Leidsid 17 sarnast õppematerjali, mis on seotud failiga "Immunoloogia praktikumi protokoll". Need materjalid aitavad sul teemat sügavamalt mõista.
geel, proov, elektroforees, tuubi, paneme, antikeha, elisa, temed, lisame, marker, ensüüm, viirus, valgud, geelis, proovid, tween, markeri, tardunud, määramiseks, ülekandmine, filtri, west, direct, immunoloogia, praktikum, lilian, lahutav, buffer, 10ml, katalüsaatorid, lahused, ootame, running, toimumist, värvimine, seguga, isopropanoolTallinna Tehnikaülikool Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: Agnes Kivistik 112483YAGB42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. Valgud jooksevad geelis „+“ poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile „-„laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH - rühma tõttu. Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine:
Immunoloogia Praktikum Õppejõud: Lilian Järvekülg Õpilane: YAGB-42 Tallinn 2012 SDS-PAGE ELEKTROFOREES · Meetod võimaldab valkude komplekside lahutamist molekulaarmassi järgi ja annab liigikaudse hinnangu valgu kontsentratsioonist. · Valgud jooksevad geelis ,,+" poole, kuna nad on kaetud SDS-ga, mis annab neile ,,- ,,laengu. Liikumine geelis toimub lahuses oleva OH- rühma tõttu. · Geelile kanname mitte ainult uuritavad valgud, vaid ka markeri. Marker- valkude segu, mis on kindla suurusega. Töö käik: 1. Geeli valmistamine:
Pesuvahendi kontsentraat Pesuvahendit on vaja: 5,5 ×30 Vesi 100 = 1,65ml Pipetid ja otsikud 5,5−2 ×1,55=2,4 ( ml ) 15ml falkon tuub 2,4 ÷ 0,2=12 1,5 ml tuubid PCR plaadi tükk Töö käik: Teen 15-ml falkon tuubi 5,5ml 30% homogeenset pesuvahendilahust Võtan kaks 1,5ml- tuubi ning pipeteerin mõlemasse 1,55ml lahust. Pipeteerin alles jäänud lahuse 200µl kaupa PCR plaadi aukudesse. Tulemus: Sain 7,5 auku täidetud, kuigi oleks pidanud jätkuma 12 tuubi jaoks. Viga tuli sellest, et detergenti pipeteerides jäid sisse õhumullid, mida tegelikkuses ei oleks tohtinud seal olla. II HARJUTUS Eesmärk: Õppida silma järgi hindama pipeteeritava koguse mahtu. Materjalid:
TALLINNA TEHNIKAÜLIKOOL MATEMAATIKA-LOODUSTEADUSKOND Geenitehnoloogia instutuut Praktiline töö nr. 2 SDS-PAGE Protokoll Koostaja: XXXXXX Juhendajad: Katrina Laks, Merlin Friedemann Tallinn, 2015.a Teoreetiline osa. Elektroforees on makromolekulide eraldamine elektrivälja toimel. SDS-PAGE (naatrium- dodetsüül sulfaat polüakrüülamiid geel elektroforees) on laialdaselt kasutatav valkude elektroforeetilise eraldamise meetod, kus valkude denatureerimiseks kasutatakse SDS-i. SDS (ka laurüül sulfaat) on anioonne detergent, mis seostub valgumolekulidega ja annab molekulidele negatiivse kogulaengu ning elektriväljas liiguvad nad anoodile (positiivselt laetud elektrood). Polüakrüülamiid geel piirab molekulide migreerumiskiirust, kusjuures väiksemad molekulid liiguvad kiiremini, kui suuremad molekulid
ta hakkab lagunema. EtBr seostub kaheahelalise DNAga ning uv-lainete all fluorestseerub oranžide viirgudena. (Suur oht! Mutageen!) Kui geel on piisavalt jahtunud, valasime geeli alusele (konstrollisime, et alus asetsetus horisontaalselt), tegime augu hammastega ning panime üleöö tarduma. 3.1 Praktikum – DNA lahutamine geelis Visualiseerime ona PCRi produkti selleks, et kontrollida, kas
pEGFP-C2. 2. PCR-i produkti puhastamine a) Kaalusime 1,5g agaroosi, viisime mahu TAE puhvriga 100ml-ni ja kuumutasime segu mikrolaineahjus, kuni agaroos täielikult lahustus. Seejärel jahutasime lahust ringjate liigutustega loksutades. Jahtunud segule lisasime 0,5l EtBr, loksutasime ning valasime lahuse geelialusele. Lasime geelil tarduda. b) Kuna produktide pikkus varieerus 300-2000 bp vahel, siis valmistasime 1,5% agaroos geeli. Mida pikemad produktid, seda lahjem peab olema geel, ning vastupidi. c) Kontrollgeeli valasime selleks, et hinnata, kas puhastamine on olnud efektiivne. Kui segusse on jäänud peale soovitava produkti muid jääke, on kontrollgeeli pildil näha peale õige pikkusega lõigu ka teisi bände. Kui aga geelil õige pikkusega bänd puudub, võib arvata, et puhastamise käigus on PCR-i produkt kadunud. Minu proov asub kolmandas positsioonis. Kontrollgeelilt on näha üks õige pikkusega (um 300 bp) lõik, mis näitab, et puhastamine on õnnestunud
(ca 15-20 ml ühele tassile). Liiga kuumas (>60 oC) söötmes antibiootikum laguneb! Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). Nime tuleb kirjutada plaadi äärde, selleks et edasi oleks võimalik eristada sinised ja valged kolooniad. (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega.
(6) Jahuta LB-agar 50-60 oC vesivannis alla ja seejärel lisa antibiootikum (Amp, 100 mg/ml) lõppkontsentratsioonini 100 g/ml, sega korralikult ning vala välja Petri tassidele (ca 15-20 ml ühele tassile). Liiga kuumas (>60 oC) söötmes antibiootikum laguneb! Tassid tarduvad ~15 min pärast. Iga üliõpilane saab ühe Petri tassi ja kirjutab oma nime plaadi äärde (sellele poolele, kus on agar). (7) Transformeeritud rakkude külvamine Petri tassidele: Transformeeritud rakkude tuubi lisa 10 l IPTG ja 10 l X-gali lahust, sega korralikult, kuid ära tsentrifuugi! Nende substraatide lisamine on vajalik beta-galaktosidaasi ekspressiooniks, mis võimaldab identifitseerida bakteri kolooniad, mis sisaldavad rekombinantset plasmiidi (vt lisamaterjalid). (8) Saadud segu (230 l) kanna pipeti abil Petri tassile ning külva laiali kasutades piirituslambi leegis steriliseeritud Trigalski pulka. Trikalski pulka steriliseeritakse 70% etanooli lahusega.
mõneks ajaks tarduma. 52. IPTG-d on lac promootorit aktiveeriv reagent, X-gali on vaja, et bakterite elutegevuse käigus söötmes oli näha sinist pigmenti, antibiootikumi lisatakse, et oleks võimalik selekteerida välja bakterid, kuhu on sisse läinud plasmiid (edukalt transformeeritud elusad bakterid vastava antibiootikumi juuresolekul) 4. Pärast inkubeerisin transformatsioonisegu 90 sekundit 42 °C juures (heat shock) ning tõstsin tuubi 2 minutiks jääle (jahutamine) 5. Lisasin 500 μl LB vedelsöödet ning inkubeerisin kõik 30 minutit 37 °C juures termostaadis. 6. Fuugisin bakterid põhja 2 minutit. Tekkis sade rakkudest, mille pealt tuleb sööde ära valada. Tuubi jäi umbes 100 μl. 7. Pipeti abil kandsin bakterid Peetri tassile (tardunud söötmele) ning kuulikeste abil loksutasin bakterid ühtlaselt laiali. Asetasin tassid inkubaatorisse üleöö kasvama. Pärast säilitakse neid
...................................................................26 6. Anaeroobsete infektsioonide mikrobioloogiline diagnostika.................................................32 7. Spiroheetide,Neisseria, Chlamydia ja Mycoplasma infektsioonide diagnostika.................. .38 8. Seennakkused, algloomnakkused,zoonoosid ja riketsioosid………………………….....48 9. Molekulaarsed meetodid mikroorganismide samastamiseks ja iseloomustamiseks.............63 10. Elektroforees. Viroloogiline diagnostika.................................................................................71 2 Mikrobioloogilise diagnostika põhiskeem 1 A. Uuritav materjal Materjali valik toimub vastavalt haiguse patogeneesile, s.o. haigustekitaja võimalikule lokalisatsioonile organismis. B. Mikrobioloogiline diagnoosimine 1
...... 21 1.2.6 Selivanoff'i reaktsioon ................................................................................ 22 1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga ........................................................................ 23 Kontrollküsimused ............................................................................................... 23 1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID.............................................................................. 25 1.3.1 Rasvapleki proov ....................................................................................... 27 1.3.2. Emulsioonitest ........................................................................................... 28 1.3.3 Akroleiiniproov ........................................................................................... 28 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides ......................................... 29 1.3
lümfotsüüdid. Immunoglobuliinidel on omadus "ära tunda" ja seonduda antigeenidega. IMMUNOGEEN on antigeen, mis kutsub esile immunvastuse. Reeglina makromolekulid. Kõik immunogeenid on antigeenid, aga mitte alati vastupidi. Immunogeensus antigeenil sõltub molekuli suurusest, keemilistest omadustest jne. Nõrgad immunogeenid ei saa degradeerida ja esitleda T- rakkudele. Suur, lahustumatu makromolekul on parem immunogeen, kui väike. HAPTEEN on madalmolekulaarne aine, millel on epitoop e. antikeha seostumise koht, kuid mis ise ei kutsu esile immuunvastust. EPITOOP ehk antigeenne determinant on antigeeni osa, kuhu antikeha seondub. Immunogeensus - võime esile kutsuda spetsiifilise im.vastuse (humoraalsel või rakulisel tasandil). Antigeensus on võime spetsiifiliselt seonduda AK-de või TCR-iga KAASASÜNDINUD IMMUUNSUS moodustab esmase kaitseliini, kiire, kuid mitte tõhus: a. Anatoomiline i. Nahk patogeenivastane barjäär, happeline keskkond. ii
kannavad ka T-lümfotsüüdid, mille pinnal on nakatatud rakke ära tundvad retseptorid. Veel üheks rakulise immuunsuse kandjaks on NK-rakud. T-lümfotsüüdid ja NK-rakud täiendavad üksteist: need nakatatud rakud, mis jäävad märkamatuks T-rakkude poolt, äratavad NK-rakkude tähelepanu, ja vastupidi. 6. Klonaalse selektsiooni hüpotees B-rakkude aktivatsioon ( T-rakud sama põhimõte); aktiveerimata rakud = naiivsed ja aktiveeritud =efektor- rakud. Antikeha sekretsioon ja samas ka mälurakkude teke Omandatud immunsuse põhimõiste, mis väidab, et omandatud immuunvastuse annavad iseseisvad antigeen-spetsiifilised lümfotsüüdid, mis on organismi enda suhtes tolerantsed. Seleteeritakse välja need rakud, mis ei reageeri organismi enese antigeenidega. Selektsiooni mitte läbinud lümfotsüüdid lähevad apoptoosi ja nad fagotsüteeritakse makrofaagide poolt. Positiivne selektsioon toimub tüünuse koores, negatiivne säsis
2. isoleerimine/kultuurimeetod plussiks on spetsiifilisus. Miinused: mikroob ei tohi transpordi käigus enne kultuuri panemist ära surra; võib siiski osutuda mittespetsiifiliseks (söötmetest sõltuv); aeganõudev (tuberkuloosibakter kasvab 1,5 2 kuud); nõuab samastamist (kasvatame üles, peame veel kinnitama, et on see bakter DNA hübridisatsiooniga); inimest on juba ravima hakatud ja alles siis võetakse proov kasv on pärsitud juba; saastamine transpordil. 3. Biotestid 1. rakukultuur kliiniline proov, millega neid rakke nakatame. Kõige tuntum on klamüüdia diagnostika. Rakukultuuris kasvatatud organism ei tohi olla transpordil või ravi tõttu surnud. 2. Loomkatsed katkupisiku diagnostika. Eetikaküsimus. Loomad on väga kallid. Loomakaitsjad võitlevad selle vastu. 4. Kiirmeetodid (molekulaardiagnostika) 1. nukleiinhapete määramine 2
Millise jaoks kõige suurem, see on parem substraat. Sellest lähutvalt on kõige parem florofumaraat. Kui ensüüm-substraadiga küllastatud, siis toimub florofumaraadiga reaktsioon oluliselt kiiremini kui teistel. Kui aga ütleme, et see substraat on kõige parem, mis seostub kõige tugevamini, siis on parem see substraat, millel on kõige väiksem K M. Sellisel juhul on hea substraat fumaraat, sest seostub paremini. Vastata võib seda, et parem on see, mis on parem otse konkureerides, st et paneme mõlemad substraadid ühte potti kokku ja ensüüm saab valida, millega tahab rohkem katalüüsi läbi viia. Sellisel juhul näeme, et hoopis spetsiifilisuse konstant on see, mis määrab ära otsekonkurentsis reaktsiooni kiiruse vms. Seos kehtib suvalise substraadi kontsiga, ükskõik milline on substraadi konts K M suhtes. Siis see seos sobib, kui ühes potis kaks substraadi koos, sest siis vaba ensüümi
Erinevate „lahtrite” koerakud ekspresseerivad vastavaid adhesioonimolekulide ligande ja toodavad vastavaid kemokiine. Lokaalsetes „lahtrites” kontrollivad lümfotsüütide liikumisi koespetsiifilise adhesiooni ja kemokiinide mõjud. Sekretoorne IgA: Kuigi osa IgA (teda on umbes 3 g/l s.h. IgA1 80% ja IgA2 80%) antikehadest tehakse süsteemses immuunsüsteemis (see tähendab, et osaliselt luuüdis), valmib enamik siiski plasmarakkude poolt toodetuna lamina proprias. See antikeha transporditakse üle epiteliaalsete rakkude trakti luumenisse ehk valendikku spetialiseerunud mehhanismi abil: IgA subepiteliaalses lamina proprias seondub IgA polü-Ig retseptoritega ja transporditakse endosoomide kaudu luumeni ehk valendiku pinnale. Mitte vähem kui 3g transporditakse päevas gastrointestinaaltrakti, millest 1/3 läheb maksa ja sapi kaudu. See kaitseb mukoosseid pindu mikrobiaalse invasiooni eest. Sekretoorset IgAd leidub pisarates,
Erakorralise meditsiini tehniku käsiraamat Toimetaja Raul Adlas Koostajad: Andras Laugamets, Pille Tammpere, Raul Jalast, Riho Männik, Monika Grauberg, Arkadi Popov, Andrus Lehtmets, Margus Kamar, Riina Räni, Veronika Reinhard, Ülle Jõesaar, Marius Kupper, Ahti Varblane, Marko Ild, Katrin Koort, Raul Adlas Tallinn 2013 Käesolev õppematerjal on valminud „Riikliku struktuurivahendite kasutamise strateegia 2007- 2013” ja sellest tuleneva rakenduskava „Inimressursi arendamine” alusel prioriteetse suuna „Elukestev õpe” meetme „Kutseõppe sisuline kaasajastamine ning kvaliteedi kindlustamine” programmi Kutsehariduse sisuline arendamine 2008-2013” raames. Õppematerjali (varaline) autoriõigus kuulub SA INNOVEle aastani 2018 (kaasa arvatud) ISBN 978-9949-513-16-1 (pdf) Selle õppematerjali koostamist toetas Euroopa Liit Toimetaja: Raul Adlas – Tallinna Kiirabi peaarst Koostajad: A
annaabi.ee 
