Kordamisküsimused geneetikas bioloogia õppesuuna üliõpilastele loeng 11 kohta: 1. Sõnasta molekulaarbioloogia tsentraaldogma? Võib ka joonisena esitada. Geneetilise informatsiooni ülekandumine rakus toimub kindlates suundades: DNAlt RNAle ja RNAlt DNAle ja RNAlt valgule. 2. Nimeta geenide avaldumise kontrolli tasandid (2)? RNA tasand kontroll transkriptsiooni tasandil. valgu tasand - kontroll translatsiooni tasemel, - post-translatsiooniline kontroll. 3. Kus asuvad geeniekspressiooni kontrollpunktid transkriptsiooni tasandil? Esimesel tasandil - kontroll mRNA tekkel ehk transkriptsiooniline kontroll promootor, enhancerid jt. DNA järjestused transkriptsiooni kontrolliks + trans elemendid (regulaatorvalgud) transkriptsiooni käivitamise tasand, kontroll mRNA protsessingu tasemel, kontroll mRNA transpordi tasemel tuumast tsütoplasmasse, kontroll mRNA lagundamise ehk degradatsiooni tasemel 4
NB! mRNA eukarüoodil on reeglina (>90%) monotsistroonne, s.t. kodeerib ühte valku (prokarüoodil polütsistroonne). II Elongatsioon; toimub polüpeptiidahela pikenemine kuni stop koodonini (UAA või UAG või UGA).III Terminatsioon toimub, kui translatsioon jõuab mRNA ahelas stop koodonini. järgneb valgu, mRNA ja tRNA vabanemine ribosoomi subühikute eraldumine. Sellega on lõppenud valgusünteesi ribosoomi tsükkel.Järgneb valgu post translatsiooniline töötlus, mille tulemusena valk pakitakse õigesti kokku. 11. Valgu ja polüpeptiidi erinevus? Polüpeptiid - pikem aminohapete järjestus; Valk - polüpeptiid (või nende kompleks), millel on defineeritud 3D-struktuur; sageli olemas ka kvartenaarstruktuur ehk neljandat järku struktuur. 12. Nimeta olulisemad valkude posttranslatsioonilise modifitseerimise mehhanismid?1. Valkude aktiivsust moduleerivad ehk muudavad Ca2+ ja GTP. 2.Valkude tsükliline fosforüleerimine
reguleerida? Transkriptsiooni tasandil – reguleeritakse, millistest geenidest tehakse RNA. Sellest ka all peamiselt juttu. RNA protsessingu tasandil – reguleeritakse, milliseid RNA-sid või nende osi (splaissing) lubatakse tuumast tsütoplasmasse siseneda (mRNA-d). Translatsiooni tasandil – reguleeritakse, millistest mRNA-dest või nende osadest tehakse valgud (tervest mRNA-st ei pruugi valku tulla). Post-translatsiooniline tasand (valkude modifitseerimine) – reguleeritakse, millise lõpliku funktsiooni teatudud valgud saavad (või üldse lagundatakse). 20. Miks ja millal on vaja geeni avaldumist rakus kontrollida ja reguleerida?et rakud oleksid just sellise ehituse ja ülesannetega, nagu organismi toimimiseks vaja on. 21. Millised keskkonnategurid mõjutavad geeniregulatsiooni? kemikaalid,ravimid,temp,valgugs,toit,hormoonid,ainevahetus,sisetemp 22. Mis tüüpi haigus on polüdaktüülia
Prokarüootides ei toimu mRNA modifitseerimist ja translatsioon ning transkriptsioon mõlemad toimuvad tsütoplasmas. Eükarüootidel toimub transkriptsioon tuumas, translatsioon ribossomis. 12. Eükarüootidel toimub transkriptsioon tsütoplasmas, translatsioon ribossomis. Enne peab transkriptsioon tuumas lõppema ja mRNA tuleb toimetada ribosoomi, et saaks alata translatsioon. 13. Valkude post-translatsiooniline modifitseerimine: · Valkude kokku pakkimine · Biokeemiline modifitseerimine · Translokatsioon erinevatesse raku organellidesse · Degradatsioon proeasoomides, lüsosoomides 14. Aminohapete aktiveerimine ja aminoatsüül.tRNA kompleksi formeerumine amonoatsüül-tRNA süntetaas. Peptiidsidemete moodustumine translatsioonil peptidüültransferaas. Nekleotiidide ühendamine RNA transkriptsioonil ribosüümid (ligaasid). 15
Kolmas gloobul (nõrgad sidemed). Neljas: mitme polüpetiidi ühinemine. Valgu struktuuri muutmine: valkude denaturatsioon- valkude kõrgemat järku struktuuride lagunemine (nt kuumutamine) valkude renaturatsioon- kõrgemat järku valkude taastumine valkude hüdrolüüs- peptiidsidemete lõhkumine (keetmine) Translatsiooni järgselt suunatakse valk kloroplasti. Translatsioon ja post-translatsiooniline regulatsioon Koodonikasutus geenid, mille ekspressiooni tase on rakus madal, sisaldavad nö. haruldasemaid aminohappeid (sünonüümsus koodonite puhul) Inhibitsioon lõpp-produktiga mida rohkem on sünteesitud valku, seda rohkem see takistab edasist sünteesi. Koodonit nukleotiidi kolmikud, millele vastab konkreetne aminohape Epigeneetika: Igasugune potentsiaalselt stabiilne ja pärandatav muutus geeni ekspressioonis, mis tekib ilma DNA järjestuse muutuseta.
kehades, osalevad splaissimisel snoRNA – small tuumakese RNA, modifitseerivad teisi RNAsid miRNA – mikro RNA, osaleb geeniregulatsioonis siRNA – small interfering RNA, osaleb geeniregulatsioonis piRNA – piwi-interacting RNA, peamiseks funktsiooniks on transopsoonide kaitse SRP RNA – signaali äratundmis kompleksi RNA komponent. Funktsiooniks ko-translatsiooniline translokatsioon ja post-translatsiooniline transport. IncRNA – pikk mittekodeeriv RNA, reguleerib geenide transkriptsiooni ning osaleb epigeneetilises regulatsioonis TERC – telomeraasi RNA komponent Rnaaside RNA komponent scaRNA – väikesed cajal keha RNAd • • Regulatoorse RNA liigid ja klassifitseerimine 1. miRNA – mikro RNAsid leidub eukarüootsetes rakkudes. miRNAd
Sisekapsiidi minoorne valk, interageerub 1 ja 2 valkudega, on ensümaatiliselt aktiivne, RNA transkriptaasi katalüütiline subühik (sisaldab GDD motiivi). Oluline ka RNA selektsiooni ja pakkimise protsessis. µ1 (76 kDa). Väliskapsiidi peamine struktuurvalk (interageerub 2 ja 3 valkudega). µ1-valk modifitseeritakse posttranslatsiooniliselt N-terminaalse müristüleerimise teel. µ1 on oluline raku membraanide läbimiseks virionide poolt. µ1 valgule on iseloomulik intensiivne post- translatsiooniline protsessing: - Virionides kujutab enamus µ1 valgust (95%) endast protsessitud vormi µ1C (eemaldatud on 42 N-terminaalset ah jääki, nn. µ1N peptiid (4.3 kDa), mis jääb samuti virioni). See protsessing on autokatalüütiline ja leiab aset seoses partiklite moodustamisega (seondumisel 3 valguga); - peale selle esineb ka protsessing µ1 ja µ1C valkude C-terminaalses regioonis (seda teostavad raku trüpsiin- või kemotrüpsiin proteaasid)
molekulid;Katalüüsivad peptiidsidemete teket aminohapete vahele (Sic! Ribosüümid!), kasutades ATP või GTP keemilist energiat. GEENI EKSPRESSIOONI REGULATSIOON 1)Transkriptsiooni kontroll; 2)RNA töötlemine (protsessing): Polünukleotiidahela splaising (pleissimine); Nukleotiidse järjestuse (nn capi) lisamine 5' otsa; Polüadenüleerimine; 3)RNA transpordi kontroll (transportvalkude abil); 4)Translatsiooni kontroll. 5)RNA degradatsiooni reguleerimine; 6)Valgu post-translatsiooniline modifitseerimine (aktiivsuse reguleerimine). VALGU BIOSÜNTEESI REGULATSIOON TRANSKRIPTSIOON TASEMEL - Laktoosi operon e lac operon kui "negatiivse kontrolli" näide. Operon lähedaste funktsioonidega geenide rühm, mille transkriptsioon ja reguleerimine toimub ühtse blokina; tüüpiline prokarüootsetele rakkudele. Lac operon sisaldab kolme laktoosi metaboliseerimiseks vajalikku valku (ensüümi) kodeerivat struktuurgeeni: ß-galaktosidaas e laktaas,
polüproteiinist P123 ja nsP4 valgust. Hiline replikatsioon ei ole sõltuv pidevast valgusünteesist ja toimub juba valminud sfäärulites. Hiline replikaas kujutab endast täielikult protsessitud nsP1, 2, 3 ja 4 stabiilset kompleksi ning sünteesib nii genoomseid kui subgenoomseid (+)RNA ahelaid. Struktuursed valgud sgRNA-lt 3h pärast nakatumist polüproteiini alguses paikneb tugev translatsiooniline enhanser, mis võimendab struktuurse polüproteiini translatsiooni ligi kümme korda. Enhanseri toime põhineb viirus-indutseeritud translatsioonilise bloki kompenseerimises. C: kattevalk (kapsiidivalk) P62 – E3+E2 = viimane etapp. RNA pakkimissignaal- asub RNA ns-valke kodeerivas alas. Kollatõve E viirus (HEV) HEV-il on membraanideta ikosaeedrilised virionid ja positiivse polaarsusega RNA genoom
Initsieerimine sisaldab mRNA ja initsiaator aminoatsüül-tRNA sidumist ribosoomi väikesele subühikule, millele järgenb seostumine suurele subühikule. Elongatsioon: kõikide peptiidsidemete süntees. Terminatsioon leiab aset kui jõutakse ,,stop" koodonini. Valgu süntees eukarüootides. Iseärasuseks on mRNA-1,5'-metüül-GTP ,,cap" ja polü-A saba. Valgu sünteesi initsieerimisel eukarüootides osaleb vähemalt 11 valgulist initsieerimisfaktorit. 5. Post-translatsiooniline valkude modifitseerimine. (1) valkude pakkimine; (2) biokeemiline modifitseerimine; (3) translokatsioon raku erinevatesse organellidesse; (4) degradatsioon proteasoomidesse ja lüsosoomides. Valkude pakkimisele osalevad molekulaarsed tsaperonid. Hsp70 tunneb ära uute sünteesitud peptiidahelate kokkupakkimata piirkonnad, eriti hüdrofoobsed alad. Ta seondub nendele piirkondadele ning kaitseb neid kuni produktiivse kokkupakkimiseni.
Ebanormaalne valgu agregatsioon iseloomustab väga paljusid neurodegeneratiivseid haiguseid, nagu nt Alzheimeri tõbi ja Parkinsoni tõbi. Alzheimeri tõve puhul toimub hüperfosforüleeritud tau valkude agregeerumine. 47. MicroRNAs (miRNA) ja väiksed splaisosoomi RNAd (snRNA). miRNA-del on oma geenid ning nad reguleerivad geeni ekspressiooni ning on olulised arenguprotsesside regulatsioonil. miRNAdel on osaline komplementaarsus mRNA 3’UTRs, tagajärjeks on translatsiooniline repressioon või märklaud mRNA degradatsioon ja geeni vaigistamine. Küps miRNA on osa aktiivsest RISC kompleksist, mis sisaldavad ka Argonaut valke. Kui miRNA on seondunud märklaud-mRNAga, toimub mRNA lõikamine Argonaut valgu vahendusel. miRNAd on umbes 22 nukleotiidi pikkused. snRNA-d on tavaliselt U-rikkad. Splaisosoomid koosnevad snRNAdest ja valkudest. snRNAde ülesandeks on intronite väljalõikamine GT/AG äratundmisjärjestuste kaudu. Keskmine pikkus on 150 nukleotiidi
ahela katki. RISC kompleks funktsioneerib ka kui translatsiooni inhibiitorid. Inimese let-7 miRNA, näiteks, on leitud täiesti let-7 miRNAga komplementaarset sünteetilist märklaud RNAd lagundava RISC kompleksi koosseisust. RISC kompleksil arvatakse olevat 2 funktsiooni : 1) siRNA funktsioon (ehk RNA interferents), 2) miRNA funktsioon, mille tagajärjeks on üksikuid mitte-paardunud nukleotiide sisaldavate märklaud mRNAde translatsiooniline repressioon. RNA interferents arvatakse olevat iidne raku mehanism taimedel ja loomadel, millega rakk kaitseb end teatud viiruste ja mobiilsete geneetiliste elementide vastu. Taimed, milledes on tuvastatud Diceri või RISC kompleksi valkude mutatsioonid, on oluliselt tundlikumad RNA viiruste infektsioonile ja transposoonide liikumisele nende genoomis. Taimede kaksikahelaline RNA indutseerib ka sama järjestust sisaldava genoomse DNA metüleerimist. Viimase mehanism ei ole teada
DNA nukleotiidset järjestust, millega ensüüm sünteesi alustamiseks ühinema peab, nimetatakse promootoriks. 2. Mis vahe on miRNA ja siRNA vahel. miRNA micoRNA, on lühikesed, keskmiselt 22 nukleotiidi pikad ribonukleiinhapped (RNA), mis esinevad eukarüootsetes rakkudes. MiRNAd on posttranskriptsioonilised regulaatorid, mis seonduvad messenger RNA (mRNA) transkriptide komplementaarsetele järjestustele. Tavaliselt on selle tagajärjeks translatsiooniline repressioon või märklaud-mRNA degradatsioon ja geeni vaigistamine. siRNA - väike interfeeriv RNA, osaleb transkriptisoonijärgses geenide vaigistamises. Is a class of double-stranded RNA molecules, 20-25 base pairs in length. siRNA plays many roles, but its most notable is in the RNA interference pathway, where it interferes with the expression of specific genes with complementary nucleotide sequence.
moodustunud 30S IC, seondub 50S ja eemaldub IF3, siis teised, on moodustunud 70S IC. IF2 hüdrolüüsi (GTP hüdrolüüs) tagajärjel läheb ribosoom üle elongatsiooniliseks ribosoomiks. Järjekorrad pole 100% kindlad. Reinitsiatsioon – algab terminatsioon, ribosoom laguneb, aga enne kui mRNA ära läheb, tuleb uus IF3 ja võib uuesti alustada. Kasutatakse siis kui mitu ORFi on järjest, võib-olla on kahe ORFi vahel järjestused, mis seda soodustavad. Translatsiooniline kontroll bakterites == - poomisvastus (stringent response) Aminohapete nälja tingimustes pole võimalik tRNA-sid aminoatsüleerida. Kui ribosoomi siseneb aminoatsüleerimata tRNA, aktiveerub ribosoomiga seondunud valk RelA. RelA katalüüsib guanosiin tetrafosfaadi (ppGpp) ja pentafosfaadi (pppGpp) sünteesi. (p)ppGpp omakorda seondub RNA polümeraasiga, mis seepeale pole enam võimeline transkriptsiooni initsieerima. Nii peatab rakk energeetiliselt kuluka
üht RNA ahelat. Seal protsessitakse kaksikahelalisi siRNAsid ja miRNAsid edasi. RISC lõikab märklaud-mRNA, mis on täpselt komplementaarne vastavale üksikahelalisele siRNAle, ahela katki. Funktsioneerib ka kui translatsiooni inhibiitor. RISC kompleksil arvatakse olevat kaks funktsiooni: siRNA funktsioon ehk RNA interferents ja miRNA funktsioon, mille tagajärjeks on üksikuid mittepaardunud nukleotiide sisaldavate märklaud- mRNAde translatsiooniline repressioon. Tsütoplasmaatiline polüadenüleerimine - vastusena välissignaalile hakatakse mõnede mRNAde lühikesi polü(A)-sabasid pikendama, see stimuleerib nende mRNAde translatsiooni. NMD (non-sense mediated decay) ühe või enama eksoni vahelejätmine, mis põhjustab ekson-intron liidese vahetus 3' läheduses stoppkoodoni sissetuleku - ja teised mRNA järelevalve mehhanismid hoiavad ära ebaõigelt protsessitud mRNAde translatsiooni
oksüdeerimiseks. Transport toimub signaaljärjestuse alusel, membraani translokaatorite vahendusel, ei vaja lahtipakkimist, on posttranslatsiooniline. ● Tsütosool – ER (transmembraanne), transpordiks on vajalik ER signaaljärjestus, lisaks on vajalik signalrecognition particle SRP, mis tunneb ära ühelt poolt ER-I järjestust ja teiselt poolt seondub SRP retseptoriga ER-I membraanil. Valkude transport ER-I on ko-translatsiooniline. 98.Vesikulaartranspordi põhimõte; sekretoorne ja endotsütootiline rada. Vesikulaartransporti suunavad valgud (Rab, SNARE) ja nende roll botulotoksiini toimemehhanismis. Vesikulaartransport - retseptor-vahendatud Membraaniga ümbritsetud transportvesiikulid kannavad laadungi ühest kohast teise. Selline transport käib ER-i ja Golgi kompleksi vahel, Golgi kompleksi ja lüsosoomide ning välismembraani vahel. Selle transpordi puhul toimub transportvesiikuli pungumine
aktiveerib regulatoorne RNA, valk või temperatuuri tõus, mis harutab juuksenõela lahti ja vabastab RBS-i. Translatsiooni initsiatsiooni pärssivate sekundaarstruktuuride kadumine kõrgemal temperatuuril. Kuumashoki sigma faktori RpoH mRNA muutub transleeritavaks kõrgemal temperatuuril. Translatsiooni initsiatsiooni pärssimine antisens-RNA abil micF on iseseisva geeni poolt kodeeritud antisens-RNA, mis paardub endale osaliselt komplementaarse mRNA 5' otsaga. micF RNA on translatsiooniline repressor. micF paardub ompF (kodeerib välismembraani valku F) mRNA RBS-i ja initsiaatorkoodonit AUG sisaldava alaga, blokeerides ompF geeni translatsiooni. Need micF RNA molekulid, mis ei ole paardunud ompF mRNA-ga, võtavad sekundaarstruktuuri, mis soodustab nende degradatsiooni. micF RNA ekspressioonitase on rakus maksimaalne madala temperatuuri ja madala osmootse rõhu korral. Translatsiooni attenuatsioon Translatsiooni attenuatsiooni on kirjeldatud MLS (makroliid,
90. S. Rutherford, S. Lindquist (1998). Hsp 90 roll rakus on kontrollida valkude struktuuri. Üks chaperonide liike. Suunab valesti struktureeritud valgud lagundamisele. Surub maha väga paljude mutantsete geenide avaldumise. Valkude kotranslatsiooniline transport - levinud bakterites, arhedes ja eukarüootides - süntees membraani küljes - valk liigub kohe läbi membraani - esimesed 10-20 sünteesitavat AH-d on signaaliks transpordile - ribosoomides tekib translatsiooniline arest kui signaalosa tuleb nähtavale - ribosoomid seostuvad membraanida ja valk sünteesitakse luumenisse - signaaljärjestus lõigatakse ära luumenis - Sec 61 võimaldab valgul liikuda ka „külje-ukse“ kaudu, millega valk läbib membraani. Põhiline osaline kotranslatsioonilises transpordis. Ko-translatsiooniline transport 42 Mis saab valguga, kui ta on valmis sünteesitud. Valku transporditakse lõplikku kohta kompleksis chaperonidega
Faagi T4 ssDNA-ga seonduva valgu translatsioon T4 valk gp32 on ssDNA-ga valk, mis osaleb faag T4 replikatsioonil. Kui ssDNA on ära seotud, seondub gp32 enda mRNA-le, pärssides sellelt translatsiooni. Seega on gp32 hulk rakus otseselt seotud vaba ssDNA hulgaga. Translatsiooni initsiatsiooni pärssimine antisens-RNA abil micF on iseseisva geeni poolt kodeeritud antisens-RNA, mis paardub endale osaliselt komplementaarse mRNA 5' otsaga. micF RNA on translatsiooniline repressor. Ta paardub ompF (kodeerib välismembraani valku F) mRNA RBS-i ja initsiaatorkoodonit AUG sisaldava alaga, blokeerides ompF geeni translatsiooni. Need micF RNA molekulid, mis ei ole paardunud ompF mRNA-ga, võtavad sekundaarstruktuuri, mis soodustab nende degradatsiooni. micF RNA ekspressioonitase on rakus maksimaalne madala temperatuuri ja madala osmootse rõhu korral. 18
muutustega, mida viib läbi allosteeriline regulatsioon. Aeglasem vastus keskkonnast tulnud signaalile on geenide ekspresseeritavuse muutmine, mis sisaldab endas mitut kontrollpunkti. Geenide avaldumist saab reguleerida transkriptsiooni initsiatsiooni ja transkriptsiooni enneaegse terminatsiooniga ehk attenuatsiooniga ning post-transkriptsiooniliselt RNaaside abil reguleerides RNA eluiga. Samuti on oluline kontrollpunkt translatsioon ning post-translatsiooniline valkude pakkimine ning degradeerimine. 68 Keskkonnast vastuvõetud signaalile võib bakter reageerida erinevalt, muutes ainult ühe geeni avaldumist või reguleerides mitme või isegi sadade geenide avaldumist korraga. Selleks, et toimuks geenide avaldumine, on esmalt vaja geene transkribeerida RNA-ks. Transkriptsioon jaguneb initsiatsiooniks, elongatsiooniks ning terminatsiooniks.
annaabi.ee 
