of-analysis-gel-chromatography-method-4-638.jpg?cb=1416556188] Geelkromatograafia kolonni iseloomustab täidise kogumaht Vt = Vv + Vs + Vg, kus Vv on graanutlitevahelise vedeliku maht, Vs graanulitesisese vedeliku maht ja Vg geelimaterjali ehk -maatriksi maht. Selleks, et uuritavaid aineid saaks läbi kolonni transportides üksteisest eraldada, tuleb kasutada sobivat voolutit ehk eluenti. Eluenti kogutakse aga kindla mahuga fraktsioonide kaupa (antud töös 2 ml). Elueerimismaht Vx on eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Liiga suured molekulid ei mahu graanulitesse ja väljuvad kolonnist esimesena, st nad on minimaalse elueerimismahuga ja on võrdsed graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vxmin = Vv Väiksed molekulid suudavad difundeeruda geeli pooridesse ja liiguvad kolonnis
mahtu, millega väljuvad molekulid, mis geeli pooridesse ei mahu) ja maksimaalset elueerimismahtu ( eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid mis geeli pooridesse täielikult sisenevad). Kromatogrammiks nimetatakse eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja mahu vahelist graafikut. Kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja fraktsioonikogurist. Tihti on kasutusel automaatkolonnid, mis automaatselt lisavad kolonni eluenti, antud töös on aga kasutusel klaaskolonnid, mis on eelnevalt täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex G - 75. Kolonn on kinnitatud statiivile sellisele kõrgusele, et alla mahuks katseklaas. Käsitsi tuleb lisada nii eluenti kui ka fraktsioone koguda. Ainete kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse spektrofotomeetrit. Töö käik Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine · Kolonn asetataksse statiivile vertikaalselt
o 2,4-dinitrofenüülaspartaat (0,6mg/ml) · kolonni täidise pinnal olev eluent lastakse välja · kolonni voolukiirus reguleeritakse piiridesse 0,7 1,0 ml/min · kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kolonni pipeteeritakse 0,5 ml uuritavat proovi, lastes proovil geelile mõne millimeetri kõrguselt tilkuda nii, et proov jaotuks geelis ühtlaselt · avatakse väljalaskeava ja jälgitakse, et eluenti oleks alati geeli kohal kui proov on täielikult geeli sisenenud, hakatakse juurde lisama eluenti, alguses väiksemate kogustena jälgides, et geel ei jääks kuivaks · kuni kolonni allaossa jõuab dekstraansinine, väljub kolonnist puhas vooluti, mis kogutakse ühendatud fraktsioonina kuiva 100 ml kolbi · ühendatud fraktsioon 16,75 ml · 2ml suuruseid fraktsioone kogutakse, kuni kogu uuritav aine on kolonnist väljunud ja
· kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava · kogutud lahust pole vaja säilitada Proovi sisestamine: · pipeti või süstlaga võetakse juhendaja poolt soovitud kogus uuritavat proovi ja viiakse kolonni · proov lastakse voolata geeli pinnale nii, et see võimalikult ühtlaselt jaotuks Kolonni voolutamine: · kui proov on sisestatud, avatakse väljavooluava ning lisatakse vähehaaval eluenti, kuni proov on täidisesse imbunud · pärast seda võib kolonni lisada juba suurema koguse eluenti · puhtasse kuiva kolbi hakatakse koguma ühendatud fraktsiooni · kui dekstraansinine on jõudnud kolonni alaossa, eemaldatakse kolb ja hakatakse katseklaasidesse koguma fraktsioone 2 ml kaupa · elueerimise võib lõpetada, kui eluaat on muutunud värvituks Fraktsioonide analüüsimine:
1) Dekstraansinine, 3 mg/mL 2) Müoglobiin, 6 mg/mL 3) DNP-aspartaat, 0,3 mg/mL Kolonni voolutamine Kui olin proovi viinud geeli pinnale, siis avasin väljavoolutoru ja hakkasin eluaati koguma alguses ühendatud fraktsioonina kuiva kolbi. Niipea kui proov oli täidisesse sisenenud, viisin pipeti abil geeli pinnale väikese koguse voolutuslahust ja lasin sellel täidisesse imbuda. Kordasin sama asja väikese eluendi kogusega veel teinegi kord ja siis viisin juba geeli pinnale nii palju eluenti, et moodustus u 5 cm kõrgune kiht. Kuna minul oli kolonn ühendatud eluendi pudeliga, siis rohkem enam käsitsi ma eluenti kolonni kandma ei pidanud. Kolonnis tekkis kolm värvilist riba sinine, pruun ja kollane. Kui sinine riba jõudis kolonni alla äärde, siis eemaldasin ühendatud fraktsiooni kogumise jaoks mõeldud kolvi ning edasi kogusin eluaati juba 2 mL fraktsioonidena. Lõpetasin elueerimise kui eluaat oli pärast kollase riba kogumist muutunud uuesti värvituks
-graanulitesisese vedeliku maht (Vs), -geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), -täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt). Seega: Vt=Vv+Vs+Vg Kui läbi kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele ja võimele geeli pooridesse difundeeruda. Selleks, et need erineva molekulmassiga molekulid saaksid üksteisest eralduda, elueeritakse kolonni sobiva vesilahusega ja kolonnist väljuvat lahust (eluenti) kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Fraktsioonis sisalduvate ainete konsentratsiooni kindlakstegemiseks kasutatakse mitmeid füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Iga uuritavas segus leiduvat ainet iseloomustab väljumismaht-Vx selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon , milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne. Molekulid, mis ei mahu geeli kraanulite sisse, väljuvad lahusest kõige kiiremini, neil on minimaalne elueerimistmaht
· Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. · Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine · Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. · Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. · Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklasidesse. · Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine · Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse
visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml kaupa fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib silma järgi
9. Lasime alumise kihi ehk veekihi ja 1-2 tilka orgaanilisest kihist jaotuslehtri all olevasse keeduklaasi. 10. Ülejäänud orgaanilise kihi ehk ekstrakti ehk planaarkromatograafia proovi lasime Eppendorfi tuubi. Taimelehtedes leiduvate värvainete eraldamine planaarkromatograafilisel meetodil: 1. Valmistasime elueerimisnõusse (siin keeduklaas) heksaanist ja etüülatsetaadist (suhtes 3:1 ehk ~3ml heksaani ja ~1ml etüülatsetaati) eluendi. Jälgisime, et eluenti oleks keeduklaasi põhjas kindlasti alla 1cm ( ~0,5 – 0,7 cm). 2. Sulgesime elueerimisnõu voolutusnõu kaanega, et et keeduklaas saaks eluendi aurudega küllastuda (protsessi kiirendamiseks võis ka elueerimisnõud kaanega vaikselt loksutada). 3. Valmistasime ette planaarkromatograafiaplaadi. Tõmmates hariliku pliiatsiga plaadile ~1 cm kaugusele alumisest servast stardijoone ja märkides sellele väikese ristikesega
1. Avatakse kolonni väljavooluava ja kogutakse voolutuslahust kuni see jõuab täidise pinnani. Samal ajal reguleeritakse vooluiirus. 2. Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis proovi sisetamiseks. Proovi sisestamine 1. Uuritav segu viiakse ettevaatlikult kolonni lastes sel tasapisi täidisele tilkuda. 2. Kui proov on sisestatud, avatakse väljavool ja lisatakse kiiresti pipeti abil väike kogus eluenti. Seda tegevust korratakse kuni proov on täidisesse imbunud. Seejärel võib lisada suurema koguse voolutuslahust. 3. Kui esimene värviline riba hakkab lähenema kolonni alumisele osale hakatakse eluaati koguma valmispandud katseklaasidesse. 4. Elueerimise võib lõpetada, kui väljuv eluaat on värvitu. Fraktsioonide analüüsimine 1. Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse
Uuritavas segus olid kõik komponendid värvilised, seega oli komponentide lahutamine visuaalselt jälgitav. Senikaua, kuni kolonni alaossa pole veel jõudnud kõige kiiremini liikuv komponent, väljub kolonnist puhas vooluti, seda ei pea 2 ml fraktsioonidena koguma, kuna see poleks otstarbekas. Kui esimene värviline riba (sinine) jõuab kolonni põhja lähedale, jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena. Oluline on, et kogu katse vältel oleks kolonni täidise kohal piisavalt eluenti ning et eluaati kogutaks täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise võib lõpetada, kui kõik värviribad on väljunud ja eluaat on värvitu. Aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis väljendatakse lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorbtsiooni, milles võib
Reguleerin kolonni voolukiirus piiridesse 0,7-1,0 ml/min. Kui vedeliku tase langeb täidise pinnani, suletan kolonni väljavooluava . Uuritav segu: 1.segu: Dekstraansinine (sinine), müüoglobiin (punane), DNP-aspartaat (kollane). Proovi sisestamine: Doseerimiseks kasutan automaatpipetti mahuga 0,5 ml. Viin 0,5 ml uuritavad segu kolonni vastu seina. Proov voolab geeli pinnale ühtlaselt. Avan kolonni väljavooluava ja kui uuritav segu on geeli sees lisan 2 ml eluenti.Kui kogu eluent on geeli sees ,lisan veel eluendi. Geelis olev proov moodustab sinist ja kollast kihti(punane oli nähtav ainult siis,kui kogusin katseklaasi. Kolonni voolutamine: Kolonnist tuleb puhas vooluti, mida kogun mõõtsilidrisse. Kokku tuli 20 ml ühendatud fraktsiooni. Kui tuli sinine riba asendasin mõõtsilinder katseklaasiga ja hakkasin koguma fraktsioonid. Kokku tuli 42 fraktsiooni. Fraktsioonide analüüsimine:
ja lastakse sellel sisse imbuda. Seda korratakse seni, kuni ollakse veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud. Siis kantakse geeli pinnale suurem kogus voolutuslahust. Kui esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolvi põhjale, siis eemaldatakse kolb ja alustatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena. Kogu voolutuse käigus tuleb jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele lisada ning vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimine lõpetatakse kui väljub viimane värviline komponent ja eluaat muutus värvituks. Fraktsioone analüüsiti spektrofotomeetritel neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel, milles järeldub lahuse optiline tihedus. Tulemuste põhjal koostati kromatogramm. Tulemused ja nende analüüs Täidise mark: SEPHADEX G-75 Pundumistegur k = 0,1
kogusin eeljooksuna keeduklaasi, et seda hiljem arvestada eluaadi kogumahu arvutamisel. Pärast mõõtmist ühendatud fraktsiooni maht 33 ml. 7. Proovis sisalduvad ained andsid kolonnis erineva värvuse- sinine, pruun ja kollane, mida kogusin 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse. Katseklaase sain kokku 38. 8. Kui uuritavad ained mööda kolonni allapoole liikusid, lisasin ülevalt pidevalt eluenti, et eluendi nivoo oleks kolonni peas koguaeg sama, sest see tagab uuritav lahuse ühtlasema kiirusega läbivuse kolonnist. 9. Lõpetasin elueerimise, kui eluaadi summaarne maht oli sama, mis arvutuslik kogumaht. Proovide analüüsimine Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni mõõtu, mõõtsin kõikide proovide (va täiesti värvusetute) optilise tiheduse ehk absorbtsiooni. Optilist tihedust määratakse aine neeldumis-
Kolonni voolutamine Võtsin uuritavat proovi 0,5 ml ning lasin sel voolata geeli pinnale võimalikult ühtlaselt. Seejärel avasin voolutusava ning kuni alaossa jõudis kõige kiiremini liikuv osa, milleks on dekstraansinine, väljus kolonnist puhas vooluti, mille kogusin ühendatud fraktsioonina (16,75 ml). Seda kogusin sinnamaani, kuni nägin kolonnis, et dekstraansinine hakkas jõudma üpris kolonni alaossa. Seejärel hakkasin koguma fraktsioone 2 ml kaupa. Lisasin pidevalt juurde eluenti, milleks oli 0,15 M NaCl. Eluaadi kogumise lõpetasin, kui see oli muutunud värvusetuks. Fraktsioonide analüüsimine Ainete kontsentratsiooni antud töös väljendatakse igas fraktsioonis lahuse optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused sõltuvad uuritava ainesegu koostisest: dekstraansinine- 670 nm, aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped (türosiin Tyr, fenüülalaniin Phe, trüptofaan
proov oli kolonni sisenenud, kandsin geeli pinnale suurema hulga voolutit, nii et moodustus 4- 5 cm kõrgune vedelikukiht. Samas jägisin, kuidas liikus kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). Kui see lähenes kolonni põhjale, siis eemladasin kolonni alt kolvi ühendatud fraktsiooniga ja jätkasin eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel jälgisin, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja lisasin seda vastavalt vajadusele juurde. Samuti vahetasin õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Fraktsioonide analüüsimine Et väljendada aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõtsin aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel.
müoglobiin ja üleval on kollase värvusega DNP-aspartaam. See on sellepärast, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel st. 2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja DNP- aspartaadi mass on kõige väiksem. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti osa (nn ühendatud fraktsiooni) maht 23 cm3 Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka
Praktikumis uuritavas ainete segus on kõik ained värvilised ja segu komponentide lahutamine on visuaalselt jälgitav. Uuritava segu sisaldus: dekstraansinine + müoglobiin + DNP-aspartaat KOLONNI VOOLUTAMINE: 1. Avan väljavoolu kolonnist 2. Hakkan koguma eeljooksu (puhas vooluti), enne kui kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine). 3. Kui proov on täidisesse sisenenud, viin kiiresti pipeti abil geeli pinnale väikese koguse (0,5-1 ml) eluenti 4. Lasen eluendil täidisesse imbuda. 5. Kordan seda protsessi väikeste kogustega seni, kuni kogu uuritav proov on kolonni sisenenud 6. Kannan geeli pinnale suurema hulga voolutit; moodustub 4-5 cm kõrgune vedeliku kiht. 7. Kui kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine) läheneb kolonni põhjale, siis jätkan eluaadi kogumist 2 ml fraktsioonidena kaliibritud katseklaasidesse, kuni eluaat muutub värvituks ning kogu uuritav proov on läbinud kolonni
müoglobiin ja üleval on kollase värvusega DNP-aspartaam. See on sellepärast, et kõige suurem molekulmass on dekstraansinisel st. 2·106, ning müoglobiini molekulmass on 16800 ja aspartaami mass on kõige väiksem st 294,301. Kui dekstraansinine jõuab kolonni põhjale siis hakatakse eluaadi kogumist 2ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb · jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, · vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle otsustasin eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral). Sain koguda 26 katseklaasi 2ml-ga eluendiga. Ka mõtsin vooluti maht st Vv = 23 cm3. NB! See ei ole kolonni vaba maht, vaid nn ühendatud fraktsioon, mis moodustab vaid osa Vv- st!
kohtade tähistamiseks. Täppide ja plaadi servade vahe peab olema vähemalt 5 mm. Töös kasutatavad 1%-lised aniliini ja nitrobenseeni lahused kloroformis on juba eelnevalt valmis. Mõlemast lahusest ja reaktsioonisegust (eelnevalt pipeteeritud väike kogus klaasplaadile) võetakse klaaskapillaariga väike kogus ainet plaadile. Proovid kantakse varem märgistatud täppidele. Lahustil lastakse plaadilt aurustuda. Järgmiseks asetatakse plaat eluenti (voolutisse). Eluendina on kasutusel tolueeni ja etüületanaadi lahus (95:5), mis on samuti eelnevalt valmis tehtud. Plaat asetatakse mõne millimeetri kõrgusesse eluendi kihti, klaaspurk suletakse kaanega, et kogu plaat oleks eluendi aurudes. Elueeritakse seni, kuni solvendi nivoo jõuab umbes 5 mm kaugusele plaadi ülemisest servast. Plaat võetakse eluendi purgist välja ja fikseeritakse hariliku pliiatsiga frondi piir. Plaat kuivatatakse kuuma elektripliidi kohal.
gaasikromatograafias kasutatakse. Vedelikukromatograafias aga puuduvad piirangud aine molekulmassile ja on võimalik lahutada ka kõrgmolekulaarsete ainete segusid. Vedelikukromatograafide abil lahendatakse nüüdisajal umbes 20% kõikidest analüütilistest ülesannetest (umbes 60% kromatograafilistes analüüsidest). Seega on vedelikukromatograaf tähtis analüütiline seade, ilma milleta pole mõeldav keskkonnaanalüütika. Tänapäevases vedelikukromatograafias pumbatakse eluenti 20 300 atm rõhu all läbi peeneteralise täidisega (läbimõõt 10 40 m) kolonni, mille lõpus asub detektor (tavaliselt spektrofotomeeter või fluoromeeter). Proovi sisestamiseks kasutatakse dosaatorit. Vedelikukromatograafias on eluendiks tavaliselt orgaaniliste lahustite segu või soolade vesilahus, mida hoitakse klaaskolvis või polüetüleenpudelis. Nüüdisajal on levinud pumbatüübiks edasi-tagasi liikuva kolviga (ingl reciprocating) pumbad, mis varustavad kolonni eluendiga
esmalt, samal ajal interakteeruvad polaarsed molekulid silikageeli hüdroksüülrühmadega; eluendina kasutatakse apolaarseid solvente (heksaan, petrooleeter), suurendades polaarsust (lisades polaarset solventi või suurendades selle osakaalu) elueeruvad ka polaarsed molekulid. Pööratud faasi puhul on silikageelile kovalentselt seotud C8 või C18 rühmad, mistüttu interakteeruvad nende apolaarsed molekulid ning polaarsed elueeruvad esimesena, kasutades polaarset eluenti (vesi, metanool). Lisades või suurendades apolaarse solvendi osakaalu (heksaan, atseetonitriil) elueeruvad ka apolaarsed molekulid. Valkude kromatograafia pööratud faasi kolonnis Üle 5A pikkused valgud ja peptiidid on liiga suured, et neid statsionaarsel faasil lahutada. Suurendades orgaanilise solvendi osakaalu gradiendiga; teatud orgaanika kontsentratsiooni puhul valg desorbeerub stats.faasilt ning liigub ilma edasise interakteerumiseta kolonnist välja
sisenenud, võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit, nii et moodustuks 45 cm kõrgune vedeliku kiht. Samas jälgitakse, kuidas liigub kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). Kui see läheneb kolonni phjale, siis eemaldatakse kolonni alt kolb ühendatud fraktsiooniga ja jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse. Kogu voolutamise vältel tuleb ¾ jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada, ¾ vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa. Elueerimise lõpetamise üle võib otsustada kas eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral) või eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu
annaabi.ee 
