Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH - rühma tõttu. Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine Kontsentreeriv geel geel), (Ülemine geel) , 4% 10% Vesi 4,5 ml 3 ml 4x separating( stacking) 2,5 ml 1,25 ml buffer 40% 2,5 ml 0,5 ml
Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB41 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,, laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri, mis on kindla suurusega valkude segu (selle järgi teeme hiljem kindlaks enda uuritud valgu suuruse, kD). Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (ülemine 10% geel) , 4% Vesi 4,5 ml 3 ml
Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,,laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine: Lahutav geel (alumine geel), Kontsentreeriv geel (Ülemine 10% geel) , 4% Vesi 4,5 ml 3 ml 4x separating( stacking) buffer 2,5 ml 1,25 ml
aeglasemalt välja. Elueerimismaht on maksimaalne Vxmax D. Viimasena väljunud komponendi elueerimismahu võrdlus arvutusliku Vxmax väärtusega. Vxmax (tegelik) = 54 ml Vxmax (tegelik) = 78 ml Vxmax (arvutuslik) = 111,96 ml 112 ml Vxmax (arvutuslik) = 77,76 ml 78 ml Arvutuslik Vxmax-i on oluliselt suurem tegelikust Vxmax ist. Selline viga tekkis ilmselt seetõttu, et ma ei kandnud proovi geelile ühtlaselt. Viga võis tekkida ka kolonni diameetri ja kõrguse mõõtmisel, mis viis arvutusliku Vxmax-i veani. Arvestades kolonni diameetri mõõtmise viga, tulevad arvutuslik ja tegelik Vxmax võrdsed. E. Liikuvusteguri Rf väärtus. Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin = (18 6)/(111,96 6) = 0,1133 Rf = Vx Vxmin / Vxmax - Vxmin = (40 28)/(77,76 28) = 0,2412 KOKKUVÕTE Eraldasin geelkromatograafiliselt kolme erineva molekulmassiga ained segust. Katse oleks
- eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min DNA Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). Ei teinud, sest lahus oli piisavalt puhas. (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 2-3 l DNA-d 2,5 l DNA-d + 10 l 1 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. 9 1kb 1kb Kristine Arvidas Hannes Oksana Marker Marker MihkelMihkel HeleenHeleen KseniaKsenia MarkoMarko JelenaJelena Doris Doris
vesi 4x lahutava geeli puhver SDS-i 10% lahus akrüülamiid/bisakrüülamiidi lahus Viimastena lisasime TEMED tõmbe all (ebameeldiva kalmaitselise lõhna pärast) ja seejärel APSi, mis katalüüsivad polümerisatsioonireaktsiooni. 2. Valasime alumist – lahutavat geeli – kahe klaasplaadi vahele. Geeli lahust plaadidevahelise ruumi täitsime nii, et ülemise ääreni jääks ~2 cm ruumi. Jälgisime, et ei tekkiks õhumulle. Kandsime geelile 1 ml EtOH. Lasesime geelil tarduda (8-15 min). Selleks, et jälgida geeli tardumist(polümeriseerumist), kasutasime falkooni: kui falkoonis ülejäänud geel on tardunud, võib teha järgmist etappi (etanooli visata ära ja kontsentreeritava geeli peale valada) 3. Valmistada kontsentreeriva geeli (stacking gel) lahus (NB! Kui lahutav geel on polümeriseerunud): Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% 0,67 ml 4x kontsentreeriva geeli puhver (0,5M Tris-Cl, pH 1,25 ml
- sega korralikult läbi - tsentrifuugi maksimaalsel kiirusel 8-10 min - eemalda supernatant - pesemiseks lisa sademele ~200 l 70% etanooliga ja tsentrifuugi uuesti 2-3 min 7 Eemalda pesulahus ja lahusta saadud DNA (peab olema silmaga nähtav kogus!) 50 l TE-s. Selliselt eraldatud/puhastatud DNA on valmis restriktsioon-analüüsiks, PCR reaktsiooniks ja sekveneerimiseks (järgmises praktikumis). (10) Kanna geelile 1/30-1/50 oma DNA lahust: 10 l DNA-d + 2,5 l 5 x TBE foreesi pealekandmis-puhver (lilla) Pipeteeri kogu lahus geelil olevasse ,,hambasse" ja elektroforeesi ~1 tund 100V juures. Elektroforeesi tulemused: Lisaülesanded: 3.1) Võrdle antud protokolli DNA kokaraamatus tooduga (vt. lisa). Millised etapid on samad, millised erinevad? Sinu arvamused, ettepanekud, küsimused? Kokaraamatus lisatakse lahust III 150µl ,me lisasime lahust III 400µl.
· uuritav segu: o dekstraansinine (6mg/ml) o müoglobiin (6mg/ml) o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt · avatakse väljalaskeava ja jälgitakse, et eluenti oleks alati geeli kohal kui proov on täielikult geeli sisenenud, hakatakse juurde lisama eluenti, alguses väiksemate kogustena jälgides, et geel ei jääks kuivaks · kuni kolonni allaossa jõuab dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti, mis kogutakse ühendatud fraktsioonina kuiva 100 ml kolbi
tugevuse võitlemiseks lõhestumise ja koorumise vastu. Küünte kahjustustega võitlemiseks on kaks parimat vitamiini ja meineraali: A-vitamiin ja kaltsium, sest need lisavad kasvamist ja tugevdavad küüsi loomulikul teel. Naha määratlemine 4 Nahatüübi määratlemine on sama oluline kui küünetüübi määratlemine, sest nii saab valida endale sobivat toodet. Kõik tihedad kreemid ei sobi kõigile nahatüüpidele ning mõned reageerivad palju paremini niisutavale geelile või tavalise vee piserdamisele. Kuna käte nahk on regulaarselt ilmastiku ja keskkonnamõjutuste käes, seega on koormus suur, siis tuleks nende eest hästi hoolitseda. Kuiv nahk Kuiva naha puhul tuleks seda kuivust ravida rasvarikka pehmendava kreemiga, et moodustada kaitse vee kaotuse vastu. Naha ergutamiseks ja selle toitainetele vastuvõtlikumaks muutmiseks on suurepärased kuumad õli- ja vahaprotseduurid. Käsi tuleks niisutada ka pärast käte pesemist. Veepuuduses nahk
Tulemused: 6 Minu rada: 11 Mida näen geelis oma rajal? Mida saan sellest geelipildist järeldada? Näen oma rajalt, et minu DNA fragment on kuskil 600-700 aluspaari pikkune, mis on ka täiesti korrektne, kuna kasutasin Dystonini(DST), mis on eelantud tabeli järgi 644 aluspaari pikkune. Samas saan järeldada, et DNA kontsentratsioon on suur. Mis juhtub, kui DNA laadimispuvrit lisada arvutatust 2x rohkem? Mis juhtub, kui seda PCRi produktile enne geelile pipeteerimist üldse ei lisata? Ei tohiks nagu midagi juhtuda. Kui me puhvrit üldse ei lisa, siis ei näe pärast oma DNA bände ja seda on algselt raksem hambasse pipeteerida. DNA võib hambast välja voolata. Mis juhtub migreeruva DNA-ga, kui elektroforees „ununeb“ jooksma mitmeks tunniks? Kus on DNA? Mida kauem hoidad, seda kaugemale DNA liigub. Lõpuks meil ei ole geelis enam DNAd näha, sest DNA läheb puhvrisse. Praktiline töö nr.4: DNA puhastamine agaroosgeelist
järjekorras kokku: mQ – 4,0 ml 4x lahutava geeli puhver (1,5M Tris-Cl, pH 8,8) – 2,5 ml SDS-i 10% lahus – 0,1 ml Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% lahus – 3,3 ml Polümerisatsioonireaktsiooni katalüseerimiseks: TEMED – 7 µl tõbmekapi all APS – 70 µl 2. Valasime alumise – lahutava geeli – kahe klaasplaadi vahele nii, et ülemise ääreni jäi ~2 cm ruumi. Kontrollisime, et õhumulle ei tekkinud. Kandsime geelile 1 ml EtOH ning ootasime kuni geel tardus (8-15 min) jälgides polümeriseerumist külili asetatud falkonis. 3. Valmistasime kontsentreeriva geeli (stacking gel) lahus, selleks segasime omavahel antud järjekorras kokku: mQ – 3 ml 4x kontsentreeriva geeli puhver (0,5M Tris-Cl, pH 6,8) – 1,25 ml SDS-i 10% lahus – 50 µl Akrüülamiid 30%/ bisakrüülamiid 0,8% lahus – 0,67 ml Polümerisatsioonireaktsiooni katalüseerimiseks:
Vajab tööks Mg ++. Lõigatud otsad jäävad üheahelaliseks (aka. kleepuvad otsad). 12. Miks ei või geeli vette teha vaid peab puhvrisse panema? Agaroosgeel peab olema tehtud puhvrisse, sest kui seda jooksutada ka puhvris ja kui geel on tehtud vette, siis Tris puhver tõmbab geelist vee välja. Tagab stabiilse pH. Oluline, sest DNA/RNA laeng sõltub keskkonna pH-st. 13, Miks kasutatakse laadimispuhvrit ja mis on see tavaliselt? DNA proovide kandmisks geelile kasutatakse laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. Proov vajub kaevukese põhja. 13. Miks sisaldab puhver ka etiidiumbromiidi? Selleks, et hiljem visualiseerida DNA froees UV-valguses (254 nm). 14. Mis suunas liiguvad geelis molekulid? Liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile (+). 15. Kui sul on kaks E.colit, mida teed, et teada saada kas RecA on olemas? 1) PCR 2) UV-ga kiiritad UV-ga kiiritad. Kui RecA on olemas, siis aktiveerib see RecA proteolüütilist
roostevaba metalli. Kasutamine: Pihusta ainet määrdunud kohale ja oota 1 minut, väga määrdunud pinna puhul oota 5 minutit, seejärel puhasta. ÄRA KASUTA MARMORI PUHASTAMISEKS! Koostis: nonjontensiid, lõhnaaine, sidrunihape Esmaabi: Kokkupuutel nahaga loputa rohke veega. 11. EMANCO TOARENT WC poti puhastusaine. Eemaldab efektiivselt mustuse ja bakterid. Üheaegselt desinfitseerib japuhastab. Tänu spetsiaalsele geelile, püsib pind kauem puhas. Emanco TOARENT tagab tõelise puhtuse jättes ka värske lõhna. Tee nii: 1. Pihusta ainet WC poti ääre alla 2. Oota 30 minutit 3. Pese harjaga ja loputa veega Koostis: sidrunihape, nonjoontensiid, parfüüm, värvaine 6 Kristina Soboleva Erinevad puhastusained Nõudepesuvahendid 12. NÕUDEPESU ACCENT
Vxmax = 77,5 ml Arvutan liikuvusteguri Rf väärtuse segus sisaldunud valgu jaoks, kusjuures pean silmas, et valemis kasutan arvututatud Vxmax väärtust: Kokkuvõte Nagu katse tulemusel selgus, siis arvutuslik ja eksperimentaalne V xmax erinesid üksteisest tublisti. Kuigi arvutuslikuks Vxmax väärtuseks sain 91,7 ml, siis katse käigus selgus, et minul oli viimasena väljunud komponendi elueerimismaht 77,5 ml. Viga arvan peituvat ebatäpses lahuse kandmises geelile. Parkinsoni tõve ma ei kahtlusta, küll aga võis käsi väriseda ilmselt suure elevuse tõttu, sest härra Pöial ei tahtnud automaatpipetti käsitledes härra Mõttetööga koostööd teha. Viga võib peituda selleski, et sugugi mitte kõik katseklaasid, mida eksperimendis kasutasin, polnud korralikult kalibreeritud: osa oli korralike üliõpilaste poolt väga puhtaks pestud ning sellega oli maha pestud ka vajalik joon. Osa katseklaasidesse läks tegelikult ka pisut rohkem lahust kui lubatud
lahustuma) ning lahustumine muutub kahesuunaliseks- polümeer pundub. Pundumine on iseloomulik kõrge M- massiga ühenditele. Pundumine võib lõppeda tõelise lahuse tekkega- piiramatu pundumine ( benseen + nat. kautzuk). Võib lõppeda ka polümeeri ahelate osalise lahustumisega ja tekib geel e. tarre - piiratud pundumine. Pundumist võib piirata polümeeri võrkstruktuur või halb lahusti. Võrkstruktuuriga polümeer on lahustumatu ja annab geeli, mille võrgus on lahusti, mis annab geelile elastsuse. Kui võrkstruktuur on väga tihe, siis lahusti ei pääse üldse süsteemi- näit. naturaalse kautzuki vulkaniseerimisel S (väävliga)-ga tekib polümeer -eboniit, mis on väga tugeva võrkstruktuuriga ja ei lahustu. Geel võib üle minna ka tõeliseks lahuseks : termopöörduv ja termopöördumatu geel. Polümeeride vananemine. Püsivus jaotatakse klassidesse: 0,5 - 500 aastani eluea järgi T < 0,5 aastat C < 20 aastat B 20....100 aastat A2 >100 aastat A1 > 500 aastat
võime proove kanda, näiteks DNA'd. Pannes geeli elektrivälja, siis teatud (omades laengut) juhul võivad molekulid läbi geelis olevate pooride teise elektroodi poole. Kõik nukleiinhapped hakkavad läbi geeli seega elektroodi poole liikuma. Kui proovis on erinevaid nukleiinhappemolekule, siis pikema ahelaga molekulid liiguvad aeglasemalt kui lühemad. Nii saame ahelaid üksteisest eraldad sõltuvalt nende suurusest//. Sandler pani katseklaasides sünteesitud ahelad geelile ja lahutas nad. (mingi radade jama). POLÜMERAASI AHELREAKTSIOON - PCR 12/11/09 Garry Mullis sai Nobeli preemia selle meetodi väljatöötamise eest. DNA sünteesi reaktsiooni jaoks oli vaja DNA polümeraasi (ensüümi), matriits-DNA, dNTP (4). Tegelikult sellisel kombel reaktsiooni ei toimu. Puudu on praimerid (lühike DNA lõik). DNA polümeraas ei suuda hakata nullist DNA ahelat sünteesima, küll aga olemasolevat ahelat pikemaks tegema
1. päev: kasutatava agaroosgeeli kangust arvutatakse võttes arvesse oodatava produkti pikkust. Meie kasutasime 1% geeli. Segasime kokku 100 ml TAE puhvrit, 1 gr agaroosi ning kuumutasime mikholaineahjus sulamiseni. Jahtunud geelisegule lisasime1 μl EtBr, mida kasutatakse DNA visualiseerimiseks. Valasime lahus geelialusele ning jätsime tarduma järgmise praktikumini. 2. päev: lisasin PCR segule 4 μl 6x DNA värvi, et DNA nähtav oleks, ning kandsin kogu segu TAE geelile (hambasse). DNA lahutamine toimub elektrivoolu toimel (100 V 15 min) 25. 26. 27. 28. 29. 30. Kuna minu produkt ei ole üldse geelipildil nähtav, võin järeldada, et midagi tegin valesti PCR reaktsiooni teostamisel (nt. viga pipeteerimisel või mingi muu viga). Sain geelitükki teiste plasmiidi ja praimeritega. 31. Plasmiid mEB1 pEGFP-N1, praimerid mEB1F ja mEB1R. Oodatav pikkus – 700 aluspaari. 32. 33.PCR produkti puhastamine geelist Zymoclean kitiga. 34
3.1 Praktikum – DNA lahutamine geelis Visualiseerime ona PCRi produkti selleks, et kontrollida, kas reaktsioon toimus nii, kui oli oodetud (mitte inhibeeritud, kas kõik komponendid oli lisatud õigesti, kas programm oli koostatud ilma veata jne). Selleks lisasime PCR segule 4 µl 6xDNA värvi, et DNA ilusti hambasse vajuks ja tema migreerumisteekond oleks nähtav. Kandsin kogu segu TAE geelile ja jäätsime geelis lahutama 15min jooksul konstantse pinge all (100V). DNA lahutamine toimub geelis tänu tema fosfaat-selgroo negatiivsele laengule – kui rakendada elekrtiväli, DNA fragmentid hakkavad liikuma katoodile. Mida väiksem on DNA jupp, seda kiiremini ta liigub geelis, sellega väiksemad jupid elektoforeesi lõpus asuvad geeli põhjas (katoodi lähemale) ka suuremad geeli ülemises osas. Et umbkaudu teada oma DNA fragmenti pikkus, panime ka
denatureeru ta korduvate tsüklite vältel 94ºC juures. Igast sihtmärk- DNA-st tekib esimese tsükli järel 2 ahelat, järgmises tsüklis tekib kahest ahelast 4, kolmanda tsükli ajal neljast ahelast 8 jne. Kasv toimub geomeetrilises progressioonis. 30-40 tsükli vältel tekib 107-108 uut koopiat. PCR PRODUKTI DETEKTEERIMINE toimub geel-elektroforeesiga. Peale elektroforeesi geel värvitakse etiidiumbromiidiga, mis DNAga seostudes helendab UV kiirtes. Elektroforeesi teostamisel lisatakse geelile molekulmassi marker, mis on kommertsiaalsed DNA fragmentide segud, mille iga lõigu pikkus on teada. Võrreldes amplikoni paiknemist molekulmassi markeri bändide suhtes on võimalik ligikaudselt hinnata amplikoni suurust. Joonis 2. PCR põhimõtteline skeem. (A) Esimeses tsüklis kasutatakse uuritavas materjalis olevat 2- ahelalist DNA-d sihtmärgina
1- ahelaline geenifragment amplifitseeritakse, denatureeritakse, kantakse mittedenatureerivale polüakrüülamiidgeelile, kus ta paardub iseendaga, võttes ühe neljast võimalikust kõige vähem energiat nõudvast konformatsioonist. Erineva konformatsiooni tõttu liiguvad liiguvad jupid geelis erinevalt kõige rohkem pakitud versioon kõige kiiremini. Heterodupleks test segad kontrollDNA paljude teistega kokku, kuumutad ja paned geelile. Ahelad hübridiseeruvad, mittesobivuse korral tekib ahelasse mull (mutatsioonide korral). Mulliga liiguvad tavaliselt aeglasemalt ja on geelis ootamatute kohtade peal. RFLP ensümaatilisel restriktsioonil põhinev polümorfismide analüüs. Esinevad polümorfismid, mis tekitavad või kaotavad restriktsioonisaite. Regioon amplifitseeritakse ja pannakse restriktaas juurde. Kui restriktsioonisait on kadunud, siis tekib üks suur bänd 2 väikese asemel. Reaalselt on
Ioonvahetuskromatograafia – positiivselt laetud kerakestele seostuvad negatiivselt laetud molekulid. Positiivselt laetud molekulid ei seostu ja tulevad kolonnist läbi. Geelfiltratsioonkromatograafia – väiksed molekulid takerduvad poorsetesse kerakestesse, suured läbivad kolonni vabalt. Afiinsuskromatograafia – keraksetega kovalentselt seotud molekulidele seostuvad neile spetsiifilised molekulid. SDS-polüakrüülamiidgeel elektroforeesi tööpõhimõte. Proov geelile, valgud liiguvad + poole, saab hinnata valkude suurust Valkude ülekanne SDS-polüakrüülamiidgeelilt membraanile ning nende tuvastamine antikehade abil. Geelilt kantakse membraanile, inkubeeritakse antikehadega, loputatakse, inkubeeritakse ensüümiga, loputatakse, kromogenne dekteteerimine Kahedimensionaalse geelelektroforeesi põhimõte. Proteiini segu isoelektriline fokuseerimine, esimene geel teise peale ja SDS elektroforees Erinevad koetüübid. Naha ehitus
annaabi.ee 
