb selles, et GFP hakkab rohelise valguse käes helendama. GFP viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis. 52
Kuidas DNA-d lõigata? Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks. Restriktaase on erinevaid, igaühel oma “äratundmiskoht” DNA-l. Restritaasid lõikavad DNA sagely nii, et tekivad üheahelalised otsad - “kleepuvad otsad”. Selliste otstega DNA lõike on komplementaarsuse tõttu võimalik mugavalt liita. Kuidas kergesti aru saada, et soovitud geen on üle kandunud? - üle viidavale geenile on markergeen külge pandud (GFP-geen). Miks bakterirakus ei hakka inimese geen kohe tööle? Meis on intronid ja eksonid, kuid bakteris neid ei ole. Kui tahame bakterisse geeni via, siis peame selle mRNA alusel tegema DNA, seda protsessi, pöördtranskriptsiooni viib läbi PÖÖRDTRANSKRIPTAAS. Edasi saab cDNA juba liita bakteri DNA-ga ning ta hakkab tootma inimese organismis esinevat valku. Kui kasutame baktereid sel viisil mõne teise liigi geenide säilitamiseks, same genoomipanga.
elektroporatsioon, sono-poratsioon, optiline transfektsioon, magnetogektsioon, mikroinjektsioon). 121. Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (originit ning antibiootikumi resistentsusgeeni) kloneerimisala (MCS) – paljude erinevate restriktaaside lõikekohad uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) reportergeeni (GFP, lacZ jt.) või märgise (FLAG, myc, V5, GFP) järjestust eukarüootset promootorit ja polüadenüleerimisjärjestust selektsioonimarkeri ekspressioonikassetti 122. 123. pEGFP : võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud samas lugemisraamis uuritavat valku kodeeriv järjestus
materjaliteaduses, arstiteaduses, nanotehnoloogias, keskkonnakaitses. 2. Millised elukutsed eeldavad teadmisi geenitehnoloogiast? Biotehnoloog, geenitehnoloog, kriminalistid, labprandid, tehnikud. 3. Milliseid uusi teadusharusid on biotehnoloogia tekitanud? Geene viiakse ühest organismist teise või muudetakse mõnel muul viisil geene. Transgeenne organism - organism, kellesse on viidudnvõõraid geene (GMO). Geenivektor - viirus, kellele on lisatud soovitud geen. GFP geen - helenduv geen. Geeniteraapia - ravimeetod, kus püütakse asendada haige geen terve geeniga või vaigistada haige geen. Rakuteraapia - kasutatakse tüvirakkusid kahjustunud kudede taastamiseks. Genoomivahimees - püüab likvideerida DNA kahjustusi. ?Analüüsiv meetod Taimede või loomade heterosügootsuse määramiseks. Dominantse tunnusega isend ristatakse kaksikretsessiivse tunnusega isendiga. Kui järglased on kõik dominantsuse tunnusega, on uuritav
geeli värvimisega, polüpeptiidide ülekannet geelist nitrotselluloosfiltrile tehakse elektriväljas, filtreid töödeldakse analüüsitava valgu vastu tehtud antikehadega, antikehad lokaliseeritakse sekundaarsete antikehadega mis on märgistatud. Geene ja DNA järjestusi saab klonoteegist isoleerida kasutades molekulaarset hübridisatsiooni, märgistades DNA spetsiifiliste antikehadega. 52. Mis on roheline fluorestseeruv valk, milleks ja kuidas seda kasutatakse? GFP on nähtav rohelises spektris. Kui GFP siduda mõne teise molekuliga, geeniga, siis meid huvitav valk ei muuda oma funktsiooni, vaid on tänu GFPle nähtav fluorestsents mikroskoobiga. Tõi revolutsiooni geeniekspressiooni uurimisse valkude tasandil. Ühendgeene on mugav konstrueerida, kui koos uuritava geeni poolt määratava valgu järjestusega on neis GFP sünteesi määrav DNA- järjestus. Moodustuv hübriidne valk on sel juhul rakus UV valguses
Mis juhtub kui proovid ühes reaktsioonisegus kahe praimeriga korraga sekveneerida? Saame kaks nukleotiidset järjestus mis katavad üksteist ja teevad lugemise võimatuks. Väga pikkade fragmentide sekveneerimiseks kasutatakse forward ja reverse praimereid, kuid eraldi reaktsioonides. Praktiline töö nr. 10: Ümberkloneerimine Eesmärk: Sekveneerimistulemuste põhjal koostada plaan funktsionaalse ekspressioonivektori koostamiseks, millega saaks huvipakkuvat valku (liitvalguna koos GFP-ga) koekultuuri rakuloonides ekspresseerida. Töö käik: Leiame restriktaasid BamHI SalI KASUTAN C1 lugemisraami! Puhver Double Digest lehelt. BamHI buffer BamHI 2-fold excess of SalI Incubate at 37°C Mida on oluline ümberkloneerimisel silmas pidada? Inserdis ei tohi olla ümberkloneerimiseks kasutatave restriktaaside saite, kuna siis lõigataks meie kodeeritava ala keskelt fragment pooleks, aga me tahame tervet kodeeritavat ala saada.
Nimetus Kirjeldus Värv erinevad Tihedus 1,8...1,85 Lubatud töötemperatuur õhus, °C 150...180 Survetugevus, MPa 500 GETRONAX (GFP) Läbilöögipinge, kV/mm 8...15 Iseloomustus: Silmapaistvalt kõrgete mehaaniliste näitajatega: tugevus, jäikus, löögisitkus. Materjal leiab kasutust elektroonikatööstuses kus nõutud kõrged elektroisolatsiooniomadused. Võrreldes PP ja CFP ga on GFP ca. 33% kõrgema temperatuuritaluvusega. Polüuretaan
a) Allogeenseid rakke, siis on tegemist samalt indiviidilt pärit rakkudega; b) Ksenogeenseid rakke, siis on tegemist teiselt liigilt pärit rakkudega. 15. Kuidas luua selliseid transgeenseid taimi, et meie poolt sisestatud tunnus ei kanduks taimede paljunemisel õietolmuga edasi? a) Sisestada meid huvitav transgeen plastiidide genoomi b) Kasutada geeni sisenemise kontrolliks rohelise fluorestseeruva valgu (Green Fluorescent Protein- GFP) geeni c) Sisestada meid huvitav transgeen taime genoomi lillkapsa mosaiigi viiruse (Cauliflower Mosaic Virus) CaMV 35S promootori kontrolli all d) Viia vektori koosseisus taime genoomi teatud antibiootikumi (näit. hügromütsiini) resistentsusgeen 16. Bioremediatsiooni mikroobide või taimede abil on võimalik teha? a) In vivo b) In vitro c) In situ d) Ex situ 17
291. PCR reaktsioon: kindla DNA järjestse amplifikatsioon in vitro tingimustes, mis toimub paljukordse denaturatsiooni, oligonukleotiidsete praimerite hübridatsiooni ja polünukleotiidi sünttesi tsüklite tulemusel 292. Kontiigid: DNA kattuvad alad (segmendid) või kogum kattuvaid kloone, mille põhjal saab moodustada DNA pidevjärjestusecvõi konkreetse kromosoomipiirkonna füüsilise kaardi 293. Fluoresentsmärgistus: Meduusist pärit roheliselt fluorestseeruv valk GFP- GFP-valgu järjestuse saab sisse viia uuritava geeni ette (variant 1) või järele (variant 2) ilma geeni poolt kodeeritava valgu funktsiooni muutmiseta, hübriidvalk on fluorestsentsi tõttu jälgitav elusates rakkudes, kudedes ja organismis. 294. Mikrokiibid: diagnostiline meetod, kus ränikihiga klaasile on korrapäraselt üliväikestesse sektoritesse seotud tuhendeid in vitro sünteesitud lühikesi diagnostilisi geeniproove, mis hübriiduvad vaid DNA täieliku homoloogsuse korral, saab uurida
Loomarakkudele mõeldud plasmiid sisaldab: • komponente, mis võimaldavad plasmiidi bakteris paljundada (origini- prokarüootset replikatsiooni alguspunkt, antibiootikumi resistentsusgeeni) • kloneerimisala (MCS) – sisaldab paljude erinevate restriktaaside lõikekohti • uuritavat järjestust (valkude korral tavaliselt cDNA kujul) • eukarüootset promootorit (CMV, SV40) ja polüadenüleerimisjärjestust(SV40) Sageli ka: • reportergeeni (GFP, lacZ jt.) järjestus • märgise järjestus(FLAG, myc, V5, GFP) • selektsioonimarkeri ekspressioonikasset Praktikumis on kasutusel pEGFP (enhanced green flourescent protein) ekspressioonivektor, mis: • võimaldab ekspresseerida EGFP-d (roheliselt fluorestseeruv valk) eukarüootsetes rakkudes • võimaldab ekspresseerida EGFP liitvalke, kui EGFP geeni ette või järele on kloneeritud
kasutusel. Uus suund: taime ainevahetuse markergeenide suunas (phosphomannose isomerase, xylose isomerase etc) (loeng 7) Reporter geen - Paigutatakse huvi all oleva geeni lähedale Et oleks lihtne identifitseerida transformeerunud rakke Et saaks hinnata ekspressiooni Näiteks: beta glucuronidase gene (gusA gene) toodab sinist molekuli (transformeerunud rakud on sinised) Roheline fluorestseeruv valk (green fluorecent protein - gfp) rakud helendavad rohelise valguse käes Lutsiferaas (luciferase) jaanimardikast rakud helenduvad pimedas Transformatsioon - Geneetilise materjali taime viimine Biolistiline meetod (gene gun) Agrobacteriumi abil (loeng 7) Biolistika - Mehhaaniline meetod Nö. Geeni püss ja kullast kuulid Kulla osakesed kaetakse DNAga ja tulistatakse taime kudedesse DNA satuvad raku sisse ja 12 tunniga siseneb DNA tuuma ja integreerub taime genoomi.
embrüot (embrüovälistes kudedes), aga erinevatel liikidel erinevas kohas.Hiirtel: esmased sugurakud tekivad rakuvälises mesodermis. Naaberkudedest (trofoblast) sekreteeritavate BMP’de (valgud)indutseeritakse esmastes sugurakkudes transkriptsioonifaktorid Blimp1/Prdm1 ja Prdm14 mis determineerivad nende saatuse. Embrüonaalne induktsioon. Imetajate sugurakkude eellased rändavad rebukotist mööda tagasoolt gonaadide algmetesse. Fluorestseeruvate (GFP) PGC jälgimine hiire embrüos: rändavad E7-E9 tagsoole kaudu gonaadi algmesse. Rännu jooksul paljunevad 10-100 2500-5000ks. Steam cell factor (SCF) ja tema türokinaasretseptor Kit: vajalik nende eluhoidmiseks,liikumapanekuks.Sugurakude eellased imetajatel: diploidsed, jagunevat mitootilisels, sooliselt neutraalsed. Gonaadides: oogenees ja spermatogenees.Paljunevad mitootiliselt, massiliselt, soospetsiiline eristuminem, meioosi teostumine, haploidne genotüüp (osaliselt munarakuse)
Fluorestsentsmikros-koobis on valgusallikaks elavhõbedalamp, mis annab lühilainelist kiirgust (paljudel lainepikkustel). Immuunfluorestsents: Elavhõbedalambiga valgustatakse helendavate värvainetega märgistatud antikehasid. Epitope tagging – märgitud liitvalkude (fusion proteins) tehnoloogia. Liidesega valk ehk liitvalk (näiteks lisatakse uuritvale valgule – täpsemalt seda kodeerivale dna-le fluorestseeruva valku nagu green fluorscent protein - gfp kodeeriv dna või peptiide järjestuse (kuni 8-12 aminohapet, nt flag, muc, v5, e2 (tartus välja töötatud!) Dna, nende tag’ide äratundmiseks on olemas kommertsiaalselt saadaval antikehad. Niisugust ‘’tägitud’’ valku kodeeriv cdna viiakse tootmiseksbakteri- või eukarüootsetesse rakkudesse. Epitoop –immunoloogias see osa (uuritavast) valgust, mida (spetsiaalselt katseloomas toodetud) spetsiifiline antikeha (ka valk) ära tunneb.
). Kaksikute meetod uurida ühemunakaksikuid erinevates keskkonna tingimustes. 2. Kaasaegse geneetika rakendusalad põllumajanduses. Transgeensed organismid. Organismi kloonimine. GMO ehk geneetiliselt muundatud organismid (teatud tunnuste uuendamine). Transgeensed taimed – suurendada kahjuritele vastupanuvõimet (eritavad toksiine, mis peletavad putukaid), saab pikendada viljade säilivusaega (tomat), saab pärssida teatud geenide avaldumist (GFP valk UV valguses on lehed rohelised ja klorofüll punane ehk taim on kollane), külmatolerantsed taimed (vetikalt on isoleeritud geen, mis vähendab külmatundlikkust, „kuldne riis“ toodab β-karoteeni (riisi on sisseviidud selliseid geene, mis toodavad rauda ja karoteeni). Lisaks on olemas transgeensed mikroorganismid bakterid, mis toodavad valke ja hormoone (kasvuhormoon ja insuliin + renniin – varem saadi seda vastsündinud vasikate maost, kuid nüüd bakterid
Gene dosage compensation)- Emasimetajatel on kahest X-kromosoomist üks juhuslikult valitud inaktiveeritud olekus. See tagab X-liiteliste geenide avaldumise emastel ja isastel. 14. Inimese genoom 1. Esialgne annotatsioon Haploidne genoom Diploidne genoom 2. ENCODE projekt Geenidelt käitumisele Selgitab kuidas kogu organism käitub 3. Laikhübridisatsiooni analüüs Geenide aktiivsus 4. GFP-liitvalk Kohapeal (in situ) hübriidimine 15. Inimese valkude homoloogia teiste liikidega Prokarüoodid>1%, homoloogia loomadega puudub 1%, ainult selgroogsed 22%, selgroogsed ja teised loomad 24%, loomad ja teised eukarüoodid 32%, eukarüoodid ja prokarüoodid 21% 16. Mitokondri geenid mitokondriaalne DNA (ingl. Mitochondrial DNA, mtDNA)- Rõngakujuline DNA-molekul mitokondrites, mis pärandub järglastele
Seostuvad aluspaaride vahele, mille järel nende fluorestsents tõuseb ligi 30 korda. Neeldumis maksimum 535 nm ja kiirgamise maksimum 617 nm. Märgistatud antikehade kasutamise põhimõte kaudse immuunotsütokeemia meetodi puhul. Antigeenile seondubantikeha, millele omakorda seondub märgistatud antikeha Konfokaalse skanneeriva fluorestsentsmikroskoopia põhimõte. Fluorestseeruvate hübriidvalkude saamine ja kasutamine elusate rakkude uurimiseks. GFP märgistatud valgu liikumist saab jälgida Läbiva kiirega ja skanneeriva elektronmikroskoobi tööpõhimõte. Läbivat kiire puhul on näidis keskel ning pilt tuleb floursent ekraanile. Näeb raku sisse Skaneeriva puhul on näidis all ja pilt tuleb ekraanile, näeb raku pealmist poolt Preparaatide valmistamine läbiva kiirega ja skanneeriva elektronmikroskoopia jaoks. Preparaat vaigust, lõigatakse teemnatiga, kaetakse vask võrguga Skanneeriva jaoks- kaetakse plaatinaga ja süsinikuga
tõukab lindu ülespoole. Linnu lennates on ülespoole liikumise kiirendus niisama suur kui raskuskiirendus, kuid sellega vastassuunaline, nii et mõlemad kompenseeruvad ja lind lendab konstantsel kõrgusel. Kuidas näevad välja elusaine-valkude (koosnevad 20 aminohappest) ja DNA (koosnevad 4 nukleotiidist) spektrid? Mõlemad neelavad ja kiirgavad põhiliselt nähtamatus UV piirkonnas. Spektrid on tavaliselt laiad. Aga on ka erandeid, nt joonisel näidatud GFP valgumolekul, mille neeldumisspekter asub nähtavas spektripiirkonnas Molekuli suurus on 10-8- 10-7cm ehk 10-10- 10-11m.Tunneliefekt: e võib teatud tõenäosusega läbida madala ja kitsa potents.barjääri. Orbitaalide kattumisel ( lainefunktsioonid) ja liituvad ehk interfereeruvad. Selle liitumise tulemusena moodustuvad molekulaarsed orbitaalid (MO) hõlmavad kogu molekul, mitte ainult konkreetset aatomit. Miks heelium molekule ei moodusta? Kõik elektronid on paardunud spinnidega, intergaas
Kromosomaalsete liitjärjestuste tekkimine viib märklaudgeeni aktiivsuse pärssimisele ja nii on võimatu isoleerida promootor-reportergeeni liitjärjestusi, kus promootor kontrollib rakule eluliselt tähtsate geenide tööd. Ainus võimalus on konstrueerida genoomseid raamatukogusid, kus DNA fragmendid viiakse plasmiidis asuva reportergeeni ette. Reportergeeni poolt kodeeritud valk võib rakus ka ise stressi indutseerida. Näiteks, kui kasutada reporterina GFP-d (green fluorescent protein) kodeerivat geeni, võivad rakus indutseeruda kuumashoki geenid. Kuumashoki vastuse kutsub esile GFP aeglane voltumine rakus. 3. Geenikiibid (gene chips, microarrays). Tahkele kandjale viidud DNA järjestused pärinevad organismi erinevatest geenidest ning neile hübridiseeritakse rakkudest eraldatud totaalsele mRNA-le sünteesitud cDNA proov. Sel viisil võrreldakse erinevate mRNA-de ekspressioonitaset bakterirakus nii erinevate
annaabi.ee 
