Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite määramine (0)

TTÜ Materjaliteaduse  Instituut 
Füüsikalise keemia  õppetool  
 
 
 
 
 
 
Kolloidkeemia laboratoorne töö 23a 
Sahharoosi ensüümreaktsiooni kineetiliste parameetrite 
määramine 
 
 
 
 
Eesmärgiks on ensüümreaktsiooni kineetiliste konstantide Km ja  vmax  määramine Lineweaver-
Burki koordinaatides ehitatud graafiku abil (1/v sõltuvana 1/S). Samuti on võimalik määrata 
ensüümi  aktiivsust  (1  sekundi  jooksul  ärareageerivate  substraadi  moolide  arv  1  grammi 
ensüümi  toimel  1  sekundi  jooksul  ehk  teiste  sõnadega  reaktsiooni  kiirus  ühikulise  hulga 
ensüümi toimel). 
Töö ettevalmistamine: 
Reagentideks on: substraadiks suhkrulahus ja ensüümiks invertaasi lahus. Ensüümi lahus 
valmistatakse  0,1-0,5%  (või  kuni  2%)  invertaasi   lahusena   atsetaatpuhvris  (0,1M),  mille  pH 
≈4,8. Sahharoosi algne 0,1M lahus valmistatakse puhvris, mille pH ≈4,8. Sellest valmistatakse 
lahjendusega  omakorda  madalama   kontsentratsiooniga   lahus  (näiteks  0.05M,  0.025M  või 
0.0125M  sahharoosi  lahus).  Lahjendamine  toimub  samuti  puhvriga.  Vajadusel  tehakse 
viimasest lahjendusest veel kord üks lahjendus veelgi väikesema substraadi kontsentratsiooni 
(näiteks 0.00625M) saamiseks. 
Töö teostamine : 
Esmalt täidetakse polameetri toru lähtesuhkrulahusega selleks et määrata lähtepöördenurk 
(alghetke t = 0 väärtus) . Seejärel valatakse lähtelahus polameetri torust välja ja puhastatakse 
see.  Reaktsioonisegu  valmistamiseks  lisatakse  eraldi  katseklaasis  25  ml-le  määratletud 
kontsentratsiooniga (näiteks 0.1M kuni 0,00625M)) suhkru lahusele 1 ml ensüümi ( invertaas ), 
ning koheselt fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg, käivitades stopperi. Loputatakse polarimeetri 
toru  ja  täidetakse  (mullideta)  reaktsioonisegust  võetud  prooviga.  Toru  asetatakse 
polarimeetrisse  ning  mõõdetakse  polarisatsioonitasandi  pöördenurka,  seades  analüsaatori 
poolvarjuasendisse  (või  automaatselt  polarimeetriga  POLAMAT).  Esimese  mõõdetud  nurga 
võetakse  polarisatsioonitasandi  pöördenurgaks  lühimal  ajahetkel,  mis  võimalik.  Edasi 
teostatakse mõõtmiseid kindla ajavahemiku tagant (alguses tihemini ~2 min. või 5 min, järel, 
siis 10 min järel, ning mida aeg edasi, seda harvemini). Viimase lugemi võtmisel eeldatakse, et 
reaktsioon on toimunud. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Katseandmed : 
Tabel 1. Sahharoosilahus 2,4% 
Aeg reaktsiooni 
Jrk nr 
Kellaaeg  
algusest min