Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine (0)

TTÜ Materjaliteaduse Instituut
Füüsikalise keemia õppetool
Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a
Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine
Tallinn 2013
Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel).
Töö ettevalmistamine:
Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH ≈4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH ≈4,8. Sellest valmistatakse lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või 0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni (näiteks 0.00625M) saamiseks.
Töö teostamine :
Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk (alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0.1M kuni 0,00625M)) suhkru lahusele 1 ml ensüümi ( invertaas ), ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, käivitades stopperi. Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka, seades analüsaatori poolvarjuasendisse (või automaatselt polarimeetriga POLAMAT). Esimese mõõdetud nurga võetakse polarisatsioonitasandi pöördenurgaks lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmiseid kindla ajavahemiku tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). Viimase lugemi võtmisel eeldatakse, et reaktsioon on toimunud.
Katse andmed:
Tabel 1. Sahharoosilahus 1,2%
Jrk nr.
Proovi võtmise aeg
Aeg katse algusest, min
Polamat näit α
1
2:58 PM
0.00
4.3
2
2:59 PM
1
4.2
3
3:00 PM
2
4.1
4
3:01 PM
3
3.8
5
3:02 PM
4
3.7
6
3:03 PM
5
3.2
7
3:04 PM
6
3.05
8
3:05 PM
7
2.9
9
3:06 PM
8
2.69
10
3:07 PM
9
2.51
11
3:08 PM
10
2.4
12
3:09 PM
11
2.23
13
3:10 PM
12
2.12
14
3:11 PM
13
1.9
15
3:12 PM
14
1.75
16
3:13 PM
15
1.62
17
3:14 PM
16
1.5
18
3:15 PM
17
1.32
19
3:16 PM
18
1.2
20
3:17 PM
19
1.1
21
3:18 PM
20
0.98
22
3:20 PM
22
0.85
23
3:22 PM
24
0.7
24
3:24 PM
26
0.6
25
3:26 PM
28
0.32
26
3:28 PM
30
0.2
27
3:30 PM
32
0.05
28
3:35 PM
35
-0.1
29
3:40 PM
40
-0.3
30
3:45 PM
45
-0.33
31
3:50 PM
50
-0.46
32
3:55 PM
60
-0.55
33
4:00 PM
65
-0.81
34
4:05 PM
70
-0.9
35
4:10 PM
75
-0.96
36
4:20 PM
85
-1
Pöördenurga sõltuvus ajast. Kontsentratsioonil 1,2%
Kalibreerimine : Algne sahharoosilahus oli 1,2%. Kuna M(C12H22O11) = 342 ja
katsetulemuste tabelist leiame, et 12 minuti pärast näitab Polamat α = 2,1, siis on vaja
teada sellele pöördenurgale vastavat substraadi kontsentratsiooni. Selle määramiseks konstrueerime kalibreerimissirge.
S0=1,2*1000/(342*100)=0,035 mol/l
α0 =4,3
S0 = 0,035
α∞ =-1,0
S∞ = 0
Pöördenurga sõltuvus kontsentratsioonist. Kontsentratsioonil 1,2%
12 minuti pärast oli pöördenurk α =2,1 ja sellele vastav S = 0,021 mol/l.
Algkiirus v0 = (0,035 - 0,021)/(12*60) = 1,94*10^-5 mol/ls
Kui S0 =0,035 mol/l, siis v0 = 1,94*10^-5 mol/ls
Järgmine punkt
22 minuti pärast oli pöördenurk α =0,85 ja sellele vastav S = 0,01221mol/l.
Algkiirus v0 = (0,035-0,01221)/(22*60) = 1,73*10^-5 mol/ls
Kui S0 =0,035 mol/l, siis v0 = 1,73*10^-5 mol/ls
Sahharoosilahus 0,6%
Jrk nr.
Proovi võtmise aeg
Aeg katse algusest, min
Polamat näit α
1
2:39 PM
0
2.4
2
2:42 PM
3
2.2
3
2:44 PM
5
1.9
4
2:45 PM
6
1.85
5
2:46 PM
7
1.75
6
2:47 PM
8
1.5
7
2:48 PM
9
1.35
8
2:49 PM
10
1.3
9
2:50 PM
11
1.2
10
2:52 PM
12
1.1
11
2:54 PM
14
1
12
2:56 PM
16
0.85
13
2:58 PM
18
0.6
14
3:00 PM
20
0.45
15
3:02 PM
22
0.3
16
3:04 PM
24
0.2
17
3:06 PM
26
0.15
18
3:08 PM
28
0.13
19
3:10 PM
30
0.05
20
3:15 PM
35
0.03
21
3:20 PM
40
-0.05
22
3:25 PM
45
-0.1
23
3:30 PM
50
-0.2
24
3:35 PM
55
-0.2
25
3:40 PM
60
-0.31
26
3:45 PM
65
-0.31
27
3:50 PM
70
-0.4
28
3:55 PM
75
-0.4
29
4:00 PM
80
-0.4
30
4:05 PM
85
-0.4
Pöördenurga sõltuvus ajast. Kontsentratsioonil 0.6%
Kalibreerimine: Algne sahharoosilahus oli 0,6%. Kuna M(C12H22O11) = 342 Konstrueerime kalibreerimissirge.
S0=0,6*1000/(342*100)=0. 0175 mol/l
S0
2.4
0.0175
-0.4
0
Pöördenurga sõltuvus kontsentratsioonist. Kontsentratsioonil 0,6%
Esimene punkt
10 minuti pärast oli pöördenurk α =1,3 ja sellele vastav S = 0.011 mol/l.
Algkiirus v0 = (0,0175-0,0144)/(10*60) = 9.028*10^-6 mol/ls
Kui S0 =0,0175 mol/l, siis v0 = 9.028*10^-6 mol/ls
Järgmine punkt
24 minuti pärast oli pöördenurk α =0,2 ja sellele vastav S = 0.0038mol/l.
Algkiirus v0 = (0,0175-0,0114)/(24*60) = 1.903*10^-5 mol/ls
Kui S0 =0,0175 mol/l, siis v0 = 1.903*10^-5mol/ls
Km ja vmax leidmine:
S0
1/S0
V0
1/V0
0.035
28.57143
1.94E-05
51546.39175
0.035
28.57143
1.73E-05
57803.46821
0.0175
57.14286
9.03E-06
110769.2035
0.0175
57.14286
1.90E-05
52554.68315
Kiiruse pöördväärtuse sõltuvus kontsentratsiooni pöördväärtusest
Sirge algordinaat, ehk 1/vmax=27688, seega vmax= 3,61*10^-5mol/ls
Michaelise konstandi leidmine:
Sirge tõus, ehk Km/vmax= 944.55, seega Km=0,034 mol/l
Kiiruskonstandi leidmine:
vmax k3[E0], kus [E0] on ensüümi algkontsentratsioon ühikutes M ja k3 on produkti tekke kiiruskonstant .
[E0]=0.6% => [E0]=(0.6*1000)/(342*100)=0,018 mol/l
k3=(3,61*10^-5)/0,018=2,01*10^-3 s-1
Michaelis-Menteni graafik
Km=0.034
V0=Vmax*S0/(Km+S0)
v0
1.82898E-05
1.82898E-05
1.22456E-05
1.22456E-05
Järeldus:
Tulemustest saan järeldada, et mida suurem on algkontsentratsioon, seda suurem on ka algkiirus. vmax tuli arvutades 3,61*10-5mol/ls ja Km=0,034 mol/l. Produkti tekke kiiruskonstandiks sain 2,01*10^-3 s-1.