viirusesse(geenide ülekanne). viirusesse(geenide ülekanne). Rekombinantne DNA DNA Rekombinantne DNA DNA molekul, milles on ühendatud molekul, milles on ühendatud eri eri liikidelt pärit DNA osad. liikidelt pärit DNA osad. Rakkudesse viiakse võõraid Rakkudesse viiakse võõraid geene viirusvektori abil, plasmiidse geenivektoriga, geene viirusvektori abil, Agrobakteriga, DNApüssiga plasmiidse geenivektoriga, või mikropipetiga. Agrobakteriga, DNApüssiga või Restriktaastehnika: 1. Sama mikropipetiga. restriktaas tunneb ära sama Restriktaastehnika: 1. Sama järjestuse DNA eri molekulides. 2. Restriktaas restriktaas tunneb ära sama
8. Miks on vaja Mg-d restriktaasi puhvris? Kahevalentne katioon, tavaliselt Mg++ on ensüümi tööks absoluutselt vajalik 9. Miks lahus 1? 2? 3? Lahus 1 sisaldab glükoosi, EDTA ja Tris-HCl. EDTA seob kahevalentseid metallioone, mis on vajalikud nt DNaasi tööks + EDTA aitab stabiliseerida DNA fosfaat selgrooga . Suspendeeritakse puhvris, sest vees võib DNA laguneda. Lahus 2 sisaldab SDS ja NaOH. Aluseline töötlus, mille käigus detergent SDS lõhub rakumembraani ja alus saab seonduda plasmiidse DNAga, mis seejärel denatureerub. Aluselises keskkonnas rakud lüüsuvad ja DNA denatureerub. Segada õrnalt. Lahus 3 sisaldab KOAc (kaaliumoksaalatsetaat). See neutraliseerib lahust ja lubab plasmiidse DNA renatureerimise ja KOAc aitab sadestada detergendi (SDS). Kuna viiruse genoom on väiksem, siis renatureerub ta kiiremini kui bakteri 4Mb suurune kromosoom. Kromosoom ei jõua kaheahelaliseks minna. 10. Miks RNA töötlus?
1 μl T4 DNA ligaasi (sünteesib fosfodiester sidemeid) 1,5 μl MQ vett 48. 49.Transformeerimine 50. Eesmärgiks on peale ligeerimist saadud DNA molekuli viimine kompetentsetesse E. Coli bakterisse ja see on oluline selleks, et saaksime kiiresti ja odavalt ning väga väikese vigade hulgaga palju seda plasmiidi (paljundame seda bakteris). Bakterid on eelnevalt töödeldud divalentsete katioonidega (Ca2+, Mn2+), mis muudab rakuseina laengu positiivseks. Plasmiidse DNA lisamisel kinnitub see rakuseinale. Bakteri rakke kuumutatakse lühikest aega ning kuna E. Coli rakke töödeldakse külmades tingimustes, toimub temperatuuri muutus (heat shock) ning selle tulemusena tekivad rakuseina kahjustused, kust plasmiidne DNA pääseb rakku. 51. Sini-valge selektsioon: järjestus on kodeeritud lacZ keskele ning lacZ kodeerib β- galaktosidaasi. Substraadi X-gal juuresolekul tekitavad bakterid elutegevuse käigus (β-
Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis kui palju tuleks DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat? Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis milline on rakkude kompetentsus? Kui rakkude kompetentsus on 106, siis tuleks 0,1 ng DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat. Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis rakkude kompetentsus on 104. Töö nr 3: Rekombinantse plasmiidse DNA minipreparatsioon. Lähteained: Bakterikoloonia (sisaldab rekombinantset plasmiidi) kasvatatud Amp-LB vedel-söötmel 12-20 h (nn. ,,over night" ehk ON kultuur). Meie rühmas oli kolooniate arv väike, st transformatsiooni efektiivsus oli madal. Rakud olid säilitusel kaotanud kompetentsuse. Lahus I (50 mM glükoos, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA- Na2) Lahus II (0,1 N NaOH*, 1% SDS; * erineb sellest, mis on toodud DNA kokaraamatus; 0,1 N lahuse
BIOTEHNOLOOGIA KT2 Geenitehnoloogia on biotehnoloogia haru, kus eesmärgi saavutamiseks viiakse gene ühest organismist teise või muudetakse gene muul viisil. Geenitehnoloogia meetodid: - Transgeensete organismide loomine: võõra geeni viimine ühest organismist teise - Mutagenees: kuntslikult soovitud mutatsioonide esilekutsumine - Geeni-nokaut: organismi teatud geeni time surutakse alla Kuidas geenid üle kanda? 1. Bakteri plasmiidiga – plasmiidse vektori abil 2. Viirustega – viirusvektori abil 3. Kullapüstoliga – Au kuulikesele on kinnitatud DNA, see “tulistatakse” rakku 4. Taimedesse Agrobakteriga – taimi kergesti nakatav bakter 5. Homoloogiline rekombinatsioon – Dna molekuli homoloogiliste piirkondade vaheline ristsiire, kus rekominantne DNA asendab olemasoleva Erinevate DNA-de liitmisel same rekombinantse DNA. Kuidas DNA-d lõigata? Restriktaasid on ensüümid, mida toodavad bakterid enesekaitseks
Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis kui palju tuleks DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat? Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis milline on rakkude kompetentsus? Kui rakkude kompetetnsus on 106, siis tuleks 0,1 ng DNA-d transformeerida, et plaadil näha 100 kolooniat. Kui 100 ng plasmiidi transformatsiooni tulemusel kasvab plaadil 1000 kolooniat, siis rakkude kompetentsus on 104. Töö nr 3: Rekombinantse plasmiidse DNA minipreparatsioon. Lähteained: Bakterikoloonia Nr.6 (sisaldab rekombinantset plasmiidi) kasvatatud Amp-LB vedel-söötmel 12-20 h (nn. ,,over night" ehk ON kultuur). Lahus I (50 mM glükoos, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA- Na2) Lahus II (0,1 N NaOH*, 1% SDS; * erineb sellest, mis on toodud DNA kokaraamatus; 0,1 N lahuse kasutamine 0,2 N asemel tõstab oluliselt DNA saagist ning võimaldab eraldada maksimaalse koguse superspiraalset plasmiidi vormi K. Mätlik ja M
rakkude uurimiseks. · pommitamine kullaosakestega (geenipüss) · magnetofektsioon DNA seotakse magnetiseeruvate nanoosakestega ja magnetvälja mõjul sisestatakse rakku. · Mikroinjektsioon DNA süstitakse otse üksikutesse rakkudesse, transgeensete loomade tegemisel kasutatakse 2. Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents- efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega, mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI polüetüleenimiin pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub läbi membraani. 3
Ebapüsiv, liikuv, uudne ja võib toimuda prokarüoodilt prokarüoodile, prokarüoodilt eukarüoodile kui ka eukarüoodilt prokarüoodile Horisontaalses ülekandes on 2 osapoolt: DOONOR ehk DNA VÄLJASTAJA ja RETSIPIENT ehk DNA VASTUVÕTJA. Üleantavat DNA-d nim endogenoodiks. o Doonor – bakter, kes väljastab geneetilist materjali DNA või RNA näol o Retsipient – bakter, kes võtab väljastatud geneetilise materjali vastu 20. Plasmiidse DNA piirkonnad Plasmiid kujutab endast kaheahelalist DNA rõngasmolekuli, mis replitseerub bakteri genoomist sõltumatult. Plasmiidid esinevad peaagu kõigis bakterites, seejuures võib ühes rakus olla mitu erinevat plasmiidi. Plasmiidi DNA koosneb funktsionaalselt 2-3 piirkonnast; - Plasmiidi replikatsiooni eest vastutavad geenid - Plasmiidi ülekannet teistesse bakteritesse determineerivad geenid (võivad ka puududa)
E2-s sisalduv SDS solubiliseerib (lahustab pisikesteks puhvris ujuvateks mullikesteks e.mitsellideks) bakteriraku membraani fosfolipiidid ning denatureerib valgud. Naatriumhüdroksiid aga denatureerib DNA struktuurid. Lahus muutub"tatiseks" 6. Inkubeeri laua peal 3 minutit. Selle aja jooksul muutub lahus selgemaks. Juhul, kui inkubeerida üle 5 minuti, saad saagise hulka bakteri genoomseid järjestusi ning vähenab plasmiidse DNA hulk, mis korrektselt järgmises etapis renatureerub (puhastamise saagis väheneb!). 7. Pipeteeri peale 0,3 ml E3 lahust ja raputa segu kuni see on täiest ühtlane. Peaksid nägema helbeid, mitte valkjaid triipe lahuses. 8. Tsentrifuugi 10 min maksimumpööretel toatemperatuuril (RT) eppendorfi põhja tekkis purune sade, vähesel määral oli valgeid helbeid ka lahuse pinnal. 9
Alfa-komplimentaarsus 6. Too 1 selektiivse markeri näide, mida saaks kasutada plasmiidi sisaldava bakteri registreerimiseks/identsifitseerimiseks X-Gal värvib sinisteks rakud, mis ei sisalda huvipakkuva järjestuse, valged on need, mis sisaldavad huvipakkuva järjestuse. Põhineb alfa-komplimentaarsusel 7. Selgita mõistet ja milleks seda kasutatakse? Polycloning site faagi või plasmiidse vektori regioon, mis sisaldab mitu restriktsiooni saiti, mis on reeglina unikaalsed kogu vektori piires. Kasutatakse selleks, et oleks lihtsam vektorisse mingi järjestuse sisse viia. 8. Kuidas saab identsifitseerida/selekteerida baktereid rekombinantse plasmiidiga, kui plasmiidil on geenid, mis vastutavad nii ampitsilliini kui ka tetratsükliini
ensüüm, mis sünteesib ühe ahelalise ahela järgi. kahe ahelalise DNA koopia. Transgeene organism on GMO. Kasutatakse baktereid, viirusi, mille üheks põhiomaduseks on tungida peremeesrakkudesse ning pärmseeni, mis toituvad orgaanilisest ainest. Peale paljunevad nad väga kiiresti. GMO loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada mikro organismi DNA või RNAga. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geeni vektoriteks ehk siirdajateks. Vaatleme plasmiidse geenivektori saamist. Plasmiid on baketeris. See on DNA väike rõngas. 1) Restriktaas lõikab selles DNA lahti. 2) Sama restriktaasiga lõigatakse lõik inimese genoomist. Need ühinevad komplentaalselt. 3) Plasmiid ja DNA konstrukt segatakse kokku, kleepuvad otsad ühinevad. Nii saadakse lõppkokkuvõttes plasmiidne geenivektor, mis omakorda sisestatakse bakterorganismi. Tänu sellele tehnikale on võimalik luua DNA panku. Need osutuvad vajalikuks teaduslikel eesmärkidel
2. Western blot valguanalüüsimeetodil kasutatakse antikehasid spetsiifiliste valkude tuvastamiseks. Valguanalüüsi käigus tekib helendust mõõtev signaalsait valgu ja antikeha vahel. 52. Mis on roheline fluorestseeruv valk? Milleks ja kuidas seda kasutatakse? Fluorestseeruvad valgud on valgud, mis helendavad ultraviolettvalgusega valgustamisel. See on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. See toimib valgu markerina, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning sisseviidud DNA-valk saab seostuda just spetsiifilisse kohta rakus. Tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav. 53. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma? Vastavalt soovitud omadustele tuleb vastav geen DNA-s asendada või välja lõigata. Seejärel tehakse mikrsüst plasmiidset DNA-d rakku, mis on viljaststud, kuid mille kaks erinevat geneetilist informatsiooni pole veel ühinenud (pronucleus)
kraadi juures 16h. Tsentrifuugin bakterid põhja Eemaldan tuubist supernatandi. Re-suspendeerin bakterisademe E1 lahuses. Lisan E2 lahuse ja loksutan tuubi Inkubeerime 2 minutit, kuni lahus muutub selgemaks. Pipeteerime peale E3 lahuse ja raputame segu. Tsentrifuugin 5 minutit Tõstan supernatandi uude tuubi ja lisan sinne isopropanooli. Tsentrifuugin plasmiidse DNA 10 mini. Eemaldab supernatandi ja viskan selle ära. Pesen sadet etanoolidga. Suspendeerin 30 µl MQs. Mis juhtub erinevate biomolekulidega aluselises keskkonnas? Aluselise keskkonna loob E2 lahus. Selle tagajärjes bakteriraku membraani fosfolipiidid moodustavad mitsellid ja valgud denatureeruvad. NaOH denatureerib DNA kõrgemat järku struktuurid. Kuidas tagada, et välja puhastuks vaid meid huvitav plasmiidne DNA, mitte bakteri enda genoomne DNA
Kaltsiumfosfaadi meetod, DEAE dekstraan Füüsikalised meetodid. Mikroinjektsioon ja elektroporatsioon Membraanide fusioonid. Liposoomid, katioonsed lipiidid ja DNA kompleks lipofektsioon (DNA) konstrukti sisestamine viiruste abil. DNA viirused= näit. SV 40 (simian virus) pôhinevad vektorid · Mis on GFP, milliseid konkreetseid ekspresioonikonstrukte praktikumis kasutati? GFP-green fluoroescent protein, GFP võib funktsioneerida kui proteiin tag, ta viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis nähtav.Ekspressioonikonstruktid olid plasmiidid GFP järjestuse ja erinevate signaalidega, mille tõttu ekspresseerus GFP erinevates rakupiirkondades. PEI polüetüleenimiin pakib DNA kokku ja interakteerub membraaniga ja difundeerub
sama spetsiifikaga sekreteeritavaid antikehi. Iga B-rakk ja tema järglaskond (kloon) produtseerib täpselt ühesuguseid antikehi. 51. Mis on roheline fluorestseeruv valk, milleks ja kuidas seda kasutatakse? GFP (green fluoroescent proteiin), see on hea marker geeniekspressioonil ja valgu asukoha kindlaksmääramisel. Töö põhimõte seisneb selles, et GFP hakkab rohelise valguse käes helendama. GFP viiakse plasmiidse DNA sees rakku ning tänu temale seotud signaaljärjestusele, saab sisseviidud DNA-valk kompleks seostuda just spetsiifilisse kohta rakus, ning tänu fluoroessents-efektile on näha see spetsiifiline koht ka valgusmikroskoobis. 52. Kuidas konstrueerida üht transgeenset looma (Organismid, kelle genoomi on molekulaarsete meetoditega viidud võõr-DNA.)? Embrüonaalkloonimine- varase embrüo totipotentsed rakud (rakk, mis võib kasvada
järgi 15. Mikroobi genoom (tüüp, suurus muud omadused) Puudub tuum, kuid kromosoom siiski pakituna(nukleoidina), haploidne genoom, reeglina tsirkulaarne ( ka lineaarseid leitud), suurus 800kb-10Mb 16. Plasmiidid (omadused, klassifikatsioon, omadused) Ekstrakromosomaalsed geneetilised elemendid, 1-200kb suurused rõngasmolekulid, autonoomne replikatsioon, erineva koopiaarvuga. Võrreldes mikroobi kromosoomiga, sisaldavad unikaalset geneetilist infot. Plasmiidse DNA kodeeritav info tagab kiire kohastumisvõime erineates keskkonna tingimustes. Looduslikud tüved sisaldavad rohkem plasmiide, kuid laborikultuuris kaotavad plasmiidid, pole keskkonna selektiivset survet. Plasmiidi poolt kodeeritavad funktsioonid: AB. Resistentsus, virulentsus faktorid, bakteriotsiinid, biodegradatsiooni plasmiid mullabakteritel. 17. Geneetilise info ülekanne bakteritel (transformatsioon, konjugatsioon ja transduktsioon)
3. Genoomika suundumused ja probleemid. Post-genoomika e. modulaarne bioloogia: Genoomide tasemel - Molekulaarne fülogenees, võrdlev genoomika, käitumise genoomika, strukturaalne ning funktsionaalne genoomika ja proteoomika jne; Funktsionaalne genoomika oleks DNA järjestuses leiduva informatsiooni taandamine funktsioonile ehk struktuurilt funktsioonini; Metodoloogiliseks aluseks geneetilised meetodid; Genoom on erinevate DNA (RNA) molekulide (nukleaarse, mitokondriaalse, plastiidse, plasmiidse jne.) summa mingi kindla liigi rakku(de)s. Genoomide sekveneerimise ning bioinformaatika tulemused: Aheldatusgruppide leidmine, Genoomide ehituse võrdlused, Genoomse DNA, EST-de ja cDNA-de kombineerimine > valkude iseloomustamine, Geeniregulatsiooni alused, Evolutsiooni, ligitekke ja fülogeneesi alused, Liigisiseste genoomsete variatsioonide ja neist tulenevate erinevate fenotüüpide tuvastamine (HapMap). Viie peamise
järglastele päranduvad. Neil organismidel ilmneb uus, mõnele teisele liigile omane tunnus. Transgeensed mikroorganismid. Transgeensete organismide loomine põhineb rekombinantse DNA tehnoloogial. Siiratav geen tuleb ühendada niisugusesse DNA või RNA kompleksi, mis saab siseneda rakku ja integreeruda selle genoomi. Selliseid DNA konstrukte nimetatakse geenivektoriteks ehk –siirdajateks. (Plasmiidse geenivektori tegemine. Restriktaas lõikab plasmiidis DNA lahti kindla järjestuse kohalt. Sama restriktaasiga lõigatakse välja siiratavat geeni sisaldav DNA-fragment. Plasmiid ja DNA-fragment segatakse kokku, ”kleepuvad otsad” ühinevad. DNA ühendatakse ligaasiga töötlemisel.). Kuna niisama lihtsalt ei ole võimalik inimese geene bakteri plasmiidi sisestada, kasutatakse selleks ensüüm transkriptaasi. Eraldatakse huvipakkuvast geenis mRNA ja
2. Rakkudesse sisestatakse võõras normaalne geen (vektorite abiga). Ei kasutata koduloomadel, sest see meetod on kallis. Molekulaarsed meetodid arenevad kiiresti defektsete geenide leidmise jaoks ja see võimaldab teha valikuid aretuses, et vältida pärilikke haigusi. Geenitestid on odavamad kui geeniteraapia. 63. Uute geenide organismi viimise meetodid * viirusvektoritega (vaktsiiniaviiruse). * plasmiidse DNA abil 14. 64. Millised on põhiprintsiibid, millest peaks lähtuma multifaktoriaalsete lävitunnuseliste haiguste tõrjel geneetiliste meetoditega? 1. Mida raskem on isendi defekt, seda sagedasem ja tugevam on defekt ka järglastel – selle alusel tuleks vastavalt raskusastmele võimalikult paljud isendeid välja praakida, alustades nendest, kellel defekt on kõige raskem. 2
bioloogilise funktsiooniga struktuurides, kus voltumine või assambleerumine on juba toimunud. 8. Ti-plasmiidid, geenide ülekanne taimedel Ti-plasmiid (ingl. Ti plasmid)- Agrobacterium tumefaciens´i ja A. rhizogenes´i suur rõngasplasmiid, mis põhjustab taimedel kalluskasvajate (haiguste) induktsiooni ning mis on tähtsaks vektoriks geenide ülekandel (eriti kahekojalistesse) taimedesse. Plasmiidse DNA Agrobacterium’i vahendatud ülekanne vigastatud taime. Ti-plasmiidi kandev Agrobacterium meelitatakse atsetosüringooni abil (toodetakse vigastatud taime poolt) vigastuskohta. Endonukleaasi toimel lõigatakse Ti-plasmiidist välja üksikahelaline T-DNA, seotakse kaitsvate valkudega ja transporditakse taimerakku konjugatsioonisarnasel meetodil. T-DNA siseneb taimeraku tuuma, kus ta integreerub taime
abistada oriT äratundmist ja relaksosoomi moodustumist. Relaksosoom koosneb: plasmiidilt kodeeritud relaksaasist, plasmiidilt kodeeritud abivalkudest, plasmiidsest oriT-st ning kromosoomilt kodeeritud IHF-st. Relaksosoomi moodustumise järel seotakse kompleks VirD4-le, mis esitleb kompleksi T4SS-le. VirD4-ga seondumine on substraadi valikul määrava tähtsusega. Plasmiidsel süsteemil R388 seondub VirD4-ga TrwC ja abivalk TrwA, samas F/R1 plasmiidse süsteemi korral toimub seondumine abivalgu TraM vahendusel. Lisaks on näidatud, et R388 relaksaas TrwC võib seonduda VirD4-ga DNA-st sõltumata. TrwC-l paikneb translokatsiooni signaaljärjestus valgu keskel, mis on transporditavate valkude seas haruldane, sest üldiselt paikneb signaaljärjestus kas N- või C-terminuses. F/R1-tüüpi ja R388-tüüpi konjugatsiooni relaksosoome on enim uuritud. Relaksaasid on suured valgud, mil pea kõikidel on fosfodiesteraasne
annaabi.ee 
