suhkrute juuresolekul. GOx katalüüsib -D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D- glükoonhappe. Järgmises etapis kasutatakse POx-i mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist kasutades elektronide akseptorina teist substraati, H 2O2, mille oksüdeerumisel moodustub H2O. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiin derivaate, mis on detekteeritavad vastavatel lainepikkustel. Töö käik · Õppejõult saadi prooviks sidrunimahl · Sidrunimahlast tehti 20x lahjendus ja filtriti · Valmistati 1mg/ml glükoosilahsest kaliibrimislahus glükoosi sisaldusega 0,25mg/ml ning sellest kaks lahjendust konsentratsioonidega 0,125mg/ml ja 0,062mg/ml · Seati valmis ja nummerdati 6 puhast katseklaasi
GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL Kasutatavad ained 3 viinamarja mahl, tööreaktiiv: Glükoosi oksüdaas(GOD), peroksüdaas(POD), K4[Fe(CN)6] 0,1 % vesilahus, 0,1 M Fosfaatpuhvrit ph 6. Kemism Glükoosi lahusele lisati tööreaktiivi, kus sisalduv GOD katalüüsib glükoosi oksüdeerumist lahuses sisalduva hapniku toimel. GODis sisalduv flaviinadeniindinukleotiid abil oksüdeerub glükoos glükoonhappeks ja vesinikperoksiidiks. Edasi katalüüsib POD kromogeense substraadi kollase veresoola oksüdeerumist. PODi toimel oksüdeerub kollases vere soolas sisalduv Fe+2 Fe+3ks., millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv punane veresool annab lahusele hele kollaka värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Töökäik Kolmest etteantud viinamarjast uhmerdati välja 1ml klaari mahla. Saadud mahl lahjendati destileeritud veega 250 mlni. Õppejõult saadud glükoosi lahusest tehti kolm 4 kordset lahjendust
oksüdeerumine H2O2-lt pärineva hapniku abil. Oksüdeerides, mõned substraadid anaavad värvilisi produkte. Siis saab kasutada spektrofotomeetri ning jälgida värviliste ühendite kontsentratsiooni, mis on võrdilises sõltuvuses glükoosisisaldusest. Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaasi toimel oksüdeeuva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensiini derivaate. Üheks võimaliseks on o-taoliin, misse helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Oma töös ma kasutasin substraadina kaaliumheksotsüanoferraati(II) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib Fe2+ Fe3+-ks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. 2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ 2 Fe3+ + 2 H2O Töö käik
põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Glükoosi oksüdaas katalüüsib ,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel.Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja D-glükoonhappe. Peroksüdaas ktalüüsib spetsifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati,, mille redutseerumisel moodustub vesi. Pox-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate.Peroksüdaasi reaktsioonil võib kak kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll) K4[Fe(CN)6]. POx katalüüsib Fe oksüdatsiooni Fe3+-ks, 2+ millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane
mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2, mille redutseerumisel tekib H2O. POx-i reaktsiooni saab hõlpsasti jälgida, kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt. Värvilise ühendi kontsentratsioon ehk värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Võib kasutada ka kaaliumheksatsüanoferraati(II), mis oksüdeerudes annab lahusele kollase värvuse (Fe2+Fe3+) ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik Eelnevalt valmistatakse tööreaktiiv (25 ml):
) POx on hemoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina H2O2 (moodustub H2O). Kui substraati oksüdeerimisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), siis saab POx reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon sõltub glükoosisisaldusest. Oksüdeeritud substrat + H2O2 taandatud substraat + H2O värvitu värviline Oksüdeeruva kromogeense substraadinan kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate. Meie juhul aga kasutame kaaliumheksatsüaanoferraati(II), K4{Fe(CN)6}. (kollane veresool). 2 Fe2+ + H2O2 + 2H+ 2Fe3+ + 2H2O kollane veresool punane veresool Punane veresool annab lahusele kollase värvuse. Detekteeritav lainepikkus 410 nm. Sobiv keskkonna pH on 6. Töö käik. 1) Tööreaktiivi valmistamine (25 ml): (tööreaktiv on vajalik glükoosisisalduse määramiseks). - 2,5mg glükoosi oksüdaasi
doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt, siis saab reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid erinevaid orgaanilisi ühendeid. Lisaks orgaanilistele ühenditele võib substraadina kasutada K4[Fe(CN)6] (kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt vesinikperoksiid redutseerub veeks. Tekkiv K3[Fe(CN)6] (punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeriv lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures. Töö käik: Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises
POD katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist (dehüdreerumist). Teine substraat H2O2 toimib seejuures kui vesiniku aktseptor, redutseerudes H2O-ks. Kasutades kromogeenset substraati, saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon on võrdelises sõltuvuses glükoosisisalduses uuritavas proovis. Reaktsiooni põhimõttleine skeem: POD toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina võib kasutada väga erinevaid keemilisi ühendeid. Üheks võimalikuks substraadiks on o- tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Mugavaks substraadiks, mida siin töös kasutataksegi, on kaaliumheksatsüano-ferraat(II) K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerimine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III)
redutseerudes H2O-ks. Saab ka kasutada kromatogeenset substraati, st substraati, mille oksüdatsioonil tekib värviline produkt , siis saab reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses glükoosisisaldusest uuritavas proovis. Reaktsiooni skeem: 2 POD toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina võib kasutada väga erinevaid keemilisi ühendeid. Üheks võimalikuks substraadiks on o-tolidiin, mille helesinine oksüdeeritud vorm on detekteeritav lainepikkusel 639 nm. Mugavaks substraadiks vaadeldava reaktsiooni jaoks on kaaliumheksatsüano-ferraat (II) K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POD katalüüsib selles sisalduva Fe2+ oksüdatsioonil Fe 3+- ks. Sellega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks, tekkiv
substraat), siis saab peroksüdaasi reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem: Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline Peroksüdaasi toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate. O-tolidiini okspüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Peroksüdaasi reaktsioonil võib kasutada substraadina ka kollast veresoola . Peroksüdaas katalüüsib oksüdatsiooni -ks, sealhulgas
POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerimisel moodustub vesi. Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (kromogeenne substraat), saab POx-i reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Lahuse värvuse intensiivsus on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O- tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. Lisaks võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II), K4(Fe(CN)6) ehk kollane veresool. POx katalüüsib Fe 2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasneb H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3(Fe(CN)6) ehk
liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi. Viimane teeb sellest valgust hemo- ehk kromoproteiini. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide oksüdeerumist, kasutades elektronide aktseptorina vesinikperoksiidi, mille redutseerumisel moodustub vesi. POx-i reaktsiooni saab jälgida spektrofotomeetriliselt, kui kasutada substraati, mile oksüdeerumisel tekib kromogeenne substraat (värviline produkt). Värvi intensiivsus on võrdeline uuritava proovi glükoosisisaldusega. Kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate nagu näiteks diaminobensidiin, tetrametüülbensidiin, samuti 2-tolidiin jt. Antud töös kasutatakse substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(II) (K 4[Fe(CN)6]) ehk kollast veresoola. POx katalüüsib raud(II) raud(III)-ks ja vesinikperoksiid redutseerub veeks. Kaaliumheksatsüanoferraat(III) (K3[Fe(CN)6]) ehk punane veresool anna lahusele kollase värvuse, mis on dekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb pH 6 juures.
Värvilise produkti puhul saab POx- reaktsiooni jälgida spektrofotomeetriliselt. Seejuures on värvilise ühendi kontsentratsioon võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. See on tingitud lisatud ainete kogustest. Skeemil on substraadid valesti märgitud. Võrrandi vasakul pool peaks olema värvusetu taandatud substraat ehk kromogeenne substraat (kasutusel mitmed orgaanilised ühendid) ja paremal pool värviline oküdeeritud substraat. Antud töös on kromogeense substraadina kaasutusel kollane veresool K 4[Fe(CN)6]. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, tekib punane veresool K 3[Fe(CN)6]. Viimase kogus on võrdelises sõltuvuses oksüdeeritud glükoosi kogusega, sest GOx reaktsioonil saame ekvimolaarses koguses oksüdeeritud glükoosi ja vesinikperoksiidi. Mida intensiivsem on lahuses punase veresoola kollane värvus, seda kõrgem on tema optiline tihedus ja seetõttu ka glükoosi sisaldus.
7. Milline roll on K4Fe(CN)6 tööreaktiivis? Kas ja millega võinuks teda asendada? Võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6] (kollane veresool). POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ( punane veresool) annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt 8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati? fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0 9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada? Kaliibrimisgraafiku koostamine on vaja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemiseks
Sooladega värvitakse, millest üks ioon annab värvi. On positiivne värvioon (aluseline värv) ja negatiivne värvioon (happeline värv). 3. Kuidas värvuvad mikroobid katioonsete värvidega happelises keskkonnas ja miks? Värvuvad rakud ise ja halvasti sellepärast, et raku negatiivne laeng väheneb H +-ioonidega seostumise tõttu. 4. Missugustes tingimustes värvuvad paremini happelised värvid ja miks? Happelistes tingimustes. Ioniseerudes annavad negatiivse kromogeense osa. Raku negatiivne laeng väheneb H+-ioonide seostumise tõttu. 5. Mille poolest erineb happeliste ja aluseliste värvidega värvimise metoodika? Aluselised värvid värvivad rakku ise (otsene) ja happelised värvid värvivad raku ümbritsevat piirkonda (kaudne taustvärvimine). 6. Negatiivse värvimise põhimõte. Negatiivne = kaudne värvmine. Annab rakukujust hea pildi. Kasutatakse happelisi värve (negatiivne värvioon)
spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine: Peroksüdaas Oksüdeeritud substraat + H2O2 Taandatud substraat + 2 H2O Värvusetu Värviline POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm. ++ 22 H H22O O
Selleks kasutatakse diagnostilist reporter-molekuli ehk märgistatud DNA või RNA (moodustabki sondi!), mis on kas: • radioaktiivsed (32P, 125I, 35S) või • mitteradioaktiivsed (biotiin-avidiin, digoxigeniin,fluorokroomid). Radioaktiivselt märgistatud sondide kasutamine kliinilises diagnostikas on komplitseeritud. Rohkem on kasutamist leidnud biotinülatsioon, mida on võimalik avastada avidiinile seotud ensüümi lisamisega. Hübriidi sedastatakse kromogeense substraadi lõhustamise käigus toimuva värvusreaktsiooni abil, mida hinnatakse visuaalselt või spektrofotomeetriliselt. Kemiluminestsentsi kasutatakse kommertsiaalses süsteemis Gen-Probe. ÜHEAHELALISE SIHTMÄRK-DNA VÕI -RNA VALMISTAMINE. Kuna hübridisatsioon baseerub komplementaarsusel, on vajalik, et uuritav nukleiinhape oleks üheahelaline. Samuti on oluline, et sihtmärgiks oleva DNA või RNA primaarne järjestus püsiks muutumatuna. HÜBRIDISATSIOONIREAKTSIOON LAHUSES
ELISA plaadi (96-auguga mikrotiiterplaat) augud kaetakse antigeenilahusega, toimub antigeeni valgu seondumine plastikpinna külge. Edasi välditakse mittespetsiifiline seostumine, nt valgu kaseiini abil. Kantakse peale analüüsitav seerumlahjendus (primaarne antikeha) ja inkubeeritakse. Inkubatsioon ensüümiga (AP- alkaalne fosfataas või HRP- peroksüdaas), mis on konjugeerunud sekundaarse antikehaga. Märgise hulga mõõtmine- ensüümaktiivsus määratakse kromogeense substraadi abil. Substraadilahus muutub ensüümaktiivsuse toimel värviliseks, spetsiaalse kolorimeetri (ELISA plaadi lugeja) abil mõõdetakse igas augus värvuse intensiivsus (optiline tihedus). ELISA sobib suurte analüüside hulga skriinimiseks, tema analüütiline tundlikkus on väiksem kui radioimmuunmeetodil, kasutatavad reaktiivid on aga stabiilsemad. Kasutatakse ära ensüümi
annaabi.ee 
