konjugeeritud kaksiksidemeid, siis neelab ta intensiivselt valgust spektri nähtavas osas. Seetõttu saab karoteeni sisaldust uuritavas materjalis objektiivselt iseloomustada neeldmisspektri järgi. Puhtal karoteenil on apolaarsetes lahustites iseloomulikud neeldumismaksimumid spektri sinises piirkonnas 450 ja 480 nm juures. Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib neeldumisspekter oluliselt muutuda ja sisaldada nimetatuist erinevaid neeldumismaksimume. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, siis on täheldatavad neeldumismaksimumid lainepikkustel 425 ja 650 nm. Antud töö eesmärgiks on apelsini koorest eraldatud karotenoidide segu neeldumisspektri määramine spektofotomeetril ja selle alusel uurivata materjali karotenoidse koostise iseloomustamine ja -karoteeni sisalduse määramine uuritavas proovis. Töö käik: Karotenoide isoleermine taimsest materjalist
kõrgmolekulaarsed peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270- 280nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine · Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi (leelisproteaas, pH 8,4)
peptiidid (M > 10000) ning mittesadenevate produktide sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka ensüümireaktsiooni kulgemise. Lahusesse jäävad vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm, kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine • Uuritava proteaasi lahusena kasutatakse alkalaasi.
spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja tänu sellele on spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (A v D) uuritavas lahuses. Katse käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Valmistasin uuritavast proteaasi preparaadist, milleks oli savinaas, ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahuse, milles ensüümi kontsentratsioon oleks vahemikus 1-5 mg/mL.
hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadenevad TKÄ toimel ning ensüüm inaktiveerub ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja peptiidid. Nende kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel: fenüülalaniin (Phe), türosiin (Tyr) ja trüptofaan (Trp). Nad omavad neeldumismaksimume lainepikkustel 270-280 nm ja on tänu sellele spektrofotomeetriliselt kenasti dekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse aga siiski vaid türosiini kontsentratsioonina mg/mL olemasoleva kaliibrimissirge alusel. Töö käik Valmistan juhendaja näpunäidete järgi sobiva pH-ga esperaasi lahuse, kasutades lahustiks atsetaatpuhvrit. Optimaalne kontsentratsioon esperaasi jaok on 4 mg 1 ml puhvri kohta, seega pean 5 ml lahuse jaoks kaaluma 20 mg ehk
milleks kasutatakse spektrofotomeetrilist meetodit. TKÄ toimel sadestuvad lahusest tervikvalgud ning kõrgmolekulaarsed peptiidid, sademe eraldamisel jäävad lahusesse alles aga vabad aminohapped ning madalmolekulaarsed peptiidid nende kontsentratsioon määratakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse algusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped nagu Tyr, Trp ja Phe omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm ning selle tõttu on nad kergesti tuvastatavad spektrofotomeetriliselt. Antud katses väljendatakse kaseiini hüdrolüüsiproduktide sisaldus türosiini kontsentratsiooniga. Kasutades kaliibrimissirget, leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon. Töö käik Ensüümpreparaadist töölahuse valmistamine Valmistada proteaasi preparaadist sobiva pH väärtusega puhvris lahus, ensüümi (antud juhul
Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseinni hüdrolüüsi algstaadiumit, kui polüpeptiidahelas on katkenud ainult üksikud peptiidsidemed. · Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhin kaseiini hüdrolüüsil proteaasi toimel ja järgneval trikloorädikhappega mittesadeneva hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilise meetodi kasutades. · Aromaattuuma omavad aminohapped ( Tyr, Phe, Trp) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkusel 270-280 nm, siis väljendatakse kasieiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentatsioonina mg/ml ja kasutades kaliibrimisgraafikut leitakse absorbtsiooni väärtuse järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides. Töö käik. · Valmistame proteaasi preparaadist lahuse valmistamine.(Alkalaas) Peab olema sobiv pH (meie juhul aluliseline). Lahuse ensüümi kontsentratsioon on 1,6
määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud sadestuvad lahusest TKÄ toimel välja, samas ensüüm inaktiveerub. Sademe eemaldamisel jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse kaudu. Aromaatse tuumaga aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja seetõttu saab neid hästi detekteerida spektrofotomeetriliselt. Proovides mõõdetakse kindlal lainepikkusega valguskiirguse neelduvust. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml. Kasutades kaliibrimissirget saadakse optiliste tiheduste kaudu türosiini kontsentratsioon kindlatel ajahetkedel reaktsioonisegust võetud proovidel. 2. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine
sisaldus lahuses määratakse spektrofotomeetrilisel meetodil. Lisaks kõrgmolekulaarsete peptiidide sadestamisele lõpetab TKÄ ka edasise hüdrolüüsi. Pärast sademe eraldamist jäävad lahusesse vaid vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete (türosiin, trüptofaan, fenüülalaniin) sisalduse alusel. Need aminohapped omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270–280 nm, tänu millele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsalt detekteeritavad. Kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldust väljendatakse türosiini kontsentratsioonina mg/ml või µmol/ml, kusjuures 1 µmol = 181µg = 0,181 mg. Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides Töö käik
toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil. Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sadestuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja fenüülalaniin (Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast ensüümipreparaadist (Alcalase) valmistan 8,2 pH väärtusega puhverlahus,milles ensüümi kontsentratsioon on 1 mg/ml ja kogu lahuse maht on 5 ml. Ensüümi kontsentatsioon on 1 mg/ml ,lahuse maht on 5 ml tuleb kaaluda analüütilisel
Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid sadestuvad lahuses TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV-piirkonnas lainepikkustel 270-280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõtsin kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust ( = absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon on tingitus kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest
madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin, trüptofaan ja fenüülalaniin omavad neeldumismaksimume UV piirkonnas lainepikkustel ja tänu sellele on nad spektofotomeetriliselt hästi detekteeritavad. Joonis . Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete neeldumisspektrid. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetakse kindla lainepikkusega
madalmolekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja fenüülalaniin (Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad. Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorbtsioon ( opiline tihedus, A) on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või mol /ml (1
· Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse vahemikus 350 650 600nm · Võrdluslahusena kasutatakse puhast petrooleetrit · Spektrofotomeetri ekraanile joonistub neeldumisspekter, millel märgitakse ära iseloomulikud neeldumismaksimumid ja nendele vastavad optilise tiheduse väärtused · Neeldumismaksimumid: o 445,5 nm, 0,2659 A o 470,0 nm, 0,3481 A o 500,5 nm, 0,2671 A · Neeldumisspekter trükitakse välja · Iseloomulikke neeldumismaksimume võrreldakse teatmeteostes leiduvate andmetega · Kirjanduse põhjal on tegemist lükopeeniga (tegelikud neeldumismaksimumid petrooleetris 505; 472; 446 nm. Vastavad E1cm1% väärtused: 3150; 3450; 2250) Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) Sisalduse määramiseks uuritavas proovis kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid neeldumismaksimumine vastavaid absorptsiooni väärtusi. Reeglina võetakse
Struktuurilt on karotenoidid polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoontsüklid. Jaotatakse kahte põhigruppi karoteenid, kui hapnikku mittesisaldavad molekulid, mis koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust ja ksantofüllid, kui hapnikku sisaldavad molekulid. Taimedes täidavad karotenoidid ka ka kaitsvat rolli neelates liigset valgusenergiat ning kaitstest rakke fotokahjustuse eest. Karotenoidid omavad iseloomulikke neeldumismaksimume apolaarsetes lahustites, mistõttu on võimalik optilise tiheduse järgi määrata karotenoidi tüüpi. Töö käik · Õppejõult saadi prooviks tükike peterselli · Petersellist kaaluti 0,5g kaalutis ning viidi see kadudeta uhmrisse · Lisati pestud liiva ning peenestati proov · Lisati väikeste koguste kaupa veevaba Na2SO4, kuni proov oli täiesti kuiv · Proov ekstraeeriti heptaaniga ning filtriti kuiva 50ml mõõtesilindrisse, ekstraenti koguti 26ml
Tabel 2. Ligilähedased abipigmendid uuritavas lahuses Luteiin -karoteen Krüptoksantiin Zeaksantiin -karoteen Neeldumismaksimumid 42 44 47 42 45 48 42 45 48 42 45 48 42 44 475 (nm) 0 7 7 5 1 2 5 1 3 3 1 3 0 5 Kuna porgandis ei ole ainult üks abipigment, siis pidin otsima ka teisi abipigmendi neeldumismaksimume mis on ligilähedased saadud neeldumismaksumil. 5 Martin Tamm (121006YASB) Biokeemia praktikum (töö nr. 2.2 ja 1.3) Joonis 1. Porgandist tehtud neeldumisspekter Nagu näha neeldumisspektri graafikust, siis kaks täiesti eristatavad neeldumismaksimumi ja kolmas peaaegu eristatav neeldumismaksimum on olemas. Karotenoidi sisalduse arvutamine proovis: K = (A * V * d * 103) / (E1cm1% * g)
Kuna neeldumisintensiivsus sõltub valguse lainepikkusest, peab spektrofotomeeter võimaldama valida spektrista antud ühendi jaoks sobiva lainepikkuse. Nähtavale spektriosale vastavad lainepikkused 380-780 nm, saab mõõta vaid värviliste lahuste opt.tihedust. UV alas (185-380nm) neelavad valgust praktiliselt kõik orgaanilised ained. Spetsiifilisem on neeldumine 280-380 nm, seda laineala kasut aine identifitserimiseks neeldumismaksimume järgi. Spektrofotomeeter. Valgusallikas halogeenlamp või deuteeriumlamp. Monokromaator difraktsioonivõre või kolmnurkne prisma, polükromaatne valgus lahutatakse peegeldumisel spektriks. Pilu - mõõtmed määravad kui lai spektriosa läbib uuritava proovi. Mida kitsam pilu, seda täpsem spekter registreeritakse. Suurendades pilu, seda suurem tundlikkus (seda väiksem kontsentratsioon on võimalik määrata)
40 Elektromagnetkiirguse UV (200400 nm) ja Vis osas (400800 nm) mõõdetud neeldumisspekter kannab ka elektronspektri nime. Nende lainepikkuste piirkonnas on valgusenergia sedavõrd suur, et üheaegselt aatomite elektrontiheduse ümberjaotumisega kutsub ta esile ka nende võnkeid ja pöörlemist, mistõttu neeldumisspektris on kitsaste joonte asemel näha laiu triipe. Spektril eristuvaid neeldumismaksimume (,,tippe") iseloomustatakse absorptsiooni (A) või ekstinktsiooniteguri ( või ) väärtusega ja lainepikkusega (max). Kuna igal ainel on unikaalsed neeldumismaksimumid, saab neeldumisspektreid kasutada ka ainete identifitseerimiseks. 41 Kasutatavad instrumendid Spektroskoopilisteks uuringuteks kasutatavate seadmete üldnimetuseks on spektromeeter,
annaabi.ee 
