Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a (1)

TTÜ Materjaliteaduse Instituut
Füüsikalise keemia õppetool
Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a
Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine
Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja vmax määramine Lineweaver-Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata ensüümi aktiivsust (1 sekundi jooksul ärareageerivate substraadi moolide arv 1 grammi ensüümi toimel 1 sekundi jooksul ehk teiste sõnadega reaktsiooni kiirus ühikulise hulga ensüümi toimel).
Töö ettevalmistamine:
Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus
valmistatakse 0,1-0,5% (või kuni 2%) invertaasi lahusena atsetaatpuhvris (0,1M), mille pH ≈4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH ≈4,8. Sellest valmistatakse lahjendusega omakorda madalama kontsentratsiooniga lahus (näiteks 0.05M, 0.025M või 0.0125M sahharoosi lahus). Lahjendamine toimub samuti puhvriga. Vajadusel tehakse viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni (näiteks 0.00625M) saamiseks.
Töö teostamine :
Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk
(alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse see. Reaktsioonisegu valmistamiseks lisatakse eraldi katseklaasis 25 ml-le määratletud kontsentratsiooniga (näiteks 0.1M kuni 0,00625M)) suhkru lahusele 1 ml ensüümi ( invertaas ), ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, käivitades stopperi. Loputatakse polarimeetri toru ja täidetakse (mullideta) reaktsioonisegust võetud prooviga. Toru asetatakse polarimeetrisse ning mõõdetakse polarisatsioonitasandi pöördenurka, seades analüsaatori poolvarjuasendisse (või automaatselt polarimeetriga POLAMAT). Esimese mõõdetud nurga võetakse polarisatsioonitasandi pöördenurgaks lühimal ajahetkel, mis võimalik. Edasi teostatakse mõõtmiseid kindla ajavahemiku tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). Viimase lugemi võtmisel eeldatakse, et reaktsioon on toimunud.
Katseandmed :
Tabel 1. Sahharoosilahus 9,6%
Jrk nr
Kellaaeg
Aeg reaktsiooni algusest min
Polamat näit α
1
13.24
0
15,26
2
13.25
0,75
14,5
3
13.26
1,75
14,45
4
13.27
2,25
14,42
5
13.27
2,75
14,36
6
13.28
3,15
14,32
7
13.28
4
14,28
8
13.30
6
14,12
9
13.32
8
13,74
10
13.34
10
13,43
11
13.36
12
13,1
12
13.38
14
12,82
13
13.40
16
12,45
14
13.42
18
12,16
15
13.44
20
11,88
16
13.46
22
11,46
17
13.48
24
11,13
18
13.50
26
10,7
19
13.55
31
9,77
20
14.00
36
8,8
21
14.05
41
7,98
22
14.10
46
7,16
23
14.15
51
6,19
24
14.20
56
5,34
25
14.25
61
4,51
26
14.30
66
3,85
27
14.40
76
2,34
28
14.50
86
1,11
29
15.00
96
0,04
29
20.40
436
-3,84
29
18.15
1721
-4,52
Graafik 1. Pöördenurga sõltuvus ajast. Kontsentratsioonil 9,6%
Kalibreerimine : Algne sahharoosilahus oli 9,6%. Kuna M(C12H22O11) = 342 ja
katsetulemuste tabelist leiame, et 61 minuti pärast näitab Polamat α = 4,51, siis on vaja
teada sellele pöördenurgale vastavat substraadi kontsentratsiooni. Selle määramiseks konstrueerime kalibreerimissirge.
S0=9,6*1000/(342*100)=0,281 mol/l
α0 =15,26
S0 = 0,281
α∞ =-4,52
S∞ = 0
Graafik 2. Pöördenurga sõltuvus kontsentratsioonist. Kontsentratsioonil 9,6%
61 minuti pärast oli pöördenurk α =4,51 ja sellele vastav S = 0,130mol/l.
Algkiirus v0 = (0,281-0,13)/(61*60) = 4,13*10-5 mol/ls
Kui S0 =0,281 mol/l, siis v0 = 4,13*10-5 mol/ls
Järgmine punkt
26 minuti pärast oli pöördenurk α =10,7 ja sellele vastav S = 0,21mol/l.
Algkiirus v0 = (0,281-0,21)/(26*60) = 4,55*10-5 mol/ls
Kui S0 =0,281 mol/l, siis v0 = 4,55*10-5 mol/ls
α0 =15,26
S0 = 0,281
α∞ =-4,52
S∞ = 0
Tabel 1. Sahharoosilahus 1,2%
Jrk. Nr
Kellaaeg
Aeg reaktsiooni algusest (min)
Polamat näit α
1
13,5
0
1,75
2
 13.53
2,5
1,7
3
 13.54
4
1,6
4
 13.59
9
1,18
5
 14.04
14
0,8
6
 14.09
19
0,48
7
 14.14
24
0,28
8
 14.19
29
0,08
9
 14.24
34
-0,06
10
 14.29
39
-0,1
11
 14.34
44
-0,15
12
 14.39
49
-0,2
13
 14.44
54
-0,25
14
 14.49
59
-0,29
15
 14.54
64
-0,34
16
 14.59
69
-0,37
17
 20.00
350
-0,52
Graafik 3. Pöördenurga sõltuvus ajast. Kontsentratsioonil 1,2 %
Kalibreerimine: Algne sahharoosilahus oli 1,2%. Kuna M(C12H22O11) = 342 ja
katsetulemuste tabelist leiame, et 14 minuti pärast näitab Polamat α = 0,8, siis on vaja
teada sellele pöördenurgale vastavat substraadi kontsentratsiooni. Selle määramiseks konstrueerime kalibreerimissirge.
S0=1,2*1000/(342*100)=0,035 mol/l
α0 =1,75
S0 = 0,035
α∞ =-0,52
S∞ = 0
Graafik 4. Pöördenurga sõltuvus kontsentratsioonist. Kontsentratsioonil 1,2%
14 minuti pärast oli pöördenurk α =0,8 ja sellele vastav S = 0,020 mol/l
Algkiirus v0 = (0035-0,02)/(14*60) = 1,79*10-5 mol/ls
Kui S0 =0,035 mol/l, siis v0 = 1,79*10-5 mol/ls
Järgmine punkt.
39 minuti pärast oli pöördenurk α =-0,1 ja sellele vastav S = 0,007 mol/l
Algkiirus v0 = (0035-0,007)/(39*60) = 1,20*10-5 mol/ls
Kui S0 =0,035mol/l, siis v0 = 1,20*10-5 mol/ls
Km ja vmax leidmine:
Tabel 3.
S0
1/S0
v0
1/v0
0,035
28,5714
1,2E-05
83333,3
0,035
28,5714
1,8E-05
55865,9
0,281
3,55872
4,1E-05
24213,1
0,281
3,55872
4,6E-05
21978
Graafik 5. Kiiruse pöördväärtuse sõltuvus kontsentratsiooni pöördväärtusest.
Sirge algordinaat, ehk 1/vmax=16476, seega vmax=6,07*10-5mol/ls
Michaelise konstandi leidmine:
Sirge tõus, ehk Km/vmax= 1859 ,2, seega Km=0,11 mol/l
Kiiruskonstandi leidmine:
vmax k3[E0], kus [E0] on ensüümi algkontsentratsioon ühikutes M ja k3 on produkti tekke kiiruskonstant .
[E0]=(1/25)*100%=4% => [E0]=(4*1000)/(342*100)=0,117 mol/l
k3=(6,07*10-5)/0,117=5,19*10-4 s-1
Graafik 6. Michaelis- Menteni graafik
Järeldus:
Tulemustest saan järeldada, et mida suurem on algkontsentratsioon, seda suurem on ka algkiirus. vmax tuli arvutades 6,07*10-5mol/ls ja Km=0,11 mol/l. Produkti tekke kiiruskonstandiks sain 5,19*10-4 s-1.